苯并[a]芘（BaP）是一种五环的多环芳香烃类化合物，是煤、石油等含碳化合物不完全燃烧的产物，广泛存在于环境中［1］。BaP可导致机体的肺、食道、胃肠、肝等多脏器发生癌变［2］，也是导致焦炉工肺癌的重要原因，细胞增殖能力的增强是细胞癌变的早期改变之一。BaP的代谢活化与其致癌能力密切相关［3］。2012年，国际癌症研究中心（IARC）将BaP认定为2A类致癌物。

细胞色素P450（CYP450）氧化酶家族和谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）是参与BaP代谢的重要酶类。CYP450酶中，CYP1A1在BaP代谢中具有非常重要的作用。GSTs的两种亚型GSTP和GSTM参与BaP的解毒代谢过程［4］。

DNA启动子区甲基化及其调控的mRNA表达参与多种肿瘤的发生发展过程［5］，是当前科学界研究的热点。已有研究显示，CYP1A1低甲基化水平与CYP1A1 mRNA的高表达有关［6］，GSTM1启动子区CpG岛的高甲基化与GSTM1 mRNA的低表达有关，以及GSTM1的低甲基化能使基因的表达增加［7］。GSTP1是人类多种肿瘤的抑制基因，其启动子区的甲基化可以使基因失活［8］。本研究拟以人支气管上皮（16HBE）细胞为研究对象，研究在BaP作用下，16HBE的增殖能力以及CYP1A1、GSTP1、GSTM1启动子区DNA甲基化水平和mRNA表达的变化，以探讨CYP1A1、GSTP1、GSTM1启动子区DNA甲基化水平和mRNA表达与细胞增殖的相关性，为BaP毒理学机制的研究提供科学依据。

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1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

BaP（Sigma，美国），二甲基亚砜（北京索莱宝科技有限公司，中国），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，中国），CCK8试剂（DOJINDO，日本），RNA提取试剂RNAiso Plus、反转录试剂盒PrimerScript RT Master Mix、PCR引 物、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa，日本），EZ DNA Methylation-GoldTM Kit（ZYMO，美国），Bioteke DNA提取试剂盒、人甲基化阳性对照（北京艾德科技有限公司，中国），台式低温高速离心机（离心半径r=6.25 cm，力康生物医疗科技控股有限公司，中国），UV-2450分光光度仪（岛津，日本），荧光定量PCR仪Line Gene9600（杭州博日科技有限公司，中国），iMark酶标仪（BioRad，美国），倒置显微镜（OLYMPUS，日本），CO2恒温培养箱Galaxy 170S（Eppendorf，德国）。

现在我是第一代身份证——没用啦，每天写写字，钻钻牛角尖，把自己整得像教授一样。那些年可忙坏啦，县里镇里是把我当典型来培养的，三四年功夫当到校长。嘿嘿，不过呢，当教务主任时，没有副校长和校长；当副校长时，既没有校长也没有教务主任；当校长后，副校长和教务主任都没了。村小嘛。

1.2 16HBE细胞培养、分组、染毒处理

基因甲基化水平的测定：采用甲基化特异性PCR（MSP）法测定。以人甲基化阳性对照作为标准品，将其经过亚硫酸氢盐修饰后5倍梯度稀释，质量浓度依次为50、10、2、0.4、0.08、0.016 ng/μL，经实时定量PCR扩增后，绘制标准曲线。各样本经Bioteke试剂盒提取人支气管上皮细胞DNA，取500 ng DNA进行纯化（确保纯度在1.8~2.0之间）和亚硫酸氢盐修饰，然后取2 μL修饰后的DNA样品（100 ng）进行qPCR扩增，反应体系为：2×SYBR Green qPCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L正、反向引物各1 μL（引物序列相关信息见表1），ddH2O补足体积至25 μL。PCR扩增程序如下：95℃ 10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40个循环。反应结束后确认qPCR的扩增曲线和熔解曲线。根据阳性对照标准曲线，其方程为y=-0.902lnx+32.181，R2=0.999 3，式中，x表示体系中标品的甲基化水平，y表示标品的Ct值；然后根据样品的Ct值由方程得出相应的样品甲基化表达水平。

染毒剂量的选择：根据预实验结果和人群实际暴露剂量选择染毒剂量为1、2、5 mmol/L BaP。2~5 mmol/L恰好涵盖了职业人群通过呼吸道接触BaP暴露水平（2×10-3 mg/d）［9］。

1.3 细胞形态学观察及增殖能力的测定

将16HBE细胞在96孔板中染毒24 h，在200倍倒置显微镜下观察其形态以及细胞增殖情况；之后加入CCK8检测剂（每孔加入5 mL），在培养箱中继续孵育2 h，待各浓度颜色呈现梯度变化时，在λ=450 nm条件下用酶标仪测定光密度（D）值。

1.4 CYP1A1、GSTP1和GSTM1启动子区域及基因甲基化水平的测定

除此之外，时隔几年，中国优秀焊接工程评选又诞生一个特等奖项目，本届论坛也专门邀请了特等奖项目——中建钢构有限公司中国尊项目副总工王立建先生做了“中国尊项目焊接成果交流”。通过“中国尊”项目在焊接技术以及焊接工艺的开发应用，焊接质量管控等各个方面的翔实介绍，为工程建设领域的焊接同仁对各自的焊接项目管理提供了很好借鉴作用。

取同批次对数生长期的16HBE细胞（首都医科大学田琳教授惠赠），用含体积分数为10%胎牛血清的完全DMEM培养基进行培养，待其贴壁生长到总面积的70%~80%时，随机分为4组（每组3个平行，复孔），更换为无血清培养基，分别用体积分数为0.1%二甲基亚砜溶剂和1、2、5 mmol/L BaP处理后，在37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养24 h，用于后续实验研究。

 

表1 甲基化引物序列Table 1 Methylated primer sequences

  

［注］m：甲基化引物；F：正向引物，R：反向引物。［Note］m：Methylated primer；F：Forward primer，R：Reverse primer.

 

扩增产物（bp）Amplification product mCYP1A1F：GATTATTTTTTGGTTTGGATTAGC 60 240 R：TAACCTAACTACCTACCTCCGACG mGSTM1F：TGGTGTTTTAAGCGTATAGTTAAGTC 60 130 R：GAAACCTTACTACGACCCCG mGSTP1F：AGGTTAGGAGTTCGAGATTAGTTC 60 167 R：CCCGAATAAATAAAATTATAAATACGTA基因Gene引物序列（5’→3’）Primer sequence（5’→ 3’）退火温度（℃）Annealing temperature

1.5 CYP1A1、GSTP1和GSTM1 mRNA表达的测定

与溶剂对照组相比，各浓度BaP处理组CYP1A1、GSTP1、GSTM1 mRNA表达水平均降低，差异有统计学意义（均P < 0.05）；其他组之间两两比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

 

表2 mRNA引物及β-actin引物序列Table 2 mRNA primer and β-actin primer sequences

  

［注］F：正向引物，R：反向引物。［Note］F：Forward primer，R：Reverse primer.

 

扩增产物（bp）Amplification product β-actinF：AATCTGGCACCACACCTTCTAC 60 150 R：CTTCTCCTTAATGTCACGCACG CYP1A1F：TTCATCCCTATTCTTCGCTACC 60 143 R：GCTCCTTGACCATCTTCTGC GSTM1F：GTCCTTGACCTCCACCGTAT 60 130 R：CAGCCATCTTTGAGAACACAG GSTP1F：GAGGACCTCCGCTGCAAATA 60 117 R：CTGGGACAGCAGGGTCTCAA基因Gene引物序列（5’→3’）Primer sequence（5’→3’）退火温度（℃）Annealing temperature

1.6 统计学分析

用SPSS 22.0软件进行统计分析，数据用±s表示，不同组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD法，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 16HBE细胞的形态及增殖能力

染毒24 h后，倒置显微镜下形态学观察结果显示，溶剂对照组和BaP处理组细胞形态均呈梭形，没有明显变化。与溶剂对照组相比，BaP处理组（1、2、5 mmol/L）的新生细胞数明显增多，折光性增强，表明其增殖能力增强（见图1）。

2.2 16HBE细胞增殖能力

与溶剂对照组相比，BaP处理组（1、2、5 mmol/L）细胞的增殖能力增强，均高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）；其他组间差异不具有统计学意义（P >0.05）（见表3）。

2.3 CYP1A1、GSTP1和GSTM1启动子区DNA甲基化水平

生物体内的代谢转化在BaP致癌过程中起着举足轻重的作用。mRNA表达水平可以较为敏感地反映生物体细胞的功能变化，与生物酶在蛋白质表达水平和酶活性呈高度的正相关［11］。CYP1A1是CYP450酶系中参与BaP代谢活化的重要酶之一，它在生物体中一般呈低水平表达，BaP可诱导CYP1A1表达水平增加［12］。CYP1A1高表达可促进BaP代谢活化为高活性的终致癌物7，8-二羟基-9，10-环氧苯并[a]芘（BPDE），形成BPDE-DNA和BPDE-蛋白质加合物，诱导细胞的增殖、分化和癌变。与之相反的是，有研究表明CYP1A1可同时参与BaP的代谢活化和解毒，对代谢解毒作用更为重要［13-14］。BaP抑制CYP1A1 mRNA表达的作用与诱导机体产生的活性氧有关［15］。本研究结果显示，1、2、5 mmol/L BaP抑制16HBE细胞CYP1A1启动子区甲基化和mRNA表达，从而阻止BaP代谢活化为高活性的终致癌物7，8-二羟基-9，10-环氧苯并[a]芘，因此，在BaP代谢机制中，CYP1A1可能对细胞起到保护作用。

CYP1A1、GSTP1和GSTM1基因甲基化启动子区域：CYP1A1 15q24.1，启动子区在（-74727610~-74725610），该区域包含两个CpG岛（505~1301）（1337~1742）；GSTP1 11q13.2，启动子区在（-67588653~-67586653），该区域包含两个CpG岛（1421~1683）（1830~1944）；GSTM1 1q13.3，启动子区在（-109695745~-109693745），该区域包含一个CpG岛（1814~1943）。

2.4 CYP1A1、GSTP1和GSTM1 mRNA表达分析

采用qPCR法测定。染毒24 h后，用Trizol试剂提取RNA并检测RNA的纯度和浓度，纯度在1.8~2.2之间认为合格，用于后续试验。按50 ng/mL将其反转录为cDNA，进行qPCR扩增，反应体系包括：2×SYBR Green qPCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L的正、反向引物各1 μL（mRNA引物序列相关信息见表2），cDNA 10 ng，ddH2O补足体积至25 μL。扩增程序如下：95℃10 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，40个循环。反应结束后确认qPCR的扩增曲线和熔解曲线，采用2-ΔΔCt法计算实验组相对于对照组目的基因mRNA表达的变化倍数，ΔΔCt =（Ct实验组目的基因-Ct实验组内参）-（Ct对照组目的基因-Ct对照组内参）。

  

图1 BaP对16HBE增殖能力的影响Figure 1 Effects of BaP on 16HBE cell proliferation

 

［注］A：溶剂对照组，B：1 mmol/L BaP处理组，C：2 mmol/L BaP处理组，D：5 mmol/L BaP处理组；与A组相比，B、C、D组新生细胞数目明显增多，折光性明显增强。［Note］A：Solvent control group，B：1 mmol/L BaP group，C：2 mmol/L BaP group，D：5 mmol/L BaP group；compared with group A，groups B，C，and D are significantly increased in the number of neoplastic cells and refractivity.

 

表3 不同浓度BaP对16HBE细胞的毒性效应（±s，n=6）Table 3 Toxic effects of different concentrations of BaP on 16HBE cells

  

［注］a：与溶剂对照组相比，P < 0.05；b：与1 mmol/L BaP染毒组相比，P < 0.05。［Note］a：Compared with the control group，P < 0.05；b：Compared with the 1 mmol/L BaP group，P < 0.05.

 

BaP浓度（mmol/L）BaP concentration甲基化水平（Methylation） mRNA表达（mRNA expression）CYP1A1 GSTP1 GSTM1 CYP1A1 GSTP1 GSTM1 0细胞增殖率（%）Cell proliferation rate 100.00±0.47 13.917±1.094 10.86±1.129 40.062±7.746 1.067±0.064 0.829±0.116 0.975±0.183 1 125.22± 0.72a 8.451±1.234a 4.276±0.839a 34.693±6.603a 0.009±0.001a 0.179±0.074a 0.547±0.181a 122.92±1.47a 8.532±0.728a 3.691±0.748a 48.407±7.824ab 0.009±0.001a 0.167±0.048a 0.518±0.141a 5 128.44±5.97a 11.064±0.423a 2.121±0.336a 49.803±2.516ab 0.017±0.003a 0.143±0.029a 0.297±0.044a F 50.030 32.679 7.040 21.842 7.040 119.017 4.206 P<0.000 0.000 0.000 0.000 0.004 0.000 0.028 2

3 讨论

进了“星光”录像厅,录像早开始了,里面昏暗暗的，我便寻了个空位坐下。那天放的是刘德华和关之琳演的一部片子，我歪斜在长椅上静静地看。不一会儿，刘德华便和关之琳开始接吻了，先是轻轻地碰一下，分开，情意绵绵地互相望望，再吻，很拼命了，四片唇紧紧地粘在一起，玉齿轻启，粉舌绕缠，咬架似的。我正看得津津有味，有人拍了拍我的肩，我没有理会，那人又拍。我说：“干什么嘛？”仍目不转睛地看，因为刘德华已经开始脱关之琳的衣服了，刘德华的手拉住关之琳的胸罩吊带，一点一点地向下扯。我感到有人拿起了我的手，后来又把它放下，我没有理会。我的手穷得让我很放心，上面只有一块价值60元的破手表，没有金戒指、玉手链什么的。

与溶剂对照组相比，BaP处理组（1、2、5 mmol/L）CYP1A1的启动子区DNA甲基化水平降低（P < 0.05），其他组间差异不具有统计学意义（P > 0.05）；GSTP1启动子区DNA甲基化水平降低（P < 0.05），其他组间差异不具有统计学意义（P > 0.05）；而GSTM1启动子区DNA甲基化水平先降低后增高（P < 0.05），与1 mmol/L Bap处理组相比，2、5 mmol/L Bap处理组的GSTM1甲基化水平增高，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

本研究发现，不同浓度BaP（1、2、5 mmol/L）处理16HBE 24 h，可使细胞增殖能力增强，并使CYP1A1、GSTP1启动子区的甲基化水平降低，抑制CYP1A1、GSTP1和GSTM1 mRNA的表达。以往研究也表明，BaP可使16HBE细胞活力升高［10］，这与本研究结果一致。

GSTs是生物体内的重要解毒酶系，可将BaP代谢解毒生成GST-S结合物排出体外［16］。其中GSTP1基因是体内重要的致癌物代谢酶基因，在保护正常细胞免受促癌因素的影响及在抑制细胞癌变的抗肿瘤过程中起重要作用［17-18］。GSTM1的主要功能是对进入机体的药物及有毒物质的解毒作用［19］。多项研究表明，GSTP1以及GSTM1的表达缺失或减少与肿瘤的发生有关［20-21］。本研究显示，1、2、5 mmol/L BaP可使16HBE GSTP1、GSTM1 mRNA的表达降低，这与SAADAT［22］、袁立来［23］等的研究结果一致。

启动子区DNA甲基化是调控mRNA表达的重要表观遗传机制，启动子区DNA甲基化水平的增高可抑制目标基因的表达［24］。本研究结果显示，CYP1A1、GSTP1基因DNA甲基化与mRNA表达成正相关，与以上研究不一致。GSTM1启动子区DNA甲基化水平在1 μmol/L BaP染毒时降低，2、5 μmol/L 时增加，其缘由尚待进一步研究探索。通常认为，mRNA表达的变化比DNA水平的甲基化修饰更为敏感。BaP短时间作用于16HBE细胞，同时表现为mRNA表达水平和DNA甲基化水平的下降，作为负向调控mRNA表达方式之一的DNA甲基化，其作用可能是阻止mRNA表达的进一步降低，而甲基化水平下降也可能是mRNA过度抑制的负向反馈的作用结果［25］。

体外实验快速简便、敏感性高，条件易控制，但不能完全反映BaP作用下机体内发生的复杂生物学过程。其次，本研究只观察了BaP对16HBE细胞的急性毒性效应及对相关代谢酶基因甲基化和基因表达水平的影响，未观察BaP长期反复作用对支气管细胞的慢性毒效应。最后，调控目标基因mRNA的表达方式有多种，除DNA甲基化外，细胞内环状RNA、microRNA、siRNA以及组蛋白修饰、染色质重塑等［26-27］，本研究只是对甲基化与基因表达的关系进行了初步探讨。

(2)发布I/M制度相关的配套性文件。江苏、广州、张家港等地制定了《在用汽车尾气排放相关维护技术规范》、《汽车尾气排放性能维护企业(M站)技术服务要求》、《汽车尾气排放治理维护站(M站)认定标准》、《汽车检测与维护(I/M)制度尾气超标治理业务流程》等配套性文件，完善配套制度强化市场监管，制定技术规范和标准化工作流程，在部门职责、检测标准、M站认定、信息化平台、监督管理等方面明确具体要求，明确试点示范企业，为有效落实I/M制度提供了良好的工作基础与技术储备。

这个反应的本质可以理解为强酸制弱酸,作为一种弱酸的酸根,可以结合酸性比它强的酸中的H+,而H2CO3的酸性就比HAlO2强,因此就可以结合H2CO3电离出的H+形成HAlO2,HAlO2再结合一个H2O就形成Al(OH)3沉淀,H2CO3失去H+以后最终变成了,说明可以连续结合H2CO3中两个H+,那么和不能共存就不足为奇了。

综上所述，1、2、5 mmol/L BaP对16HBE的毒作用机制可能与细胞增殖能力增强，CYP1A1和GSTP1启动子区DNA甲基化水平降低以及CYP1A1、GSTP1、GSTM1 mRNA表达抑制有关。研究结果为BaP毒效应及机制的深入研究提供了一定的科学依据。

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