肺癌是全球癌症相关发病率和死亡率最常见的原因之一〔1〕,一般可分为小细胞肺癌(SCLC，约占20%)和非小细胞肺癌(NSCLC，约占80%)〔2〕。非小细胞肺癌在肺癌中占绝大多数。虽然经过多年的研究，肺癌的发病率持续下降，但由于缺乏早期检测方法，NSCLC患者的五年生存率仍然不佳〔3〕。因此，对非小细胞肺癌的发生发展进行研究将对肺癌患者的精确诊断和治疗策略产生重要影响。微小RNA(miRNA)是真核生物中发现的一类内源性小非编码RNA，包括18～25个核苷酸，其异常表达可能导致mRNA的降解或功能蛋白的翻译抑制〔4〕。miRNA在调控细胞发育、分化、增殖、转移、侵袭和细胞凋亡等方面发挥重要作用〔5〕。因此，miRNA的异常改变对于包括癌症在内的疾病的发展至关重要。最近研究发现，miR-106b的异常表达导致肾癌、胃癌、肝癌、喉癌、前列腺癌、乳腺癌等多种癌症的发生〔6〕。尽管如此，miR-106b在非小细胞肺癌中作用的生物学功能和分子机制尚不清楚。BTG3，由该基因编码的蛋白质是ErbB2(ERBB2的转导子)，它是抗增殖蛋白质家族的B细胞易位基因/转导物的成员，包括BTG1、BTG2/PC3/Tis21(TPA诱导的序列21)、BTG4、Tob1和Tob2〔7〕。最新研究表明BTG3家族可以抑制细胞增殖，调节多种细胞类型的细胞周期进程和分化〔8〕。目前，大量研究表明BTG3在肿瘤进展中起抑制作用，BTG3的下调可能导致胃癌、肺癌、食管腺癌和前列腺癌的发生〔9〕。本实验阐述了miR-106b在非小细胞肺癌中的生理功能，并且证明BTG3是miR-106b的直接靶标。通过这项研究，验证了miR-106b通过调控BTG3表达在非小细胞肺癌增殖和凋亡中起关键作用。

根据文献[22]取α=α′=β=β′=0.88,λ=λ′=2.25，依据式(6)～式(7)计算双边主体的前景值，构建前景值矩阵，其中[V(Rij)]M×N和[V(Lij)]M×N分别为云服务需求企业和云服务供给企业的前景值矩阵，具体如下：

1 材料与方法

1.1 组织样本和实验器材 所有非小细胞肺癌组织均来自于2016年上海市胸科医院诊断为非小细胞肺癌的患者。本研究中共有75例非小细胞肺癌患者在胸腔镜下行肺部肿瘤切除。包括非小细胞肺癌样品和相邻组织的组织样本，在手术期间立即在液氮中冷冻，并储存在-80 ℃直到提取RNA。本研究经上海市胸科医院伦理委员会批准，所有标本均按世界卫生组织分类标准进行分类。脂质体Lipofectamine 2000和miR-21-inhibitor购自上海吉凯基因，Trizol购自美国Ambion公司，BTG3抗体购买于美国abcam公司，PCR试剂盒购自美国Kapa公司，荧光素酶活性检测试剂盒购自Promega公司，荧光素酶报告载体由Promega公司合成，Transwell小室购自美国Millipore公司(Millipore, Billerica, MA)，Matrigel购自Bio-Rad (Bio-Rad, Madrid, Spain)。

1.2 细胞培养 H1299、H466、A549、H1650细胞系得自中国科学院(上海)典型培养物保藏中心的细胞库。将细胞在含有5% CO2的培养箱中于37 ℃下在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素(Invitrogen，Carlsbad，CA)的RPMI-1640培养基中培养。

1.3 构建稳定的细胞系和细胞转染 用慢病毒载体转染靶向人非小细胞肺癌细胞A549，慢病毒载体用于构建LV2-hsa-miR-106b-模拟载体(miR-106b-5p)和LV2-hsa-miR-106b抑制剂载体(抗miR-106b-5p)(GenePharma，上海)。LV2空的慢病毒构建体作为阴性对照。按照标准方案用慢病毒感染细胞并通过嘌呤霉素筛选。

1.4 RNA分离和定量实时PCR(qRT-PCR)分析使用Trizol试剂从组织或细胞中分离总RNA，并按照制造商的说明书用逆转录酶(TaKaRa)和寡核苷酸(dT)合成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTM II试剂盒进行实时PCR。实时PCR的条件如下：94 ℃10 s，94 ℃5 s，52 ℃30 s退火，72 ℃15 s，然后40个循环。本实验使用miR-106b的特异性引物(正向引物，5'GGGATGAGCGAGATGGCGA-3'和反向引物5'GGATGCGGATGGGAGCGGGAC-3')。作为对照用特异性引物(正向引物5'-CATCACCATCAGGAGAGTCG-3'和反向引物5'-TGACGCTTGCCCACAGCCTT-3')扩增U6。

1.5 克隆形成实验 将两组细胞分别以1×103个细胞浓度接种于60 mm细胞培养皿中，游离单个细胞接种，10 d后，用结晶紫染色溶液染色细胞，并计数含有≥20个细胞的集落，对比两组之间的细胞克隆形成数目差异，用倒置显微镜拍摄代表性菌落并统计。实验重复3次。

1.6 流式细胞分析 用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(Vazyme，南京)评估细胞的凋亡情况，并遵循制造商的方案。通过使用BD FACSCanto II(BD Biosciences，USA)流式细胞术分析细胞，并通过FlowJo软件分析结果。在细胞周期测定中，收获后将细胞悬浮在70%冷乙醇中过夜。然后，用碘化丙锭(PI)(Vazyme，南京)染色30 min的细胞进行分析。计算并比较不同周期阶段的细胞比例。

1.7 双荧光素酶实验 使用生物信息学方法预测和分析miR-106b的潜在靶标，BTG3的3'-UTR与miR-106b结合位点相似，表明BTG3可能是miR-106b的潜在靶点，将具有预测靶位点的人BTG3 3'-UTR野生序列或BTG3 3'-UTR突变序列插入pGL3启动子载体。转染前1 d将A549细胞种植到24孔板(5×105个细胞/孔)上，并与荧光素酶报告载体(0.12 μg)和40 nM miR-106b模拟物或阴性对照模拟物共转染，使用双荧光素酶报告基因测定试剂盒，转染48 h后进行萤光素酶测定。实验重复3次。

1.8 细胞侵袭能力检测 使用transwell侵袭测定以确定细胞侵袭。将1×105个转染的A549细胞接种到具有游离血清培养基的上室中。含有10% FBS的培养基作为趋化剂添加到下部室中，将细胞在37 ℃和5% CO2下侵入48 h。然后将侵入过滤器下表面的细胞在70%乙醇中固定30 min，并用0.1%结晶紫染色10 min。在倒置显微镜下随机选择的5个视野中计数迁移到下侧的细胞数。实验重复3次。

1.9 裸鼠体内致瘤性 用miR-106b或阴性对照miRNA(每只裸鼠2×106个细胞)稳定转化的A549细胞皮下接种到4周龄雌性裸鼠。每个实验组包括5只小鼠。每隔7 d用卡尺测量肿瘤体积，共计35 d，并通过公式：V=(LxW2)/2(V：体积; L：长度; W：肿瘤的宽度)计算肿瘤体积。在植入35 d后，处死小鼠。将肿瘤组织立即在液氮中快速冷冻并保存在-80 ℃以检测BTG3的表达。

1.10 免疫组织化学 将所有植入的肿瘤在4%福尔马林中固定，然后包埋在石蜡中。阻断内源性过氧化物和蛋白后，将切片(厚度4 μm)与第一抗体在4 ℃下孵育过夜以特异性检测BTG3。用PBS洗涤后，将切片与HRP-聚合物缀合的二抗在37 ℃温育1 h。随后，切片用3,3-二氨基联苯胺溶液染色3 min，核用苏木精复染。

1.11 统计分析 定量数据采用SPSS 19.0版(IBM，USA)进行分析，并用至少三次独立实验的平均值±标准偏差表示。使用ANOVA或双向t检验比较组间的显著差异。如果P值<0.05(由*表示)，实验数据有统计学差异。

2 结果

2.1 miR-106b在非小细胞肺癌组织和细胞株中的表达水平 为了确定miR-106b在非小细胞肺癌组织和配对的相邻正常组织中的表达水平，进行qRT-PCR。如图1所示，与相应的相邻正常组织相比，在非小细胞肺癌样品中miR-106b显著上调。进一步通过qRT-PCR检测4种肺癌细胞系(H1299、H446、A549、H1650)中miR-106b的表达水平，结果显示，与其他细胞株相比，miR-106b在A549细胞中具有高水平表达。后续实验选取A549细胞作为实验细胞株。

2.2 MiR-106b与BTG3之间的相互关系 为了探讨miR-106b抑制肺癌细胞生物学进展的分子机制，通过生物信息学网站寻找miR-106b的潜在靶标。BTG3显示与miR-106b相应的结合靶点，被选择为miR-106b靶向基因用于进一步实验验证(图2)。为了研究miR-106b是否通过与其3'-UTR区域结合靶向BTG3，进行双荧光素酶报告基因测定，并且miR-106b过表达显示显著降低BTG3-WT-3'UTR的荧光素酶活性，而不能抑制BTG3-MUT-3'UTR(图2)。实验结果表明miR-106b的表达可以抑制BTG3的荧光活性的表达，BTG3作为miR-106b的功能性靶标，被miR-106b负性调控。

2.3 MiR-106b体外促进非小细胞肺癌的细胞增殖 使用平板克隆形成实验来评估miR-106b对非小细胞肺癌细胞增殖的影响。实验结果显示，与对照组相比，下调miR-106b的表达后可以抑制细胞增殖能力，克隆形成数目减少〔(315.3±21.3)vs(143.6±14.6)，P<0.05〕，差异具有统计学意义(图3)。

 

图1 miR-106b在非小细胞肺癌组织和细胞株中的表达水平

 

图2 miR-106b调控BTG3的表达情况

 

图3 miR-106对非小细胞肺癌细胞增殖能力的影响

2.4 MiR-106b对非小细胞肺癌细胞侵袭能力的影响 为了进一步评估miR-106b对A549细胞体外转移的影响，在用miR-106b或NC转染的A549细胞中测定细胞侵袭能力。transwell侵袭实验显示miR-106b的表达下调抑制细胞侵袭，相比NC组细胞，侵袭细胞数目比例相对减少〔(183.3±21.6)vs(72.6±12.6)，P<0.05〕(图4)。上述结果表明miR-106b抑制细胞的侵袭行为。

2.5 MiR-106b抑制非小细胞肺癌细胞凋亡并促进细胞周期 为了研究miR-106b在非小细胞肺癌进展中的作用，采用流式细胞仪分析检测miR-106b是否影响细胞凋亡或细胞周期。细胞凋亡是非小细胞肺癌发生的重要环节。因此，进行凋亡的流式细胞分析以阐明miR-106b是否在非小细胞肺癌中作为候选致癌基因起作用。miR-106b的表达下调显著增加了A549细胞的凋亡行为(图5)。上述实验结果提示，miR-106b在非小细胞肺癌细胞中促进细胞凋亡。

2.6 MiR-106b促进异种移植肿瘤形成 裸鼠成瘤实验检测接种miR-106b表达下调的A549细胞的裸鼠与阴性组相比肿瘤体积减小(图6)。免疫组化结果显示，在miR-106b下调组中BTG3蛋白表达下降。上述结果揭示miR-106b可促进体内肿瘤形成，且可以调控BTG3的表达。

 

图4 miR-106b对A549细胞侵袭能力的影响

 

图5 miR-106b对非小细胞肺癌细胞凋亡行为的影响

 

图6 miR-106b对裸鼠皮下移植瘤体积的影响

3 讨论

目前肺癌仍然是全世界最常见的恶性肿瘤之一，在发展中国家尤其是中国，肺癌是最常见的癌症和癌症的主要死因〔10〕。晚期肺癌的治疗手段有限，且治疗效果通常不佳，提高肺癌患者的早期诊断率和治疗效果尤为必要，所以关于肺癌新型生物标志物和新的治疗靶点的研究成为热点。

miRNA的异常表达与恶性肿瘤的发展相关，包括肿瘤细胞的迁移和增殖〔11〕。MiR-106b位于人类染色体7q21，并从miR-106b家族簇中转录形成〔12〕。迄今为止，有很多研究实验来探讨miR-106b在各种类型癌症发展中的作用。肝细胞癌中miR-106b的过度表达通过激活上皮-间质转化促进了细胞迁移和转移〔13〕。MiR-106b通过靶向RBL1、RBL2和CASP8在胶质瘤中发挥直接的促癌作用〔14〕。在乳腺癌中，报道miR-106b通过靶向FUT6来促进细胞迁移、侵袭和增殖〔15〕。在结直肠癌中的miR-106b过度表达促进了直接靶向DLC1的细胞迁移和侵袭〔16〕。MiR-106b也被认为是SETD2表达的抑制因子，并且通过SETD2依赖途径在调控结肠癌细胞增殖和凋亡中发挥重要作用〔17〕。然而，据我们所知，miR-106b在非小细胞肺癌细胞中的功能尚不清楚。因此，本实验揭示miR-106b促进非小细胞肺癌细胞增殖并抑制细胞凋亡的生物学作用。

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之前相关研究指出，可以使用BTG探针来分离BTG家族蛋白，包括BTG1、BTG2和BTG3〔18〕。一些证据表明，BTG3表达与肿瘤发生相关，并且在各种癌症中作为候选肿瘤促癌基因，据报道，BTG3涉及促进肿瘤细胞的增殖，细胞周期进程和转移行为〔19〕。然而，BTG3和miRNA之间的关联很少被报道。这里，基于双荧光素酶测定的数据，本实验揭示了BTG3是miR-106b的直接下游靶标，miR-106b可能通过影响BTG3的表达直接介导肺癌细胞的生物学行为。根据之前实验结果，在胃癌细胞中过表达miR-106b的生理功能被BTG3的重新表达所抑制，表明BTG3与miR-106b可以相互干扰抑制〔20〕。因此，我们认为通过调控BTG3在非小细胞肺癌进展中的表达也扮演一定的作用，后续实验继续研究BTG3和miR-106b之间的调控关系。

综上所述，本实验研究验证了miR-106b通过调控BTG3的表达，在非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡和侵袭过程中的促进作用，下调其表达后抑制其恶性侵袭生物学行为。然而，由于非小细胞肺癌样本数量和细胞类型的限制，miR-106b在非小细胞肺癌肿瘤发生中的其他相关生物学功能以及miR-106b和BTG3之间相关性的进一步机制需要更详尽的研究来阐述，后续实验完成更多机制的探讨，为miR-106b和BTG3在非小细胞肺癌中的临床靶向应用提供更多的理论依据。

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