随着序贯培养基的应用和改进，胚胎在体外培养至囊胚期已成为现实，研究已证实囊胚移植可以提高临床妊娠率及胚胎着床率，降低多胎率。然而，由于缺乏有效指标判断卵裂期胚胎发育成囊胚的能力，行囊胚培养仍存在无囊胚形成而取消移植的风险。常规体外受精（IVF）第3天可用胚胎冷冻保存，后解冻胚胎在体外培养2～3 d将形成囊胚者进行移植，是目前冻融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer，FET）的一种新尝试。本研究旨在探讨冻融胚胎囊胚培养的最佳培养时间，为其临床开展提供一定的依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 回顾性分析2013—2016年在江门市中心医院行冻融胚胎囊胚培养477例患者共520周期的资料。纳入标准：①均以人工周期准备内膜行FET；②确定移植日子宫内膜厚度均≥8 mm，且无内膜异常回声和宫腔积液等情况；③胚胎冷冻均用玻璃化快速冷冻法。依据胚胎复苏时间不同分为D2组（D2 15：00—16：00胚胎复苏）、D3组（D3 8：00—9：00胚胎复苏）。

1.2 研究方法

建筑工程管理模式的创新是当下企业制度改革发展的需要与前提。建筑工程管理在整体工程施工中起着决定性的作用，是工程施工与建筑企业之间的必然联系，其中建筑工程管理对工程的施工进度与施工质量的影响颇大。现阶段我国建筑企业由传统的工程管理模式向现代化的管理模式逐渐转变，现代企业制度的改革与创新必须与时俱进，紧跟时代发展潮流，在项目管理、施工管理与成本管理等诸多方面进行创新与改革，为建筑企业的蓬勃发展打下坚实基础。因此，建筑工程管理模式的创新在整个企业制度改革中就凸显必要[1]。

1.2.1 胚胎冻融技术 采用加藤冷冻及解冻试剂盒（Kitazato，日本）进行玻璃化快速冷冻，按其说明书进行操作。1.2.2 人工周期内膜准备 采用逐渐增量方案，于月经第3～5天开始口服戊酸雌二醇（补佳乐，德国拜耳公司）6～8 mg/d，根据内膜的生长情况调整给药的剂量及时间，每5～7 d增加2 mg/d，最大剂量10～16 mg/d。当口服戊酸雌二醇时间≥14 d、内膜厚度≥8 mm，并测血孕酮（P）水平＜1.0 ng/mL，即以肌内注射（肌注）黄体酮（浙江仙琚制药股份有限公司）进行内膜的转化，此时为D0。

1.2.4 胚胎评价标准 卵裂期胚胎采用两种胚胎评价标准：双项评价，主要依据胚胎的对称性、无核碎片的比例，将胚胎评级为：A（等大、碎片≤5%）、B（不等大、无碎片或等大、碎片≤25%）、C（等大或不等大、碎片≤50%）、D（碎片＞50%），同时记录胚胎的卵裂球数，以4A、8B等表示；多点评分，对胚胎的卵裂球数目、对称性和多核、碎片、空泡等进行详细记录。将D3的7～9细胞B级以上的胚胎视为优质胚胎。复苏胚胎超过一半细胞保持完整定义为存活胚胎。解冻后胚胎进行重新评级。囊胚采用Gardner人类囊胚分级系统[1]（scoring system for human blastocysts），将 D5评分≥3BB、D6评分≥4BB定为优质囊胚，将D5评分＞3CC、D6评分＞4CC定为可用囊胚。

2.6 不同培养时间妊娠率比较 不同培养时间移植周期的临床妊娠率、胚胎种植率：48 h组＞65 h组＞72 h组＞89 h组；而生化妊娠率：89 h组＞48 h组＞65 h组＞72 h组，但各组间比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表7。

本文选择于2016-2017年到我院接受治疗,并在手部留置针的儿童患儿100例,将患儿随机分为常规组和改进组两组。其中,常规组有25例男性患儿和25例女性患儿,患儿年龄在9个月-4岁之间;改进组有27例男性患儿和23例女性患儿,患儿年龄在8个月-5岁之间。

2.3 2组妊娠结局比较 D2、D3组移植周期数分别为254、213个，D2组单囊胚移植率低于D3组，移植胚胎数占囊胚形成数比例高于D3组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；D2组临床妊娠率、平均移植胚胎数、双胎率和活产率均略高于D3组，而生化妊娠率、胚胎种植率均略低于D3组，但差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表4。

1.3 统计学方法 数据分析使用SPSS 18.0统计学软件。定量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；定性资料用例（%）表示，组间比较采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.2 2组囊胚形成率比较 2组解冻优胚率、解冻全存活胚胎率和解冻一半以上活胚胎率比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。2组囊胚形成率、优胚/非优胚囊胚形成率、优质囊胚形成率及优胚/非优胚优质囊胚形成率差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表3。

 

表1 2组患者一般资料比较

  

注：*有27例患者既在D2组，又在D3组。

 

新鲜周期Gn总量（U） Gn总天数（d） 获卵数 可用胚胎数 优质胚胎数D2组 273 31.07±4.41 21.81±3.25 4.26±3.00 2.66±1.37 2 640.20±927.03 11.83±1.86 15.997±6.79 9.64±4.61 6.15±4.01 D3组 231 31.90±4.14 21.67±3.08 4.58±3.31 2.85±1.53 2 784.52±953.41 11.98±2.03 15.850±6.45 8.90±4.14 5.55±3.55 t-1.942 0.476 -1.165 -1.465 -1.842 -0.893 0.236 1.864 1.766 P 0.061 0.634 0.244 0.143 0.092 0.372 0.814 0.063 0.078组别 n* 年龄（岁） （kg/m2） 不孕年限 既往移植次数BMI

2.1 2组患者一般资料比较 520个解冻周期，D2组：273例患者，283个解冻周期，取消移植29个周期（28个周期无囊胚/无可用囊胚形成，1个周期因患者原因取消移植）；D3组：231例患者，237个解冻周期，取消移植24个周期（20个周期无囊胚/无可用囊胚形成，4个周期因患者原因取消移植）。2组患者年龄、体质量指数（BMI）、不孕年限、既往移植次数、胚胎所来源的新鲜周期促性腺激素（Gn）总量、Gn总天数、获卵数、可用胚胎数和优质胚胎数差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。

通过对学生课业学习质量等教育大数据资源的多尺度分析、数据集成、关联模式分析和数据深度挖掘分析，各高校能够透析学生的质量和学习行为之间的联系，对于学生作出具有个性化、全面化的综合分析报告、舆情分析、情感变化和能力分析，有助于学生的个性化学习方案制定与全方位能力评估。

 

表2 2组解冻胚胎情况比较 [n（%）]

  

注：解冻全存活胚胎指胚胎细胞均存活。解冻一半以上活胚胎指胚胎细胞存在裂解（死亡），存活细胞≥1/2。

 

解冻一半以上活胚胎率D2组 1 262 601（47.62） 1 085（85.97） 104（8.24）D3组 1 129 500（44.29） 955（84.59） 101（8.95）χ2 2.669 0.915 0.378 P 0.102 0.339 0.539组别 解冻胚胎数解冻优胚率解冻全存活胚胎率

1.2.5 观察指标 囊胚形成率、优质囊胚形成率、临床妊娠率、生化妊娠率、胚胎种植率和活产率等。囊胚形成率=囊胚形成数/囊胚培养胚胎数×100%，优胚囊胚形成率=优胚囊胚形成数/优胚数×100%，非优胚囊胚形成率=非优胚囊胚形成数/非优胚数×100%，优质囊胚率=优质囊胚形成数/囊胚形成数×100%，优质囊胚形成率（优胚）=优胚形成优质囊胚数/优胚数×100%，优质囊胚形成率（非优胚）=非优胚形成优质囊胚数/非优胚数×100%，单囊胚移植率=单囊胚移植周期数/移植周期数×100%，临床妊娠率=临床妊娠数/移植周期数×100%，生化妊娠率=生化妊娠数/移植周期数×100%，平均移植胚胎数=移植胚胎数/移植周期数×100%，胚胎种植率=孕囊数/移植胚胎数×100%，双胎率=双胎妊娠数/临床妊娠数×100%，活产率=活产分娩数/移植周期数×100%。

2.4 D5与D6移植妊娠结局比较 D5移植临床妊娠率、生化妊娠率和胚胎种植率均高于D6，但差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表5。

不同浓度带壳、不带壳烘焙种籽衣提取液对DPPH·清除能力影响结果分别见表 1和表 2。由DPPH·清除能力的半抑制浓度（IC50）可知，带壳烘焙过程中，DPPH·清除能力在20 min时上升随后继续下降，在 20 min时达到最高；不带壳烘焙过程中，DPPH·清除能力在20 min和40 min上升，在20 min时最高。其中不带壳烘焙20 min的DPPH·清除能力最高，IC50值为0.16 mg/mL，低于未烘焙样品IC50值0.17 mg/mL，说明其DPPH·清除能力高于未烘焙样品。

2.5 不同培养时间囊胚形成率比较 优胚与非优胚在48 h、65 h囊胚形成率分别为30.37%vs.13.28%、62.64%vs.40.14%，差异有统计学意义（均P＜0.05）；优胚与非优胚在72 h、89 h囊胚形成率分别为32.32%vs.27.59%、2.17%vs.2.06%，差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表6。

1.2.3 囊胚培养、胚胎移植、黄体支持及妊娠判定 胚胎复苏时间：D2组D2 15：00—16：00、D3组D3 8：00—9：00时进行囊胚培养。采用Quinn′s Adavantage序贯培养液（SAGE，Biopharma）或Vitrolife序贯培养液（Vitrolife，瑞典）及其相关的试剂产品，按其说明书进行操作。于D5 8：00—9：00时观察，若当天形成可用囊胚即移植，此时D2、D3组培养时间分别为65 h、48 h；若未形成可用囊胚则D6 8：00—9：00时再观察，若D6形成可用囊胚即移植，此时D2、D3组培养时间分别为89 h、72 h。移植囊胚数1～2个。若形成囊胚数≥3个时将多余囊胚再次进行玻璃化冷冻。移植后继续激素替代直至10 d，测尿人绒毛膜促性腺激素（hCG）及血β-hCG确定是否妊娠。如妊娠，移植后30 d左右B型超声（B超）检查确定临床妊娠及妊娠胎数。妊娠后继续激素维持，孕8～9周可开始逐渐减量，孕11～12周停药。

3 讨论

如何挑选出最具发育潜能的单个胚胎进行移植，以确保较高妊娠率、避免多胎妊娠所带来的母婴并发症[2]是体外受精-胚胎移植（IVF-ET）所面临的困惑之一。囊胚培养有利于挑选更优质的胚胎，且囊胚移植更符合生理[3-4]，使胚胎发育与子宫内膜同步化，因此目前倾向于将卵裂期胚胎继续培养至囊胚期进行移植[5]，提高移植周期的临床妊娠率和活产率[6]，同时降低多胎妊娠的发生率。然而，目前依然缺乏有效的指标判断卵裂期胚胎发育成囊胚的能力[7]，难以避免无囊胚移植的风险[8]。随着二胎政策放开，既往通过辅助生殖技术（ART）已生育的妇女以及大量高龄妇女选择再次生育，此类患者中不乏存在瘢痕子宫、高龄及内科疾病等双胎高危因素，冻融胚胎解冻行囊胚培养后单囊胚移植能降低多胎妊娠率；高龄及卵巢储备低下的患者可以通过多次取卵后冷冻卵裂期胚胎，后解冻行囊胚培养挑选出更具发育潜能的胚胎，提高此类患者妊娠结局。

本研究采用2个时间点进行胚胎解冻，D2组和D3组的囊胚形成率分别为48.10%、46.59%，优质囊胚率分别为39.70%、34.22%，差异无统计学意义；且2组临床妊娠率、生化妊娠率和胚胎种植率比较差异均无统计学意义。说明囊胚培养的时间长短不影响囊胚形成，囊胚最终的形成与胚胎发育潜能有关，2个时间点解冻胚胎行囊胚培养都是可行的，可以根据工作需要而选择胚胎解冻时机。

 

表3 2组囊胚形成率比较 [%（n/n）]

  

组别D2组D3组χ2 P囊胚培养胚胎数1 262 1 129优质囊胚形成率（非优胚）48.10（607/1 262） 60.07（361/601） 37.21（246/661） 39.70（241/607） 26.46（159/601） 12.41（82/661）46.59（526/1 129） 57.80（289/500） 37.68（237/629） 34.22（180/526） 23.80（119/500） 9.70（61/629）0.544 0.580 0.029 3.628 1.020 2.397 0.461 0.461 0.864 0.570 0.313 0.122囊胚形成率 优胚囊胚形成率 非优胚囊胚形成率 优质囊胚率 优质囊胚形成率（优胚）

 

表4 2组患者妊娠结局比较

  

注：平均移植胚胎数用s表示，单囊胚移植率、移植胚胎数/囊胚形成数、临床妊娠率、生化妊娠率、胚胎种植率、双胎率和活产率用%（n/n）表示。

 

组别 移植周期数 单囊胚移植率 移植胚胎数/囊胚形成数 临床妊娠率 生化妊娠率 移植胚胎总数 平均移植胚胎数 胚胎种植率 双胎率 活产率D2组 254 24.02（61/254） 73.64（447/607） 70.08（178/254） 7.48（19/254） 447 1.76±0.03 55.93（250/447） 38.76（69/178） 59.05（150/254）D3组 213 39.91（85/213） 64.83（341/526） 69.48（148/213） 7.98（17/213） 341 1.60±0.03 58.06（198/341） 33.78（50/148） 54.93（117/213）χ2或t 13.61 10.332 0.019 0.410 - 0.967 0.360 0.865 0.805 P 0.000 0.001 0.889 0.840 - 0.334 0.549 0.352 0.370

 

表5 D5与D6移植妊娠结局比较 [%（n/n）]

  

囊胚移植时间胚胎种植率D5 354 72.03（255/354） 8.47（30/354） 614 57.82（355/614）D6 113 62.83（ 71/113） 5.31（ 6/113） 174 53.45（ 93/174）χ2 3.441 1.206 - 1.055 P 0.640 0.272 - 0.304移植周期数临床妊娠率生化妊娠率移植胚胎数

 

表6 不同培养时间囊胚形成率比较 [%（n/n）]

  

培养时间（解冻天数-移植天数）优胚囊胚形成率非优胚囊胚形成率 χ2 P 48 h组（3-5） 30.37（140/461） 13.28（77/580） 45.800 0.000 65 h组（2-5） 62.64（347/554） 40.14（234/583） 57.542 0.000 72 h组（3-6） 32.32（149/461） 27.59（160/580） 2.759 0.097 89 h组（2-6） 2.17（12/554） 2.06（12/583） 0.016 0.899

 

表7 不同培养时间妊娠率比较 [%（n/n）]

  

培养时间（解冻天数-移植天数） 临床妊娠率 生化妊娠率 胚胎种植率48 h组（3-5） 75.23（82/109） 11.01（12/109） 60.99（111/182）65 h组（2-5） 70.61（173/245） 7.35（18/245） 56.48（244/432）72 h组（3-6） 63.46（66/104） 4.81（5/104） 54.72（87/159）89 h组（2-6） 55.56（5/9） 11.11（1/9） 40.00（6/15）χ2 4.450 3.091 3.326 P 0.217 0.378 0.344

然而在4个不同囊胚培养时间囊胚形成率不同。D2组优胚和非优胚在65 h囊胚形成率分别为62.64%、40.14%，在89 h囊胚形成率仅2.17%、2.06%，说明D2组胚胎在D5时已形成了绝大部分囊胚，患者即可进行胚胎移植。而D3组优胚在48 h、72 h囊胚形成率分别为30.37%、32.32%，非优胚在48 h、72 h囊胚形成率分别为13.28%、27.59%，因此D3组优胚在D5、D6均有可能形成囊胚，而非优胚则需要培养较长的时间才能形成囊胚，常需要等到D6才能移植。这说明胚胎发育潜能不同将导致囊胚形成所需时间不同，发育潜能好的胚胎发育速度更快。

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已有研究表明新鲜周期D6囊胚移植的临床妊娠率及胚胎种植率均低于D5囊胚，源于D6子宫内膜对胚胎容受性低于D5[9]。在囊胚冻融周期，多数学者研究表明D5与D6囊胚解冻后的妊娠结局相当[10-12]。Yang等[3]近期研究表明在冻融周期中，D5、D6囊胚的非整倍体率并无差异，D6优质囊胚的发育潜能以及妊娠结局与D5优质囊胚是一样的，但D6非优质囊胚的临床妊娠率、胚胎种植率均显著低于D5非优质囊胚，因此，Yang等认为D5与D6妊娠结局差异来源于非优质囊胚。Sunkara等[13]的荟萃分析也得出类似的结论。而本研究中胚胎冷冻是在卵裂期，解冻后再行继续培养至囊胚期，胚胎在卵裂期与囊胚期对冷冻承受能力应是有差异的。通常认为种植窗持续4～5 d，在28天月经周期中种植窗为月经第20～24天[14]。已有证据表明，刺激周期的种植窗比自然周期提早1～2 d[14]。本研究均是以人工周期进行内膜准备，接受囊胚移植的子宫内膜是黄体酮转化的D5或D6；随着培养时间延长，临床妊娠率和胚胎种植率均有所下降（48 h组＞65 h组＞72 h组＞89 h组）；D5移植妊娠率、胚胎种植率均高于D6移植，然而差异均无统计学意义。D2组单囊胚移植率低于D3组、移植胚胎数占囊胚形成数比例高于D3组，差异均有统计学意义。D2组临床妊娠率、双胎率较D3组均有所提高，但差异均无统计学意义。笔者认为在人工周期中黄体酮转化的D5与D6均是子宫内膜的种植窗，对囊胚的容受性相似；然而囊胚阶段可分为6期，D5与D6接受囊胚的期别是否有所不同，这需要做进一步精细的研究；培养时间延长，胚胎发育潜能下降，可移植胚胎数增加，移植数的增加在一定程度上弥补了胚胎发育潜能下降。因此，随着培养时间延长，冻融胚胎囊胚培养的临床妊娠率、胚胎种植率下降，源于胚胎发育潜能、胚胎发育与子宫内膜同步性和可移植胚胎数等综合因素共同作用。

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