苯并[a]芘（benzo[a]pyrene，BaP）是多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs）中 的 一 种，2012年被国际癌症研究机构确定为Ⅰ类致癌物，可诱发肺癌、肝癌、胸腺癌、前列腺癌和皮肤癌。BaP进入机体后最终被代谢为苯并[a]芘-7，8-二氢二醇-9，10-环氧化物（benzo[a]pyrene-7，8-dihydrodiol-9，10-epoxide，BPDE）［1］，BPDE易与DNA亲核位点结合而造成DNA损伤，最终诱发肿瘤。近年研究表明，表观遗传学与DNA损伤［2］及肿瘤发生发展密切相关。细胞及动物实验的研究提示，BaP导致表观遗传学DNA甲基化水平的改变可能在BaP致癌过程中起重要作用［3］。

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度超过200 nt的RNA，在表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用［4-5］。大部分功能性lncRNA需要和其他蛋白一起组成核糖体蛋白方能发挥功能［6］。H19是一种多功能lncRNA，越来越多证据表明H19在肿瘤的发生发展过程中起重要调控作用［7］。最近有学者发现H19可以与S-腺苷高半胱氨酸水解酶（SAHH）结合，SAHH是哺乳动物体内唯一明确的可以将S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH）水解为高半胱氨酸和腺苷酸的酶［8］。SAH是甲基供体S-腺苷蛋氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）发生转甲基反应的副产物，SAH对于SAM依赖的转甲基反应有很强的反馈抑制作用，而SAHH可以解除SAH对甲基化反应的抑制作用［9］。因此考虑H19可能通过与SAHH的相互作用，在BaP导致的DNA甲基化改变过程中发挥一定作用。

本研究以BaP染毒人支气管上皮细胞16HBE细胞系，探讨BaP影响H19和SAHH表达的剂量效应与时间效应关系，采用原位荧光杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技术结合免疫荧光法初步探究H19与SAHH的关系。

一是建立风险源识别分类评估制度。应当组织各单位对依照工艺流程，在所辖范围对所有可能发生的风险源进行识别汇总，并按照可能发生的概率大小以及影响程度进行分类评估。对于发生概率大影响程度高的风险源作为防控的重点；对于发生概率小影响程度大或者发生概率高影响程度低的风险源作为防控的次重点；而对于发生概率小影响程度低的风险源作为防控的一般重点。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

16HBE细胞由武汉工业学院宫智勇教授惠赠。二氧化碳孵育箱（Heraeus，德国），GR85DA全自动灭菌器（Zealway，美国），5424R冷冻离心机、BioSpectrometer fluorescence分光光度计、Mastercycler nexus gradient仪、Thermomixer恒温混匀仪（Eppendorf，德 国 ），LightCycler® 480实 时 荧 光 定 量PCR仪、LightCycler® 480 Multiwell Plate 96（Roche，瑞 士 ），SpectraMaxM2型多功能酶联免疫检测仪（Molecular Divices，美国），IX51倒置显微镜、Olympus FluoView FV10i激光扫描共聚焦显微镜（Olympus，日本），DYY-7C型电泳仪（北京六一仪器厂，中国），Universal Hood Ⅱ凝胶成像仪（Bio-Rad，美国），20 mm细胞培养皿（无锡耐思生物科技有限公司，中国），Western透明孵育盒F6632（Crystalgen，美国），α-MEM培养基（Thermo Fisher scientific，美国），无噬菌体低内毒素胎牛血清（杭州四季青有限公司，中国），青链霉素混合液（100×）、胰蛋白酶-EDTA消化液、二甲基亚砜（DMSO）、吐温-20（Tween-20）（北京索莱宝科技有限公司，中国），BaP（Sigma-Aldrich，美国），H19 FISH Probe Mix、Fluoescent in situ Hybridization Kit（广州锐博生物科技有限公司，中国），20×SSC缓冲粉剂（北京博奥拓达科技有限公司，中国），5×PrimeScriptTM RT Master Mix、2×SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ（大连宝生物工程有限公司，中国），H19引物、β-actin引物（北京奥科鼎盛生物科技有限公司，中国），Alexa Fluor 488山羊抗鼠抗体、SAHH单克隆抗体（Proteintech，美国），Trizol提取试剂、哺乳动物蛋白抽提试剂盒、蛋白酶抑制剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒、高灵敏化学发光检测试剂盒、抗GAPDH鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗、封闭用正常山羊血清工作液（北京康为世纪生物科技有限公司，中国），多聚甲醛（天津市凯通化学试剂有限公司，中国）。

1.2.2 RT-PCR法检测细胞H19的相对表达量 细胞染毒结束后，用2.5 g/L的胰酶消化细胞，D-Hanks平衡盐溶液清洗2遍，收集至1.5 mL离心管中，加入Trizol提取总RNA，使用BioSpectrometer fluorescence分光光度计测定样品光密度值，得出样品总RNA的纯度及浓度值。按照5×PrimeScriptTM RT Master Mix试剂说明书进行反转录得到cDNA产物（反转录反应条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 15 min）；按照2×SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂说明书进行逆转录（RT）-PCR（RT-PCR反应条件：95℃ 30 s，1个循环；95℃ 5 s、62℃ 30 s、72℃ 30 s，45个循环；95℃ 60 s、65℃ 30 s、95℃，1个循环）。每个样品做3个平行样，得每个样品的扩增曲线及溶解曲线，各样品Ct值经内参基因β-actin标化后，根据2-ΔΔCt公式计算H19的相对表达量。引物序列：β-actin正向引物，5'-TCCCTGGAGAA GAGCTACGA-3'；反向引物，5'-AGCACTGTGTTGGCGT ACAG-3'；H19正向引物，5'-CACACTCACGCACACTCG TA-3'；反向引物，5'-CACCACCTCCCTCTTCTTCTT-3'。

1.2 方法

1.2.4 lncRNA FISH技术结合免疫荧光法检测H19及SAHH的分布 用细胞培养皿培养细胞，16 μmol/L BaP染毒24 h处理。染毒结束后，加1 mL质量分数为4%多聚甲醛固定液室温固定20 min，加入1 mL预冷的体积分数为0.5%Triton X-100通透液，4℃静置20 min。加入预杂交液37℃封闭30 min，同时37℃预热不含探针的杂交液。加入含探针的杂交液（探针与杂交液体积比为1∶40）避光37℃杂交过夜，依次用杂交洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ避光42℃清洗细胞5 min、3次。加入封闭用正常山羊血清工作液避光37℃封闭1 h，加入SAHH抗体（抗体与PBS体积比为1∶10）避光4℃孵育过夜。次日加入Alexa Fluor 488山羊抗鼠抗体（抗体与PBS体积比为1∶500）避光37℃孵育1 h。加入4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）溶液（DAPI与PBS体积比为1∶1 000）避光室温孵育10 min，用PBS清洗细胞3 min、3次，加入1 mL PBS，用激光扫描共聚焦显微镜观察，并进行600×细胞图像采集，根据DAPI核定位的特性，分析单个细胞内H19、SAHH的荧光分布，并观察共定位信息，分析H19、SAHH是否有结合及结合位置。

用不同浓度BaP处理16HBE细胞24 h（图1A）及用16 μmol/L BaP处理16HBE细胞不同时间（图1B）后，H19表达的检测结果如图1所示。随着BaP染毒浓度和时间的增加，16HBE细胞H19表达呈现逐渐升高的趋势。BaP染毒浓度为8、16、32 μmol/L时，H19的表达明显高于溶剂对照组（均P < 0.05），分别增加了34.3%、46.0%和78.0%，在BaP浓度为32 μmol/L时达到峰值；不同染毒时间点中，16 μmol/L BaP染毒时间为4、8、12、24 h时，H19表达与溶剂对照组相比明显增高（均P < 0.05），分别增加了14.1%、22.2%、37.2%和48.3%，在染毒时间为24 h时达到峰值。溶剂对照组与未处理组相比，16HBE细胞H19表达差异无统计学意义（P > 0.05）。

大学通常被人们比作象牙塔,是国家的高等教育学府,综合性的提供教学和研究条件以及授权颁发学位的高等教育机关。现今的高校大学生是祖国未来的明天,是撑起中国脊梁的接班人,是东方巨龙屹立世界之林的希望。伴随着全球经济的变化和正处于多极化的国际环境之中,社会对大学生的要求也随之提高,高校的学生管理工作也就面临着巨大的机遇和挑战,而在学生工作中举足轻重的辅导员,就成为非常关键的一环。

如图3所示，16 μmol/L BaP染毒细胞24 h后，根据DAPI分析结果可见，H19红色荧光和SAHH绿色荧光均在细胞质及细胞核中表达，二者的表达在核周质及核膜中较高。根据橘色荧光可认为H19和SAHH蛋白在细胞质和细胞核中存在共定位；从荧光强度可以看出，与0 h组相比，16 μmol/L BaP染毒24 h后细胞内H19表达量升高，SAHH蛋白表达量降低，且两者共定位的橘色荧光强度增加。

1.2.1 细胞培养及染毒 16HBE细胞在37℃恒温、体积分数5%CO2、饱和湿度的孵育箱培养，α-MEM完全培养液包含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素、100 μg/mL的链霉素，隔天换液，用2.5 g/L的胰酶消化后进行传代。

1.3 统计学分析

Gu等［16］通过Meta分析发现颈椎后路手术术后C5神经根麻痹发生率为5.8%，单开门椎管扩大椎板成形术、双开门椎板成形术和椎板切除术术后C5神经根麻痹的发生率分别为4.5%，3.1%和11.3%。OPLL、椎间孔狭窄、椎板切除术、脊髓过度后移等是C5神经根麻痹的显著危险因素。

2 结果

2.1 BaP对16HBE细胞H19表达的影响

前期实验结果显示：随着BaP染毒浓度和染毒时间的增加，细胞DNA损伤和S期阻滞会随之增加，细胞活力随之降低；在16 μmol/L染毒至24 h时，细胞活力保持90%以上，且出现DNA损伤和明显的S期阻滞；当浓度高于16 μmol/L时，细胞S期阻滞达到平台期，此时再增加染毒浓度和染毒时间，S期阻滞也不再增加，而细胞活力下降明显，细胞大量死亡，无法进行之后的免疫荧光和免疫印记实验［10］。因此，本实验选用16 μmol/L BaP染毒不同时间点，又选用24 h作为不同浓度BaP染毒后的观察时间。取对数生长期的细胞消化、离心、重悬，均匀接种于6孔板中，于细胞孵育箱中进行培养，待细胞密度达到60%时进行染毒，染毒时每组3个孔作为平行样。设置不同浓度BaP染毒，分别为未处理组（仅加培养液）、0（溶剂对照组）、1、2、4、8、16、32 μmol/L BaP组，染毒24 h。16 μmol/L BaP染毒不同时间，包括0、1、2、4、8、12、24 h。染毒结束后根据后续实验要求对样品进行不同的处理。

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，不同组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用Dunnett-t法。检验水准α=0.05。

2.2 BaP对16HBE细胞SAHH表达的影响

用不同浓度BaP处理16HBE细胞24 h（图2A）及用16 μmol/L BaP处理16HBE细胞不同时间（图2B）后SAHH表达的结果如图2所示。溶剂对照组与未处理组相比，16HBE细胞SAHH表达差异无统计学意义（P > 0.05）。随着BaP染毒浓度和时间的增加，16HBE细胞SAHH表达呈现逐渐降低的趋势（P < 0.05）。不同染毒浓度组中，SAHH表达较溶剂对照组分别降低了7.7%、13.3%、22.3%、27.8%、32.7%和37.2%，在BaP浓度为32 μmol/L时降至最低；不同染毒时间点中，染毒1、2、4、8、16、32 h的SAHH表达较0 h分别降低了4.4%、6.8%、10.6%、14.5%、24.4%和33.1%，在染毒时间为24 h时降至最低。

  

图1 不同浓度（A）和不同时间（B）BaP染毒对16HBE细胞H19表达的影响Figure 1 The relative expression levels of H19 in 16HBE cells exposed to selected concentrations BaP for 24 h （A） and 16 μmol/L BaP for selected time blocks （B）

 

［注］*：与溶剂对照组（0 μmol/L）相比，P < 0.05；#：与0 h组相比，P <0.05。［Note］*：Compared with the solvent control group（0 μmol/L），P < 0.05；#：Compared with the 0 h group，P < 0.05.

2.3 BaP对细胞内H19及SAHH的分布影响

1.2.3 Western-blot检测细胞SAHH蛋白的表达水平细胞染毒结束后，用2.5 g/L的胰酶消化细胞，D-Hanks平衡盐溶液清洗2遍，收集至1.5 mL离心管中。按哺乳动物蛋白抽提试剂盒说明书提取蛋白，采用二硅啉甲酸（BCA）蛋白定量法测各组蛋白浓度，将各组蛋白调至同一浓度，加入相应的蛋白示踪上样缓冲液充分混匀，沸水浴煮沸5 min后冷却至室温，取约80 μg总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳。电泳后湿转至聚偏二氟乙烯膜膜上，用质量分数为5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，加入SAHH及GAPDH抗体，4℃孵育过夜。次日PBS漂洗10 min、3次，加入山羊抗小鼠IgG抗体37℃孵育2 h，PBS漂洗10 min、3次。用Universal Hood Ⅱ凝胶成像仪进行检测，用Quantity One-4.6.5软件进行灰度值的分析。

  

图2 不同浓度（A）和不同时间（B）BaP染毒对16HBE细胞SAHH表达的影响Figure 2 The protein expression levels of SAHH in 16HBE cells exposed to selected concentrations of BaP for 24 h （A）and 16 μmol/L BaP for selected time （B）

 

［注］*：与溶剂对照组（0 μmol/L）相比，P < 0.05；#：与0 h组相比，P <0.05。［Note］*：Compared with the solvent control group（0 μmol/L），P < 0.05；#：Compared with the 0 h group，P < 0.05.

  

图3 16 μmol/L BaP 染毒16HBE细胞24 h H19和SAHH的免疫荧光结果Figure 3 The immunofluorescence result of H19 and SAHH in 16HBE cells exposed to 16 μmol/L BaP for 24 h

 

［注（Note）］A：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）；B：H19；C：SAHH；D：H19 & SAHH。1：16 μmol/L BaP，0 h；2：16 μmol/L BaP，24 h。

3 讨论

lncRNA在肿瘤发生发展的调控过程中扮演重要角色［4］，目前发现许多lncRNAs在一些癌症组织中异常表达，且存在组织特异性，lncRNAs的异常表达可能与肿瘤的发生和转移存在相关性［11-13］。其中H19位于人类11号染色体，是一种母系来源的印迹基因，在胞质和核内都可以被激活。有研究发现H19在结肠癌、胰腺癌、胃癌和肝癌等多种肿瘤中异常表达，其作为促癌基因或抑癌基因可能与肿瘤的微环境、肿瘤遗传背景等多种因素有关［14］，H19作为促癌基因，其位点缺失可导致H19在多种恶性肿瘤中呈现较高丰度表达［15-16］。ZHANG等［17］在胃癌研究中发现临床病理分期越晚的患者体内H19的表达量越高，LUO等［18］报道H19表达上调可调控ID2表达从而诱导膀胱癌细胞增殖。而H19亦可作为抑癌基因，在肿瘤的发生发展中起作用。ZHANG等［19］发现肝癌患者中癌灶内组织的H19表达比癌旁组织低，并且H19表达越低的患者预后越差，有学者提出抑制H19表达可通过AKT/GSK-3beta/Cdc25A信号通路促进肝癌细胞的浸润与转移［20］。BaP在机体代谢的最终产物BPDE具有致癌作用，可诱导16HBE细胞恶性转化为癌细胞［3，21］，且有研究报道动物与人类肺癌的发生与BaP的暴露水平存在正相关［22-23］。本实验发现，H19在16HBE细胞内的表达水平随着BaP染毒剂量和染毒时间的增加而升高，结合实验室前期结果［10］（BaP可诱发DNA损伤和细胞周期S期阻滞），猜测H19可能在BaP致16HBE细胞DNA损伤及细胞周期阻滞调控的过程中起重要作用，进而参与调控肿瘤发生发展的过程，此与H19作为一个促癌基因发挥作用的研究观点相一致。

H19作为一种功能性lncRNA，可与其他蛋白一起组成核糖体蛋白发挥功能，参与调控DNA甲基化及影响肿瘤的进程［7，24］，ZHOU等［8］采用亲和层析法结合质谱分析发现，HEK293细胞过表达的H19可以与SAHH相结合，调控转甲基反应中甲基转移酶活性，从而影响不同基因的甲基化水平；ZHANG等［24］提出在小鼠成肌细胞发育过程中，H19与SAHH结合可能参与调控基因甲基化；人类肿瘤细胞模型的研究表明，SAHH可以和H19相互作用，调控全基因组甲基化水平［25］。已有研究表明，SAHH是细胞内唯一可水解SAH的酶，细胞内SAHH含量的减少会导致细胞内SAH的含量增多，SAH对于SAM依赖的转甲基反应有很强的反馈抑制作用［8-9］，可使该转甲基反应受到抑制，进而导致DNA甲基化程度降低；而DNA甲基化程度的降低，尤其是某些抑癌基因甲基化程度的降低，可在肿瘤的发生发展过程中起积极作用［26-27］。本课题通过lncRNA FISH检测试剂盒结合激光共聚焦显微镜实验，发现H19和SAHH蛋白在16HBE细胞质和细胞核中共定位，提示二者可能存在相互作用，此结果与ZHOU［8］研究提出细胞内H19可以与SAHH结合的观点相符；与正常细胞相比，BaP染毒细胞的H19表达量升高，SAHH表达量降低，本研究RT-PCR及Western blot结果表明H19和SAHH在16HBE细胞内的表达水平均受BaP染毒剂量和染毒时间的影响。

第二步，将建立的模型转换成3D打印切片软件之间协作的标准文件格式，如stl、stp、obj格式等，其中stl格式最为常见。

第二天，我早早起了床，来到舞蹈班见了老师，然后老师便把我带进了教室。在那里，我看到了许多和我一样大的孩子，她们体态优美，用友好的眼光望着我。老师开口讲话了：“前几天的学习内容非常简单，我们先尝试着练习一些基本动作，但后面的内容难度大一些，希望大家能够坚持下去。”第三天，果然像老师说的那样，又是压腿，又是劈叉，身体柔韧度不太好的我，已经被折磨得痛不欲生。

综上可知，BaP会使16HBE细胞H19表达量增多，SAHH蛋白表达量减少，二者在16HBE细胞质和细胞核中共定位，提示二者可能存在相互作用。由于lncRNA FISH技术是一种定性的实验方法，能够在细胞空间结构中清晰观察H19和SAHH的定位分布，但其荧光数据不能作为精确定量，这是本研究的一个缺陷。因此，下一步我们将利用放射免疫沉淀实验进一步验证H19和SAHH之间的相互作用，并采用小干扰RNA（siRNA）干扰技术降低16HBE细胞中H19的表达水平，通过检测基因组和特定基因甲基化模式的变化，为H19调控BaP暴露所致基因甲基化模式改变的分子机制提供相应线索。

参考文献

［1］HODEK P，KOBLIHOVÁ J，KIZEK R，et al. The relationship between DNA adduct formation by benzo[a]pyrene and expression of its activation enzyme cytochrome P450 1A1 in rat［J］. Environ Toxicol Pharmacol，2013，36（3）：989-996.

［2］PARSONS B L. MED1：a central molecule for maintenance of genome integrity and response to DNA damage［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（25）：14601-14602.

［3］陶功华，庄志雄，杨淋清，等. 苯并［a］芘诱发细胞恶性转化过程中基因组总体DNA甲基化改变［J］. 环境与职业医学，2014，31（5）：347-351.

［4］CHUNG S，NAKAGAWA H，UEMURA M，et al. Association of a novel long non-coding RNA in 8q24 with prostate cancer susceptibility［J］. Cancer Sci，2011，102（1）：245-252.

［5］WILUSZ J E，SUNWOO H，SPECTOR D L. Long noncoding RNAs：functional surprises from the RNA world［J］. Genes Dev，2009，23（13）：1494-1504.

［6］BETANCUR J G. Pervasive lncRNA binding by epigenetic modifying complexes-the challenges ahead［J］. Biochim Biophys Acta，2016，1859（1）：93-101.

［7］王晓东. H19基因在肿瘤研究领域的研究进展［J］. 复旦学报（医学版），2017，44（2）：224-230.

［8］ZHOU J，YANG L，ZHONG T，et al. H19 lncRNA alters DNA methylation genome wide by regulating S-adenosylhomocysteine hydrolase［J］. Nat Commun，2015，6：10221.

［9］TEHLIVETS O，MALANOVIC N，VISRAM M，et al.S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase and methylation disorders：yeast as a model system［J］. Biochim Biophys Acta，2013，1832（1）：204-215.

［10］YANG J，WANG Z，CHEN W，et al. Role of ubiquitin protein ligase Ring2 in DNA damage of human bronchial epithelial cells exposed to benzo[a]pyrene［J］. J Biochem Mol Toxicol，2013，27（7）：357-363.

［11］TING D T，LIPSON D，PAUL S，et al. Aberrant overexpression of satellite repeats in pancreatic and other epithelial cancers［J］. Science，2011，331（6017）：593-596.

［12］TINZL M，MARBERGER M，HORVATH S，et al. DD3PCA3 RNA analysis in urine-a new perspective for detecting prostate cancer［J］. Eur Urol，2004，46（2）：182-187.

［13］CUI Z，REN S，LU J，et al. The prostate cancer-up-regulated long noncoding RNA PlncRNA-1 modulates apoptosis and proliferation through reciprocal regulation of androgen receptor［J］. Urol Oncol，2013，31（7）：1117-1123.

［14］MAZAR J，ZHAO W，KHALIL A M，et al. The functional characterization of long noncoding RNA SPRY4-IT1 in human melanoma cells［J］. Oncotarget，2014，5（19）：8959-8969.

［15］TANOS V，PRUS D，AYESH S，et al. Expression of the imprinted H19 oncofetal RNA in epithelial ovarian cancer［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，1999，85（1）：7-11.

［16］SORIN V，OHANA P，GALLULA J，et al. H19-promotertargeted therapy combined with gemcitabine in the treatment of pancreatic cancer［J］. ISRN Oncol，2012，2012：351750.

［17］ZHANG E B，HAN L，YIN D D，et al. c-Myc-induced，long，noncoding H19 affects cell proliferation and predicts a poor prognosis in patients with gastric cancer［J］. Med Oncol，2014，31（5）：914.

［18］LUO M，LI Z，WANG W，et al. Upregulated H19 contributes to bladder cancer cell proliferation by regulating ID2 expression［J］. FEBS J，2013，280（7）：1709-1716.

［19］ZHANG L，YANG F，YUAN J H，et al. Epigenetic activation of the MiR-200 family contributes to H19-mediated metastasis suppression in hepatocellular carcinoma［J］. Carcinogenesis，2013，34（3）：577-586.

［20］LV J，MA L，CHEN X L，et al. Downregulation of LncRNAH19 and MiR-675 promotes migration and invasion of human hepatocellular carcinoma cells through AKT/GSK-3β/Cdc25A signaling pathway［J］. J Huazhong Univ Sci Technol（Med Sci），2014，34（3）：363-369.

［21］吕嘉春，陈家堃，纪卫东，等. 应用基因芯片技术筛查肺癌变相关基因的研究［J］. 中华医学杂志，2003，83（24）：2146-2151.

［22］CUADRAS A，ROVIRA E，MARCÉ R M，et al. Lung cancer risk by polycyclic aromatic hydrocarbons in a Mediterranean industrialized area［J］. Environ Sci Pollut Res，2016，23（22）：23215-23227.

［23］MANOLI E，KOURAS A，KARAGKIOZIDOU O，et al.Polycyclic aromatic hydrocarbons（PAHs）at traffic and urban background sites of northern Greece：source apportionment of ambient PAH levels and PAH-induced lung cancer risk［J］.Environ Sci Pollut Res，2016，23（4）：3556-3568.

［24］ZHANG L，ZHOU Y，HUANG T，et al. The interplay of LncRNA-H19 and its binding partners in physiological process and gastric carcinogenesis［J］. Int J Mol Sci，2017，18（2）：450.

［25］ZHONG T，MEN Y，LU L，et al. Metformin alters DNA methylation genome-wide via the H19/SAHH axis［J］.Oncogene，2017，36（17）：2345-2354.

［26］LEWANDOWSKA J，BARTOSZEK A. DNA methylation in cancer development，diagnosis and therapy—multiple opportunities for genotoxic agents to act as methylome disruptors or remediators［J］. Mutagenesis，2011，26（4）：475-487.

［27］LEAL J F，FERRER I，BLANCO-APARICIO C，et al.S-adenosylhomocysteine hydrolase downregulation contributes to tumorigenesis［J］. Carcinogenesis，2008，29（11）：2089-2095.