卵巢癌是妇科最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均有升高的趋势。卵巢癌患者早期通常无明显症状，因此，患者临床诊断时通常处于中晚期，预后较差。顺铂是DNA复制过程的抑制剂，高浓度的顺铂具有抑制RNA和蛋白质合成的作用，已经在多种恶性肿瘤患者中显示出了一定的效果〔1-2〕。程序性细胞死亡基因(PDCD)具有多个单核苷酸多态性位点，与多种疾病的发病过程密切相关〔3-4〕。本研究对PDCD1通过调控细胞凋亡信号通路增强卵巢癌患者对顺铂的化疗敏感性进行研究，为临床治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析本院2013年1月至2016年1月期间诊治的接受顺铂化疗的卵巢癌患者的临床资料。200例患者年龄36～48岁，平均42.5±10.4岁，且均符合2000年国际妇产科联盟制定的关于卵巢癌的诊断标准。患者经顺铂治疗后部分缓解患者70例，稳定患者80例，疾病进展患者50例。以本院同期健康体检者100例为对照组。各组患者在一般资料方面无统计学差异性(P>0.05)。所有参与研究者均知情并签署知情同意书，获得医院伦理委员会批准。

1.2 观察指标 观察卵巢癌患者PDCD1蛋白的表达水平，分析PDCD1基因单核苷酸多态性与患者对顺铂的化疗敏感性的关系，检测不同敏感性患者细胞凋亡蛋白Bax/BCl2及Caspase3的表达。

1.3 Western Blotting法 提取总蛋白后以等量总蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；依据SDS-PAGE凝胶的大小选择合适大小的PVDF膜进行转膜(100 V，1.5 h)；转膜完成后以5%脱脂牛奶室温封闭1 h；1∶300稀释一抗后室温孵育杂交2 h；将杂交好的PVDF膜转入洗膜盒中加入适量的磷酸缓冲液中洗涤3次，每次10 min；1∶250倍稀释二抗后孵育杂交2 h；将PVDF膜转入洗膜盒中洗涤3次，每次10 min；显影拍照。

1.4 酶联免疫吸附法(ELISA)检测蛋白水平 Bax及Bcl2蛋白ELISA检测试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，Caspase3蛋白ELISA检测试剂盒购自Omega公司。所有操作过程均按照试剂盒说明书进行。

1.5 统计分析 数据统计采用SPSS 19.0统计软件完成，计量资料用平均数±标准差表示，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，总体比较有差异再采用χ2检验进行两两比较。P<0.01为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢癌患者PDCD1基因的表达水平分析 由图1可见，卵巢癌患者血清中PDCD1基因的表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

 

  

图1 卵巢癌患者PDCD1基因的表达水平注：与对照组比较：*P<0.01

2.2 PDCD1基因7872单核苷酸多态性与卵巢癌患者顺铂的化疗敏感性的相关性分析 由表1可见，与对照组相比，卵巢癌组患者PDCD1基因7872-C/T位点C比例明显降低，且随着患者对顺铂敏感性的降低，C核苷酸比例逐步下降(P<0.01)。

2.3 PDCD1基因8162单核苷酸多态性与卵巢癌患者顺铂的化疗敏感性的相关性分析 由表2可见，与对照组相比，卵巢癌组患者PDCD1基因8162-G/A位点G比例明显降低，且随着患者对顺铂敏感性的降低，G核苷酸比例逐步下降(P<0.01)。

2.4 不同顺铂敏感性患者细胞凋亡相关蛋白的表达分析 由表3可见，7872-C和8162-G患者的Bax、Caspase3水平明显高于7872-T和8162-A患者(P<0.01),而Bcl2明显低于7872-T和8162-A患者(P<0.01)。

 

表1 PDCD1基因7872单核苷酸多态性与卵巢癌患者顺铂的化疗敏感性的相关性分析〔n(%)〕

  

组别CT对照组(n=100)91(91.0)9(9.0)卵巢癌组 部分缓解组(n=70)57(81.4)13(18.6) 稳定组(n=80)42(52.5)38(47.5) 进展组(n=50)21(42.0)29(58.0)χ28.579.33P0.00150.0023

 

表2 PDCD1基因8162单核苷酸多态性与卵巢癌患者顺铂的化疗敏感性的相关性分析〔n(%)〕

  

组别GA对照组(n=100)87(87.0)13(13.0)卵巢癌组 部分缓解组(n=70)45(64.3)25(35.7) 稳定组(n=80)40(50.0)40(50.0) 进展组(n=50)23(46.0)27(54.0)χ29.427.40P0.00190.0035

 

表3 不同顺铂敏感性患者细胞凋亡相关蛋白的表达分析

  

类别Bax/β-actinBcl2/β-actinCaspase3/β-actinχ2P7872位点 C0.50±0.090.28±0.040.39±0.0712.340.007 T0.36±0.080.51±0.100.31±0.058162位点 G0.47±0.060.33±0.060.41±.0811.050.009 A0.26±0.090.47±0.060.35±0.07

3 讨论

恶性肿瘤的发病率和死亡率不断升高已经成为严重的医学和社会问题。虽然目前治疗手段不断进步，但患者对化疗药物敏感性的差异也给临床治疗带来了极大的困扰。因此，筛选药物敏感个体进行针对性治疗，防止耐药性的发生具有重要的临床价值。顺铂是临床上用于恶性肿瘤的重要化疗药物，且取得了一定的效果〔5〕。但部分恶性肿瘤患者对顺铂不敏感，导致治疗效果较差。本研究在对PDCD1通过调控细胞凋亡信号通路增强卵巢癌患者对顺铂的化疗敏感性进行研究时发现，卵巢癌患者血清中PDCD1基因的表达明显高于对照组；卵巢癌组患者PDCD1基因7872-C/T位点C和8162-G/A位点G比例明显降低，且随着患者对顺铂敏感性的降低上述变化越明显；7872-C和8162-G患者的Bax、Caspase3水平明显高于7872-T和8162-A患者，而Bcl2明显低于7872-T和8162-A患者。因此，卵巢癌患者对顺铂的化疗敏感性与PDCD1单核苷酸多态性及其调控的细胞凋亡过程有关。

程序性细胞死亡基因是与多种恶性肿瘤的发病及恶化过程密切相关的生物大分子，与肿瘤细胞的生长及转移和耐药性密切相关〔6-7〕。在分析miR103通过靶向PDCD10逆转顺铂诱导的前列腺癌细胞耐药的研究中发现，miR103通过靶向PDCD10抑制P-gp的表达，逆转前列腺癌细胞的耐药性〔8〕。在分析子宫内膜异位症相关卵巢癌患者PDCD4、PDCD5蛋白的表达及临床意义时也证实，通过检测患者PDCD4、PDCD5蛋白的表达水平,可以有效地诊断患者病情的恶化程度，了解病情发展情况,明确病情类型,有助于患者病情的控制和治疗〔9〕。以往的研究也发现PDCD5在子宫内膜癌组织中低表达，与子宫内膜癌临床病理特征及不良预后显著相关，并能够通过促进子宫内膜癌细胞凋亡进而抑制细胞增殖及克隆形成,PDCD可能参与子宫内膜癌发生发展进程，并可作为早期诊断及预后评价的重要分子〔10〕，提高PDCD4的表达，能显著地诱导甲状腺癌SW579细胞凋亡，进而抑制癌细胞侵袭能力〔11〕。丁玲玲等〔12〕也发现PDCD4在PCOS妇女中出现高表达,其中肥胖亚组PDCD4表达增强尤为显著，其在PCOS妇女中的高表达与其肥胖指数、胰岛素抵抗、脂代谢紊乱密切相关〔13〕。以往的研究也发现PDCD4基因表达于宫颈癌细胞核和胞浆内，并且PDCD4能够抑制Bcl-2基因的表达水平〔14〕，且EGF促进HaCaT细胞miR-21的表达,抑制HaCaT细胞PDCD4的表达水平〔15〕。

PDCD在影响肿瘤细胞生理活动的过程中可能与其调控细胞凋亡有关。在分析MiR-183调控PDCD4表达对SW1990胰腺癌细胞生长调节作用的研究中也发现，miR-183拮抗剂体外能抑制胰腺癌细胞增殖，促进凋亡和阻滞细胞周期,且可能通过靶向调节PDCD4基因发挥其调节作用〔16〕。在分析三阴性乳腺癌中程序性细胞死亡基因4表达及其与预后关系的研究中也发现，三阴性乳腺癌中PDCD4表达缺失与预后不良相关，PDCD4可作为评估三阴性乳腺癌预后的指标〔17〕。以往的研究也发现，miR-21和程序性细胞死亡基因4在食管鳞癌中有明显的参与性，miR-21表达升高、PDCD4表达降低在ESCC的发展、侵袭、转移中起一定的作用〔18〕。本研究也发现卵巢癌患者血清中PDCD1基因的表达明显高于对照组。因此，卵巢癌患者对顺铂的化疗敏感性与PDCD1单核苷酸多态性及其调控的细胞凋亡过程有关。

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