天然免疫中重要的一环是模式识别受体PRRs(Pattern recongition receptors)对病原微生物模式相关分子PAMPs(Pathogen-associated molecular patterns)的识别[1]. Toll样受体(Toll-like receptor, TLRs)是重要的膜受体，可识别病原微生物中保守的PAMPs，并与细胞内一些接头分子如Myd88(Myeloid differentiation factor 88)或TRIF(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β)相结合启动信号的快速传导，最终诱导NF-κB、干扰素及IRF等产生，引起机体的炎症反应和抗病毒反应[2-4].TRIF又名TICAM-1(TIR-domain-containing molecule 1)，是一种包含TIR结构域且诱导β干扰素的Toll样/(白细胞介素1)接头分子[5].诱导β干扰素的TIR结构域衔接蛋白联接的信号通路被称为TRIF依赖途径[6].哺乳动物的TRIF基因由N端区域、TIR结构域和C端区域组成，其N端区域与肿瘤坏死因子受体相关因子(Tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)家族蛋白结合激活酶TBK1(TANK-binding kinase-1)，在激活IFN-β中发挥重要作用[7-8].而TIR结构域则包含3个相对保守的细胞内信号转导结构域(BOX 1-3)，可介导受体和信号转导TIR结构域的蛋白相互作用[9].TRIF的C端区域招募受体蛋白1，诱导NF-κB活化[10].鱼类中，TRIF基因已经在蓝鲶(Ictalurus punctatus)、斑马鱼(Danio rerio)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)、草鱼(Ctenopharyngodon idella)等中被克隆及鉴定，且研究结果表明TRIF基因参与抗病免疫应答反应[11-14].TLR3和TLR22基因识别双链RNA病毒后刺激巨噬细胞后可触发TRIF基因信号通路的转导，并激活MAP激酶、NF-κB和干扰素调节因子7/3，最终诱导炎性细胞因子和I型干扰素因子IFNS产生[15-16].

根据小学生学习方法形成的特点，教师必须教给学生科学的、切实可行的自学方法，让学生模仿、实践，强化训练，日积月累，以期提高自身的自学能力，养成良好的自学习惯。以下我就阅读一篇文章，列举几项自学方法；

赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)属硬骨鱼纲、鲤形目、鲤科、雅罗鱼亚科，是优质淡水养殖鱼类之一[17].已有研究报道赤眼鳟抵御GCRV(Grass carp reovirus)入侵的能力优于草鱼[18].本研究以赤眼鳟为研究对象，克隆ScTRIF基因的cDNA序列全长，探讨该基因在赤眼鳟中的组织表达规律及经GCRV感染后的表达水平变化，为进一步深入研究TRIF基因参与抗病毒的免疫功能提供基础，并为抗病草鱼的分子选育提供基因资源.

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验共用94尾6月龄赤眼鳟，购于浏阳市北盛镇乌龙渔场，其体长均值为9.40±0.75 cm，体质量均值为13.50±1.35 g.实验前将赤眼鳟于80 L/箱的恒温水循环养殖系统中28 ℃暂养1个月，每天定时光照12 h；按实验鱼体质量的1%投喂.攻毒用GCRV由中国水产科学研究院长江水产研究所曾令兵研究员惠赠.

要你画个屁！常爱兰一把从驮子手里夺过这些画，撕了个粉碎，你这个不知羞耻的孩子，你这个天杀的，什么不好学，偏偏把不好的东西全学来了，你这个畜牲！！

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成 选取一尾健康赤眼鳟，参考TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction(TaKaRa,China)试剂盒说明书提取总RNA.按照SMARTer© RACE 5′/3′cDNA Kit Components(Clontech,USA)试剂盒说明书分别合成5′RACE cDNA和3′RACE cDNA.

基于已获得且经比对确认为TRIF基因中间序列，利用Oligo 7软件分别设计RACE扩增用外引物TRIF3′-outer和TRIF5′-outer以及内引物TRIF3′-inner和TRIF5′-inner (表1).分别以5′RACE cDNA 和3′RACE cDNA作为模板作PCR扩增基因两端的全长序列.使用TRIF5′-outer和TRIF3′-outer外引物PCR的扩增反应条件为94 ℃ 30 s；72 ℃ 90 s，5个循环；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，5个循环；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72℃ 90 s，25个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存.产物稀释50倍后用于相应的RACE内引物扩增巢式 PCR.反应条件为94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，25个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃保存.目的片段经纯化后连接pGEM-T easy载体，转菌落后送测序.

1.2.2 ScTRIF基因cDNA全长克隆 参考GenBank中已公布鲤科鱼类的TRIF cDNA保守序列，使用primer 6.0设计一对PCR引物TRIF F和TRIF R(表1)，以上述合成的cDNA第一链为模板扩增TRIF cDNA中间序列.PCR反应体系为cDNA 1 μL，2×Easy Taq PCR SuperMix 25 μL，引物TRIF F与TRIF R各1 μL和22 μL的Mili-Q水.PCR扩增程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s共30个循环；72 ℃ 延伸5 min.PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，采用Gel Extraction Kit(Omega Bio-Tek,USA)切胶回收，产物连接至pGEM-T easy载体(Promega,北京)转菌落检测后送武汉奥科鼎盛生物科技有限公司测序.

 

表1 引物序列

 

Tab. 1 Oligo nucleotide primers

  

引物引物序列5 '-3 '用途TRIF FCTAACAGCGACAGCAGCATTGG扩增TRIF中间序列TRIF RGTGAGCAGCAGCAGTGTGAAC扩增TRIF中间序列TRIF3'-outerATCCTCCACGAAGCAGAAGACGCGGATGRACE PCRTRIF5'-outerATTTGTCGAGTGACTGACTTCCGCTGTRACE PCRTRIF3'-innerAGACCGCAAAGGAAGCTCCCAAGTTGTRACE PCRTRIF5'-innerATTTGTCGAGTGACTGACTTCCGCTGTRACE PCRTRIF-RTFTCGAGGAGGAAGGCTGGCACTT荧光定量PCRTRIF-RTRTGAGCGTGAAGCAGACAGCAGC荧光定量PCRβ-actin FGCTATGTGGCTCTTGACTTCG荧光定量PCRβ-actin RGGGCACCTGAACCTCTCATT荧光定量PCR

对赤眼鳟不同组织中ScTRIF基因的实时荧光定量表达检测结果显示，其在肝、脾、肾、头肾、脑、前肠、中肠、后肠、皮肤、肌肉、鳍条、鳃组织中均有表达(图4).其中鳃中ScTRIF的表达水平最高；前肠和后肠、脾脏、肝脏、中肠、体肾、头肾、鳍条等表达量次之；脑组织表达水平最低.

不同物种TRIF基因TIR结构域的氨基酸序列同源性比对结果显示：物种间分子的该结构域存在多个氨基酸保守位点(图2)，如保守区域Box1(YN/A)，Box2(EDFQVPG)和Box3(IFAR)[19]，参与比对的哺乳类TRIF基因TIR结构域Box1，2，3完全一致，与鱼类保守区域存在8个位点的差异，同属于鲤科亚罗鱼亚科的赤眼鳟与草鱼的3个保守区域完全一致,但是存在个别不同的位点差异(455a).将不同物种TRIF氨基酸序列做聚类分析，结果如图3所示，整个系统发育树分为两支：硬骨鱼类聚为一支，鸟类和哺乳动物另聚为一大支.硬骨鱼类中，淡水硬骨鱼类(如草鱼、鲤鱼等) 和海水硬骨鱼类(如东方红鳍豚、底鳉) 各为一支，其中同属亚罗鱼亚科的淡水硬骨鱼类赤眼鳟和草鱼关系最近，聚为一支.

1.2.5 GCRV病毒感染后ScTRIF的表达特征分析 GCRV攻毒实验设3个重复，每个重复30 尾赤眼鳟.腹腔注射GCRV病毒悬液200 μL/尾.攻毒后分别在0，6，12，24，48，72，96和120 h时间点采样.从3个实验箱随机选取3尾，取头肾和脾脏提取总RNA，合成第一链cDNA，以β-actin作为参考基因，使用SYBR Green I染液在CFX96荧光定量PCR仪( Bio-Rad,USA)进行定量分析.反应体系、程序、数据分析均同上.

2 结果分析

2.1 ScTRIF基因cDNA全长克隆和序列分析

经RACE PCR扩增所得ScTRIF基因cDNA全长为2 263 bp(GenBank登录号为KU870671)，包括5′端非编码区域(Untranslated region,UTR)102 bp，开放阅读框1 677 bp和3′端UTR 484 bp，共编码559个氨基酸.其3′UTR包含1个多聚腺苷酸加尾信号“aataaa”和PloyA序列.推导的蛋白质相对分子质量为62 700，理论等电点为6.14. SMART结构域预测结果显示，ScTRIF含有一个潜在TIR结构域(TIR,310-445aa)(图1).

感染GCRV后，ScTRIF在免疫组织(脾脏和头肾)中的表达水平总体上均表现为先下降后上调的趋势.人工感染GCRV初期(0-6 h)，脾脏和头肾组织中ScTRIF的表达量均先下降.该基因在头肾中于12 h上调达到最高值，其相对表达水平为0.344 2±0.023 0，显著高于0 h的表达量0.121 6±0.022 9 (P<0.05)；随后于24-72 h表达下调，96 h再次上调.而ScTRIF在脾脏中感病后12 h开始上调表达，24-72 h逐步下调表达，96 h上调达到表达量的峰值(0.650 3±0.042 0)，显著高于 0 h的表达量(0.171 5±0.007 7)(P<0.05)；最后于120 h表达下调(图5).

  

注：起始密码子(ATG)、终止密码子(TAA)用黑色加粗字体标记，多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)加粗斜体显示；TIR结构域(310-455 aa)用下划横线标记图1 赤眼鳟TRIF基因cDNA序列和推理的氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of ScTRIF

2.2 TRIF的结构域对比及进化树分析

1.2.4 ScTRIF的组织表达谱分析 随机选择3尾健康赤眼鳟，分别提取肝、脾、肾、头肾、脑、前肠、中肠、后肠、皮肤、肌肉、鳍条、鳃组织RNA.使用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis(Fermentas,USA)试剂盒合成第一链cDNA后做荧光定量PCR.选用β-actin作为参考基因，其扩增引物为β-actin F和β-actin R(表1).荧光定量反应体系为：10 μL SYBR Green PCR master mix(CWBIO, China)，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，9.2 μL加水稀释20倍后的cDNA模板.反应程序为95 ℃ 10 min；95 ℃ 10s，60 ℃ 10s，72 ℃ 15 s，共35个循环.溶解曲线程序为从65 ℃升温至95 ℃，每5 s增加0.5 ℃.数据收集和分析均使用CFX manager software 3.1(Bio-Rad,USA)，使用GraphPad Prism 6软件作图.

  

图2 不同物种TRIF的氨基酸序列对比(方框标示了3个保守基序)Fig. 2 Multiple alignment of TRIF-TIR domains from different species (three conserved boxes were indicated by box)

  

图3 鱼类TRIF系统发育树(ScTRIF加粗标示)Fig. 3 Phylogenetic relationship of fish TRIF proteins (bold font letters show theTRIF of S. curriculus)

2.3 ScTRIF的组织表达水平

  

图4 赤眼鳟健康组织TRIF的相对表达量Fig. 4 Relative expressionlevels of ScTRIF in different healthy tissues of Squaliobarbus curriculus

1.2.3 生物信息学分析 利用SeqMan 7.1软件拼接获得TRIF基因全长cDNA序列；利用ExPASy-Translate tool(http://web.expasy.org/translate/)预测其开放阅读框，并推导编码的氨基酸序列.用在线软件ExPASy-Compute pI/Mw tool(http://web.expasy.org/compute_pi/)计算相对分子质量和理论等电点.在NCBI数据库中进行序列相似性比较；利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)进行结构域预测.用ClustalX和MEGA 6.0软件进行多序列比对和系统进化树构建.用于构建系统进化树的物种包括人(AAH09860.2)、小鼠(AAH33406.1)、猕猴(AAS20428.1)、黑猩猩(NP_001123604.1)、牛(NP_001025472.1)、原鸡(ABK20148.1)、原鸽(EMC88895.1)、底鳉(XP_012714371.1)、蓝鲶(ABD93874.1)、红鳍东方鲀(NP_001106665.1)、点带石斑鱼(AEX01719.1)、斑马鱼(NP 001038224.1)、鲤鱼(KTF82518.1)、草鱼(AGW25589.1)和赤眼鳟(KU870671.1).

2.4 感染GCRV后ScTRIF的表达响应

为了检测本文设定的基于河道行洪能力复核的防洪工程施工技术模型的评估效果，与传统防洪工程施工技术模型进行了对比。

  

图5 GCRV感染后TRIF在赤眼鳟脾脏和头肾中表达水平变化Fig. 5 Expression levels change of TRIF inspleen and head kidney of Squaliobarbus curriculus after GCRV infection

3 讨论

惠生工程凭借着自身在资源统筹和管理、模块化建造和整体运输方面的综合实力，基于项目进度要求及业主现场条件限制，在此项目上采用了工厂模块化预制、组装和整体交付的方式，颠覆了以往大型化工项目因分片运输和现场安装而耗费大量时间及人力但难以确保质量和安全的传统模式。惠生工程作为总承包方，与惠生海工强强联合、优势互补，最终成功制定并实施了9台模块的建造和运输方案。项目从2017年7月启动，2018年3月完成首台模块发运，2018年10月底完成全部9台模块发运，期间克服了台风和潮汐等诸多挑战，为浙江石化一期项目的投产打下坚实基础。

目前，TRIF基因只在少数鱼类中被鉴定及克隆[11-14].相关研究显示识别双链RNA病毒的TLR3和TLR22基因通过TRIF依赖信号转导通路向下游传递信号[20].本研究采用RACE技术获得了ScTRIF基因序列并分析了其结构特征，并检测了GCRV病毒感染后ScTRIF基因的表达响应模式，为理解TRIF基因在赤眼鳟抗GCRV的免疫应答中的可能功能提供了材料.

1.1 一般资料 选取自2015年4月至2018年4月大连大学附属中山医院收治的68例重度股骨粗隆间骨折[3]患者为研究对象。根据麻醉方法的不同分为A组和B组，每组各34例患者。A组：男性18例，女性16例；年龄51～72岁，平均年龄(65.23±2.56)岁；受伤至入院时间2～10 h，平均(4.98±0.45)h。B组：男性20例，女性14例；年龄50～70岁，平均年龄(63.98±2.93)岁；受伤至入院时间3～9 h，平均(5.11±0.41)h。两组患者的一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。具有可比性。患者家属均签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会批准。

TRIF的序列保守性在已知的抗病毒免疫相关受体分子中是最低的[21].该研究发现ScTRIF氨基酸序列和草鱼的相似性最高，同源性达93%.赤眼鳟TRIF具有典型的 TIR 结构域，多序列比对发现该结构域包含3个保守区域：box 1，2和3.其中box2中保守的脯氨酸(Pro)对于人的TRIF和Myd88基因所介导的信号传导是必须的[22]，当该位点突变后，TRIF基因不能参与信号传导通路中上调干扰素的表达[23].同属于亚罗鱼亚科的赤眼鳟和草鱼对GCRV抗性差异大，免疫相关基因的序列差异可能是造成这两种鱼抗性差异的分子基础.虽然结果表明两种鱼序列同源性高达93%，但关键结构域(如TIR结构域)的氨基酸残基差异可能会影响其分子免疫功能，是抗性差异形成的可能原因.

鱼类中TRIF的mRNA在不同组织中呈差异表达.如蓝鲶TRIF基因在卵巢和血液中表达量最高，肾脏中最低[11].斑马鱼TRIF基因表达量在肝脏中最高，而肾脏中最低[12].草鱼中该基因表达量在前肠和皮肤中最高，而肌肉中最低[14].本研究中ScTRIF在被检测的12个组织中均有表达，其中鳃的表达量最高，其次是前肠，赤眼鳟组织间表达量的差异可能与组织免疫功能的差异相关.真骨鱼类粘膜相关淋巴组织包括鳃、肠道、皮肤，这些组织是鱼体感染时最先接触病原的部位[24].组织中分布着各种免疫细胞，局部的免疫应答对病原体的抵御非常重要[24]，TRIF在鳃、皮肤和肠中大量表达，预示着这些组织可能是TRIF基因参与天然免疫的主效部位.

大量诱导表达实验表明，TRIF在抵抗病原微生物的先天性免疫反应中发挥重要作用.本研究中赤眼鳟感染GCRV后，在6 h内脾脏和头肾的mRNA 表达水平均下降，而6 h后大幅度上调.这一表达变化趋势与草鱼感染GCRV后TRIF基因在头肾组织表达变化规律相似[14].亦与斑马鱼[12]经注射肽聚糖(Peptidoglycan,PGN)后TRIF基因的表达情况相似，即嗜水气单胞菌和斑点叉尾鮰呼肠孤病毒感染斑点叉尾鮰后脾脏中该基因先表达下调后上升[25].病毒感染初期，依赖MyD88信号转导途径的TLR家族成员如TLR2和TLR4先识别病毒[26]，随后TLRs基因通过TRIF信号转导通路向下游传递信号[27-28].赤眼鳟组织中TRIF基因表达下调的可能原因是病毒为逃避宿主先天免疫防御的作用效果.随后TRIF基因表达水平上调，以诱导干扰素表达来抵抗GCRV入侵.赤眼鳟TRIF基因表达的具体调节机制尚待深入研究.

4 结论

本研究克隆获得了赤眼鳟TRIF基因的cDNA全长，并对其分子结构和表达特性作了分析，发现赤眼鳟TRIF基因具有典型的TIR结构域，且在鳃和肠组织中的表达量最高.感染GCRV后，ScTRIF在脾脏和头肾中的表达水平总体上呈先下降后上调趋势，提示TRIF基因参与赤眼鳟抗病免疫反应.

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