乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，2017年中国国家癌症中心发布的最新癌症数据显示，乳腺癌已成为中国城市女性发病率位居首位的癌症［1］。环境雌激素（environmental estrogens，EEs）又称内分泌干扰物（endocrine disrupting chemicals，EDCs），是一类影响生物内环境稳态、干扰正常生长发育的外源性物质［2］。流行病学研究显示，金属镉是环境内分泌干扰物，长期接触会增加乳腺癌发病风险［3］。VAN MAELE-FABRY等［4］的Meta分析结果表明饮食中的镉暴露可提高绝经后妇女乳腺癌的发病风险。LIU等［5］的研究证明长期低剂量环境镉暴露是乳腺癌的危险因素。

SOTO等［6］于1995年建立了通过人乳腺癌MCF-7细胞增殖来检测外源性雌激素的方法（即E-screen法），其基本原理是人血清中存在能特异性抑制雌激素敏感细胞增殖的物质Estrocolyone-1，外源性雌激素可以中和该物质，从而诱导细胞增殖。通过雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性的人乳腺癌MCF-7细胞增殖，侧面反映外源性物质的雌激素样作用。他发现不同来源的人乳腺癌细胞MCF-7亚株对雌激素的敏感性不同，细胞表面ER含量为（3~122）×10-12 mol/g不等。RASMUSSEN等［7］进一步完善SOTO的实验方案后，发现MCF-7细胞亚株、药物作用时间、细胞种板浓度等因素都会影响细胞对雌激素的敏感性。常艳［8］发现其实验所用不同来源的四株MCF-7细胞对雌激素敏感性不同，并使用E-screen方法检测了硫丹等化合物的雌激素样作用。

本实验以ER阳性的人乳腺癌细胞MCF-7为研究对象，通过体外实验研究镉对其细胞增殖、细胞周期和ER蛋白表达水平的改变，并加入ER抑制剂进行处理，探讨镉对人乳腺癌细胞增殖的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

生物安全柜（Esco，新加坡），奥林巴斯倒置显微镜（Olympus CKx41，日本），流式细胞仪（Becton Dickinson，美国），低温高速离心机（Sorvall，美国），蛋白电泳槽及湿转转膜仪（Bio-Rad，美国），培养瓶、96孔板、6孔板等耗材（Corning，美国）。镉标准品（北京环标科创环境科技发展有限责任公司，中国），17β-雌二醇（Sigma，美国），ER抑制剂ICI182780（Sigma，美国），DMEM培养液（Gibco，美国），无酚红DMEM培养液（Gibco，美国），胎牛血清（Gibco，美国），活性炭处理胎牛血清（Biological Industries，以色列），ER兔抗人单克隆抗体、β-actin鼠抗人单克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，中国）。

那有什么？总不能见人就解释你不姓瞿，姓翟？反正姓名也就是个代号。楠楠，你也别难过，把你送给杨小水，我们根本就没想再要回来。别说未婚生孩子，就是未婚同居在那个年代也是一件大事，哪敢让人知道？你妈结婚后，发现自己不能再生了，才又想办法把你要了回来。杨小水多次找人打听你，我们放出话，说你在上海当律师。你也知道，乡下人事儿多，我们当时是怕她以后纠缠不清。上海那么大，他们就是知道你在那儿也找不到，自然就会断了找你的念头。

1.2 细胞培养

使用含体积分数10%胎牛血清、质量分数1%双抗的高糖DMEM培养液，在37℃、体积分数为5%的CO2培养箱内进行常规培养。实验前一周更换为含10%活性炭处理胎牛血清、1%双抗的高糖无酚红DMEM培养液培养（简称去雌激素培养液），传代使用无酚红胰酶消化液进行消化，以充分去除细胞内源性激素的影响。

1.3 MCF-7细胞对雌激素敏感性筛选

实验数据均为计量资料，采用±s表示。应用SPSS 22.0软件，组间差异采用单因素方差分析，组间多重比较时方差齐者使用LSD法，方差不齐者校正后使用Dunnett’s法。应用Mod Fit软件进行细胞周期拟合分析，Image J软件对电泳条带进行灰度分析。Graphpad prism 5作图。检验水准α=0.05。

1.4 不同浓度镉对MCF-7细胞增殖的影响

根据实验结果，确定实验所用B株MCF-7细胞为雌激素敏感细胞。以5×103/孔细胞密度将B株细胞接种于96孔板。细胞贴壁后分别加入1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9、1×10-10、1×10-11 mol/L的镉溶液，阴性对照组为去雌激素培养液，每组设5个复孔。增殖率计算同1.3。确定镉促进细胞增殖的最大浓度进行后续实验。

1.5 克隆形成实验检测镉对MCF-7细胞集落形成能力的影响

根据实验结果，设阴性对照组（去雌激素培养液）、实验组（1×10-8 mol/L镉）、实验抑制剂组（1×10-8 mol/L镉+1×10-7 mol/L ER抑制剂）、阳性对照组（1×10-9 mol/L雌激素）、阳性抑制剂组（1×10-9 mol/L雌激素+1×10-7 mol/L ER抑制剂）。以5×103/孔细胞密度将B株MCF-7细胞接种于96孔板，每组设5个复孔。细胞增殖率计算同1.3。

1.6 ER抑制剂ICI182780对镉致细胞增殖的作用

设阴性对照组为去雌激素培养液，实验组为1×10-8 mol/L镉溶液，阳性对照组为1×10-9 mol/L雌激素。以400/孔密度将B株MCF-7细胞接种于6孔板，每组设三个复孔。药物处理24 h后，换成去雌激素培养液继续培养。当出现肉眼可见克隆集落（细胞团细胞数量>50）时终止培养。使用甲醇-乙酸混合液（体积比为1∶3）固定，结晶紫染色。克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%。

1.7 流式细胞术检测MCF-7细胞周期

以3×105/孔细胞密度将B株MCF-7细胞接种于6孔板，处理分组同1.6，每组设3个复孔。4 d后终止培养。70%乙醇-20℃预先冷却，4℃保存。收集细胞，使用乙醇固定，PI避光染色，流式细胞仪检测周期。

1.8 Western blot检测ER蛋白表达

细胞处理分组同1.6。4 d后冰上裂解蛋白，SDSPAGE电泳分离后转至PVDF膜。常温封闭，一抗4℃孵育过夜，二抗室温摇晃孵育1 h，ECL发光法测ER蛋白表达，内参蛋白为β-actin。

1.9 统计学分析

参考SOTO、RASMUSSEN等［6-7］的试验设计及前期实验结果，以5×103/孔细胞密度接种不同来源的两株MCF-7细胞，即A株（来源于山东省肿瘤医院基础实验室）、B株（购自上海中国科学院典藏培养物保藏委员会细胞库）。待细胞贴壁后，分别加入1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9、1×10-10、1×10-11 mol/L 17β-雌二醇（后称雌激素），阴性对照组使用去雌激素培养液，每组浓度设5个复孔。4 d后加入CCK8溶液孵育2 h，酶标仪450 nm波长条件下检测光密度值D。增殖率（proliferation rate，PR）=（D实验组-D空白组）/（D阴性对照组-D空白组）×100%。选取敏感细胞株，并确定雌激素促进细胞增殖作用最大的浓度，以便进行后续实验。

与阴性对照组（增殖率为100%）相比，仅1×10-8、1×10-9、1×10-10 mol/L镉溶液处理4 d，可以促进B株雌激素敏感人乳腺癌细胞的增殖［增殖率分别为（175.73±29.55）%、（176.88±10.06）%、（163.78±31.90）%］，差异有统计学意义（P < 0.001），1×10-8、1×10-9、1×10-10 mol/L三组浓度间差异无统计学意义（P > 0.05）。设定后续镉染毒剂量为1×10-8 mol/L。

2 结果

2.1 MCF-7细胞对雌激素的敏感性

由表1可见，雌激素对A株MCF-7细胞没有增殖促进作用（均P > 0.05），对B株MCF-7细胞有增殖促进作用，且当雌激素浓度在1×10-9 mol/L时，对细胞的促进增殖作用最大，差异有统计学意义（P < 0.001）。

流式细胞术结果见图2，可见长期处于去雌激素环境（阴性对照组）的MCF-7细胞增殖缓慢，80%以上的细胞处于G0/G1期。与阴性对照组［（9.76±1.37）%］相比，实验组和阳性对照组细胞S期比例分别为（24.17±0.53）%、（28.30±2.34）%，差异有统计学意义（均P < 0.001）。实验抑制剂组和阳性抑制剂组S期比例分别为（12.36±0.43）%、（14.95±0.50）%，与相应未使用ER抑制剂组相比，S期比例降低，ER抑制剂可以抑制镉、雌激素对细胞周期的促进作用（均P < 0.001）。

2.2 确定镉诱导MCF-7增殖的浓度

还是乔三喜做饭。李大头说，我们的工作累，苦，甚至有一定危险性。乔三喜小，室外的活，尽量不让他干。这话使我对李大头有了敬意，觉得他有爱心。吴国栋却往歪处想，他小声问乔三喜：昨夜李大头是不是把你睡了？乔三喜没有回答。他望着吴国栋，很茫然，似乎不知道他在说什么。我说，你莫瞎扯，他又不是女伢！吴国栋没有直接回答我，只淫邪地笑。

所有数据应用SPSS 17.0进行统计学分析，计数资料以频数及百分率表示，组间比较采用χ2检验，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

 

表1 不同浓度雌激素对不同来源MCF-7细胞的增殖率影响（±s，n=5，%）

  

［注］*：与阴性对照组（即0 mol/L组）相比，P < 0.001。A株来源于山东省肿瘤医院基础实验室，B株购自上海中国科学院典藏培养物保藏委员会细胞库。

 

细胞株 0 mol/L 1×10-6 mol/L 1×10-7 mol/L 1×10-8 mol/L 1×10-9 mol/L 1×10-10 mol/L 1×10-11 mol/L A株 100 91.50±15.48 100.72±20.19 103.62±4.08 102.76±17.03 105.26±21.65 101.23±14.72 B株 100 72.66±10.33 86.52±10.48 118.98±8.4 203.55±36.65* 163.510±13.40* 119.87±26.12

2.3 镉对人乳腺癌MCF-7细胞集落形成的影响

与阴性对照组相比，实验组［（135.17±23.96）%］、阳性对照组［（155.36±12.10）%］的MCF-7细胞增殖率增加（均P < 0.001）。ER抑制剂可以降低镉、雌激素对细胞增殖的促进作用［实验抑制剂组（107.66±7.64）%、阳性抑制剂组（111.10±1.60）%］，与相应的未使用抑制剂组比较，差异有统计学意义（均P < 0.01）。

“除法”途径中，分数被视为方程中的乘法逆元，最终以一个与整数地位相同的数为人们所接纳,而“集合论”途径中，分数被定义为二元数集的形式.这两种途径下的分数定义，均以独立的数的形式存在，在数系扩充的过程中，代表着整数系向有理数系的扩充发展，而导致这个结果的本质在于人们对于数的认识发生了质的改变.

  

图1 镉染毒对MCF-7细胞集落形成的影响

 

［注］A：阴性对照组，去雌激素培养液；B：实验组，1×10-8 mol/L镉溶液；C：阳性对照组，1×10-9 mol/L雌激素。

2.4 ER抑制剂对镉促MCF-7细胞增殖的影响

克隆形成实验结果如图1所示，可见与阴性对照组［（73±6）个集落］相比，实验组［（92±4）个集落］和阳性对照组［（113±9）个集落］的细胞克隆形成数增加，实验组集落形成数量约为阴性对照组的126%，即镉可促进细胞克隆形成（P < 0.05），但促进增殖能力略弱于雌激素（P < 0.01）。

2.5 ER抑制剂对镉诱导MCF-7细胞S期比例的影响

除凯利板业外，总投资达32亿元的荆门万华生态家居有限公司一期投资8亿元引进了德国生态秸秆板生产线设备。该生产线是全球最大零甲醛秸秆板连续压机生产线，“首板”已于8月成功下线，可年产25万立方米秸秆生态板。二期投资2亿元建设的年产800万平方米贴面板生产线将于年底完成。目前，这两家板材企业已成为东宝区绿色建材家居产业的龙头企业。

2.6 ER抑制剂对镉诱导ER蛋白表达的影响

Western blot检测各组细胞ER蛋白表达结果如图3A所示，灰度分析见图3B。与阴性对照组［（21.47±3.80）%］相比，实验组和阳性对照组ER相对表达水平分别为（56.19±3.67）%、（54.21±9.59）%，ER表达水平增加（均P < 0.01）。实验抑制剂组和阳性抑制剂组ER相对表达水平分别为（38.84±1.04）%、（35.11±8.23）%，使用ER抑制剂可以减弱镉、雌激素促ER表达的作用（均P < 0.05）。

  

图2 镉染毒对MCF-7细胞周期的影响

 

［注］1：阴性对照组（去雌激素培养液）；2：实验组（1×10-8 mol/L镉溶液）；3：实验抑制剂组（1×10-8 mol/L镉溶液+1×10-7 mol/L ER抑制剂）；4：阳性对照组（1×10-9 mol/L雌激素）；5：阳性抑制剂组（1×10-9 mol/L雌激素+1×10-7 mol/L ER抑制剂）。

  

图3 镉染毒对雌激素受体蛋白表达的影响

 

［注］1：阴性对照组（去雌激素培养液）；2：实验组（1×10-8 mol/L镉溶液）；3：实验抑制剂组（1×10-8 mol/L镉溶液+1×10-7 mol/L ER抑制剂）；4：阳性对照组（1×10-9 mol/L雌激素）；5：阳性抑制剂组（1×10-9 mol/L雌激素+1×10-7 mol/L ER抑制剂）。*：与阴性对照组相比，P < 0.01；#：与对应未加抑制剂组相比，P < 0.05。

3 讨论

本研究对不同来源的人乳腺癌MCF-7细胞进行了筛选，确认了雌激素敏感的MCF-7细胞亚株，并发现当雌激素浓度为1×10-9 mol/L时，对MCF-7细胞的促进增殖作用最大。长期处于去雌激素环境下的MCF-7细胞，细胞形态变圆，贴壁能力变弱。不同来源的MCF-7细胞对雌激素敏感的程度不一样，因此在使用MCF-7细胞增殖法判断外源性物质雌激素作用时，必须首先说明所用细胞对雌激素的敏感性。

既往学者主要使用去卵巢大鼠子宫增重法（例如王思华等［9］）研究外源化合物的雌激素作用，基于细胞角度进行研究的文献较少且多仅局限于现象观察，缺乏对具体机制的探讨［10-11］。本次研究使用E-screen法检测镉的类雌激素样作用，发现1×10-8~1×10-10 mol/L镉处理4 d可以促进MCF-7细胞增殖。这与徐孝娜等［12］的研究结果相似。她们发现1×10-9 mol/L镉处理72 h对MCF-7细胞的促增殖作用最明显，但是未说明实验所用细胞对雌激素的敏感程度，机制方面未分析镉对细胞周期的影响。本实验对此进行了完善和补充，发现1×10-8 mol/L镉处理4 d可以促进MCF-7细胞DNA复制，S期比例增加。这与张光明等［13］的实验结果相似，但张光明等的实验未加入ER抑制剂，实验前未使用去雌激素环境培养，不足以说明镉促进细胞周期是通过雌激素样作用。

在美国的体制下，国家立法机关、行政机关以及司法机关等公共机构有其各自的能力范围。在管理人工智能方面，没有哪一个机构具有垄断地位，需要不同机构发挥各自职能，相互协调配合，以取得更好效果[24] 。

本研究还发现，1×10-8 mol/L镉处理4 d可以增高MCF-7细胞中的ER蛋白表达。这一结果与阳性对照组相似，但相对增殖率仅为后者的81%，说明它可能是部分ER激动剂。这种促进增殖作用可以被ER抑制剂阻断，说明ER在其中起着关键作用。SIEWIT等［14］的实验证明了镉能够刺激ER活化，可以增加ER与c-jun之间的相互作用，但是遗憾的是该实验缺少对细胞雌激素敏感性的分析，并且缺少抑制剂的对照实验，不足以说明镉促进细胞增殖是通过雌激素样作用。

综上所述，本实验从体外实验角度证明了镉可以通过发挥类雌激素样作用，促进MCF-7的增殖，促进细胞DNA复制，S期比例增加，促进ER蛋白表达，这种促进作用可以被ER抑制剂阻断，表明镉可能具有类雌激素样作用，机制可能与其促进细胞周期及增加ER蛋白表达水平有关。

参考文献

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［5］LIU R，NELSON D O，HURLEY S，et al. Residential exposure to estrogen disrupting hazardous air pollutants and breast cancer risk：the California Teachers Study［J］.Epidemiology，2015，26（3）：365-373.

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