0 引言

卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)又称金鲳鱼,肉嫩味美,广泛养殖于热带、亚热带海域,为重要的海产经济鱼类[1].其养殖病害、营养成分及饲养方式等问题均有研究报道[2].如诺卡氏菌病及寄生虫病的防治研究[3-5]、肌肉脂肪酸组成分析[6]和饵料投喂方式、饲料成分对生长状况的影响等[7-9].随着养殖规模的扩大,卵形鲳鲹因苗种来源范围较窄,出现了生长慢、成活率低、病害多、品质差等种质退化现象[10].作为海南省网箱养殖的主要品种,卵形鲳鲹苗种流动频繁,其养殖亲本可能存在近亲繁殖现象并导致近交衰退.加之卵形鲳鲹养殖与野生群体间可能存在基因交流,亦可导致野生群体的遗传多态性降低.

随着高通量测序技术的发展,微卫星标记得以快速开发并应用于卵形鲳鲹遗传多态性及遗传结构分析.如陈秀荔等[11]筛选获得了35个可用于卵形鲳鲹遗传多态性分析的微卫星标记.孙立元等[12]鉴定了21对用于卵形鲳鲹遗传多样性分析的微卫星分子标记,并筛选了一批RAPD(randomly amplified polymorphic DNA)及AFLP(amplified fragment length polymorphism)扩增引物.赵永贞等[1]利用微卫星标记对湛江、海南、钦州和北海四个不同地理种群卵形鲳鲹的遗传多态性进行了分析.吉磊等[13]对海南、深圳、福建三个地区卵形鲳鲹养殖群体的遗传差异进行了分析.

目前尚未见到对三亚海区卵形鲳鲹养殖群体和野生群体遗传多态性的检测、比较分析以及与鱼体生长性状关联分析的相关报道.本研究拟利用微卫星标记对三亚海区这两种群体的遗传多态性进行比较分析并尝试寻找与生长性状相关联的标记,以期为研究大规模养殖卵形鲳鲹可能对野生群体遗传多态性产生的影响和分子标记辅助选育提供科学基础.

1 材料和方法

1.1 样品采集及DNA提取

实验所用的卵形鲳鲹源自两个群体,其中一个群体为购自三亚的养殖群体(26尾),另一个群体为三亚海域捕捞的野生群体(25尾).对两个群体所有个体的生长性状进行逐一测量,共包含全长、体高、体宽和体质量四个性状.随后采集所有个体的肌肉组织于75%酒精中保存.肌肉样品DNA的提取依照广州美基公司的核酸提取试剂盒说明书操作.提取后的DNA稀释于超纯水中,利用1.3%琼脂糖凝胶电泳分析DNA的完整性.

1.2 微卫星位点的筛选

基于构建的大、小极端性状值卵形鲳鲹亚群转录组文库测序转录本(数据待发表),利用MicroSAtellite 软件从中发掘微卫星位点.利用Primer Primier 5.0软件共设计15对微卫星位点检测引物,对随机选取的12尾卵形鲳鲹DNA样品行PCR扩增及3.0%琼脂糖电泳检测,以初步判断微卫星位点的真实性及多态性.微卫星PCR的反应体系为:10 μL 2×Taq Mix (vazyme),7 μL H2O,正、反引物各1 μL,加1 μL DNA作模板.PCR反应程序为:95 °C变性3 min;30 个循环的95 °C,30 s;54 °C～60 °C退火30 s(不同引物对退火温度不同);72 °C 延伸1 min;最后在 72° C 延伸2 min.

1.3群体遗传多态性分析

作为海水养殖的主要品种,卵形鲳鲹养殖群体已出现生长慢、成活率低、病害多、品质差等种质退化问题[10].加上人工网箱养殖规模的不断扩大,养殖群体与野生群体之间可能存在基因交流,容易导致不利性状累积,影响优质鱼的产出.对三亚卵形鲳鲹养殖及野生群体开展遗传多态性评估及基因型与性状关联分析,具有重要的现实意义.

1.4数据分析

利用采集到的三亚野生卵形鲳鲹群体和养殖卵形鲳鲹群体做微卫星遗传多态性检测及比较(图2).其中野生群体微卫星位点的Na从6至15,而养殖群体微卫星位点的等位基因数量从5至12.野生群体的平均有效等位基因数(Ne)为6.8959,取值范围从2.5880～12.2549;平均观测杂合度(Ho)为0.1346,取值范围从0.000～0.7600;平均期望杂合度(He) 为0.8348,取值范围从0.6261～0.9371.养殖群体的平均Ne为6.3027(2.0907～9.7656),平均Ho为0.1885 (0.0000～0.6923),平均He为0.8170(0.5328～0.9159).野生群体的平均多态信息含量(PIC)为0.7984 (0.5786～0.9125),养殖群体的平均PIC为0.7773(0.4909～0.8841).野生群体除一个微卫星位点(TO09)符合Hardy-Weinberg平衡外,其他位点均偏离该平衡;养殖群体除位点TO09和TO11符合Hardy-Weinberg平衡外,其他位点亦均偏离平衡 (表2).相对于三亚养殖群体,野生群体在平均Na、平均Ne、平均He及平均PIC值均较养殖群体高.

课堂引入、语言表达和课件设计，构成了学习者对授课教师课堂呈现效果的第一印象，属教学基本功范畴，是决定课堂精彩与否的基本标尺。对于授课教师尤其是青年教师而言，课堂引入的巧妙、语言表达的幽默和课件设计的精美会在较短的时间内吸引学生注意力、激发求知欲，顺利地开展教学。但过分地追求于此，则会使授课在深度上略显不足和欠缺，教师还应挖掘授课内容在字里行间的深意，洞悉各专业培养目标和成才标准，站在抚今追昔和继往开来的历史高度，带给学生发自心灵深处的思索与感悟。

2结果

2.1新微卫星标记的开发

总共合成15对引物用于微卫星检测,通过琼脂糖凝胶电泳初步检测发现其中12对引物能扩增出多态性产物(表1).其中图1所示为微卫星位点TO09位点的多态性检测,可见各样品扩增条带未处在完全一致的电泳位置,显示多态性.

从卵形鲳鲹大、小极端性状值亚群转录组测序所拼接的34186条转录组序列中共筛选出46708个SSR位点.其中11667条转录序列中含1个以上SSR位点.按微卫星类型来分,包括单碱基重复位点23114个,双碱基重复位点10718个,三碱基重复位点6703个,四碱基重复位点698个,五碱基重复位点170个,六碱基重复位点115个,以及复合微卫星位点5190个.

放电操作模式下,输入端为5节18650电池组,输出端负载电阻为30 Ω,保持输出端电压U1=30±0.5 V。记录输入电流I2和输入电压U2。则放电效率为:如表2所示。

  

图1 琼脂糖凝胶电泳检测TO09微卫星多态性

 

表1 微卫星检测引物及基本特征

  

微卫星名称引物序列(5′-3′)重复基序产物大小(bp)TO01TGTGAGTTCCTGACGCTTTGTGC177～240GATCTCCAGGCAGTCTGAGG

 

续表1

  

微卫星名称引物序列(5′-3′)重复基序产物大小(bp)TO02AGACAGGGGGAACAAGTGTGTG196～274GCTGGTTTTGATGGAGAAGCTO03GCTCACAGACACACACCACCAC174～348TGCTGCAGACTCTCTGTCGTTO04GTGAGCCACAGAAGCCTTTCGT148～216CACACCATCGTCAACTCCACTO05TTAGCTCGCCACAACACTTGGTTT262～390TTTTACAGGCCAAGAGCCATTO06GCCGGTCATGTAAGAGGAAACCT195～291GTGTGGAGGAGAACCAGGTCTO07ATGGAGCCCTGCAGTAAGAAAAT93～147GATGCGTTCTGCACAAAAGATO08GAAGGCCAACATCTGGTCATTG200～240GAATCATGCAGCAATCAGGATO09AGCGTCAGAGGAGCTGAATCCTT119～155TCGTCGTCATCGTTCTTCAGTO10TGTGAAGAAACCAGCCAGTGCA112～192GAAAGGAGAAGACATGTTAAGGCTO11AGTGTTTGTCTCCACCCGTCAC100～122ATCAGCCTGCTGGAATGTGTO12ACAGGAACAAGCATCCCAAGGTG246～372TGATTTGGATGTCACGCAGT

注:N表示样本数;Na表示等位基因数;Ne表示有效等位基因数;Ho表示观测杂合度;He表示平均期望杂合度;PHWE 表示偏离Hardy-Weinberg平衡概率;PIC表示多态信息含量.

2.2 养殖和野生群体遗传多态性比较

卵形鲳鲹微卫星各标记基因型与其生长性状的关联分析通过SPSS19.0软件的单因素方差分析进行,显著性阈值设置为P<0.05.

微卫星标记因具备高多态性和共显性等优势,已广泛应用于分子遗传学分析.应用微卫星位点作遗传分析的第一步是获得可用的多态性微卫星位点.其位点的获取方法很多,包括从公共数据库中获取已提交的微卫星位点信息,利用相近物种中已报道的微卫星位点作转移扩增或者从高通量测序所得序列中筛选微卫星位点[14].本研究利用处于群体性状值端值的两个亚群转录组序列,获得了46708个SSR位点.从这批微卫星位点中挑选了重复次数在5次以上的15个位点设计引物,其中12对引物扩增产物表现出多态性.说明利用转录组测序开发卵形鲳鲹微卫星标记是有效可行的途径,为今后大规模筛选可利用微卫星标记提供了基础.

  

图2 TO10微卫星位点PAGE电泳

 

表2 卵形鲳鲹12对微卫星引物群体多态性分析

  

群体微卫星NNaNeHoHePHWEPIC三亚野生TO0125118．33330．08000．89800．000．8684TO022485．05260．29170．81910．000．7747TO03251512．25490．00000．93710．000．9125TO042585．53100．00000．83590．000．7964TO0525149．84250．04000．91670．000．8902TO062395．45360．00000．83480．000．7984TO072473．00000．08330．68090．000．6308TO082463．74030．00000．74820．000．6955TO0925138．27810．76000．89710．320．8686TO1023129．61820．00000．91590．000．8870TO112562．58800．36000．62610．000．5786TO1225129．05800．00000．90780．000．8797均值10．086．89590．13460．83480．7984三亚养殖TO012673．48450．26920．72700．000．6726TO022453．68050．04170．74380．000．6811TO0326107．68180．00000．88690．000．8567TO042697．04170．00000．87480．000．8425TO0524107．89040．08330．89180．000．8616TO0625129．05800．12000．90780．000．8796TO072298．06670．27270．89640．000．8630TO0824127．02440．00000．87590．000．8452TO092682．97800．69230．67720．090．6138TO1025119．76560．20000．91590．000．8841TO112452．09070．58330．53280．110．4909TO122386．87010．00000．87340．000．8368均值8．836．30270．18850．81700．000．7773

注:N表示样本数;Na表示等位基因数;Ne表示有效等位基因数;Ho表示观测杂合度;He表示平均期望杂合度;PHWE 表示偏离Hardy-Weinberg平衡概率;PIC表示多态信息含量.

2.3 微卫星基因型与生长性状的关联分析

对三亚养殖群体与野生群体个体的全长、体宽、体高和体质量性状值与微卫星位点各基因型之间作单因素方差分析以寻找与高性状值显著关联的优势基因型.发现TO01位点的DD 基因型(231 bp 纯合子)为卵形鲳鲹全长的优势基因型(98.62±6.16 mm),显著高于HH基因型(189 bp 纯合子)个体对应的全长均值(85.58±15.43 mm),概率值P为0.021.而TO01微卫星位点的DD 基因型(231 bp 纯合子)亦是体高的优势基因型(44.15±2.27 mm),显著高于HH基因型(189 bp 纯合子,40.26±3.74 mm)和CC基因型(213 bp 纯合子,38.64±3.66 mm).TO03微卫星位点的AA基因型(300 bp 纯合子,97.87±6.84 mm)为卵形鲳鲹全长的优势基因型;而TO03微卫星位点的BB基因型(320 bp 纯合子,11.17±3.00 mm)为体宽性状的优势基因型.此外,TO04位点的200 bp 纯合子个体的全长值显著低于其他所有基因型个体对应值,而该位点的188 bp纯合子为全长的优势基因型.

3结论与讨论

利用12对筛选出的可用微卫星引物对三亚养殖群体和野生群体肌肉组织DNA作PCR.经琼脂糖电泳、6% PAGE电泳和显色后利用LabImage version 2.7.1软件对PCR产物条带大小进行判读.使用Popgen 32 软件分别计算两个群体的遗传多态性参数值,包括等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)、Hardy-Weinberg 平衡遗传偏离概率(PHWE ).利用PIC-CALC软件计算多态信息含量(PIC).

GPU的核数远超CPU，被称为众核，如Tesla P100有3 584个核。每个核拥有的缓存大小相对小，数字逻辑运算单元也少而简单，GPU面对的则是类型高度统一的、相互无依赖的大规模数据和不需要被打断的纯净的计算环境。

余锋：有数据显示，2018年上半年中国石化全行业规模以上企业与去年年底相比减少了1000多家。这其中有相当一部分是消耗高、生产技术水平落后、达不到环保要求的企业。通过环保治理淘汰了这些落后产能，先进产能将获得更大市场空间。这是合规企业的机遇。

通过对三亚养殖群体和野生群体的遗传多态性综合分析,结果显示野生群体的平均Na、平均Ne、平均He及平均PIC值均较养殖群体高,表明野生群体总体上具有较养殖群体更高的多态性.如野生群体的平均多态信息含量(PIC)为0.7984,略高于养殖群体的平均PIC(0.7773).虽然这与常规情况下野生群体的遗传多态性高于养殖群体的遗传多态性基本一致,但遗传多态性差异不明显,应该在保护野生卵形鲳鲹种质多样性方面引起注意.如加强养殖群体的防逃管理以避免种质资源随意混合等.本研究中两个群体的平均PIC较孙立元等[12]等分析的海南三亚育种群体平均PIC(0.509)和海南、深圳、福建三个地区的卵形鲳鲹养殖群体平均PIC(0.49～0.55)高.其原因可能是因为育种群体经过不断的筛选,发生了遗传的定向选择,其多态性有所降低.此外,本研究中所用微卫星位点在两个群体中的分型结果显示大多数位点杂合子缺失,这与吉磊等[13]发现的海南和深圳养殖群体表现的杂合子过剩不同.不同微卫星标记的选择,研究群体的选择以及采样地点的选择等均是导致遗传结构差异的可能原因.该研究中除了TO09和TO11两个微卫星位点外,其他位点在三亚养殖和野生群体中都表现为偏离哈代温伯格平衡.其原因可能是卵形鲳鲹生长期间拥有杂合子位点的个体被各类自然环境因素筛选所淘汰.

微卫星标记近年来多用作基因型与生长性状的关联分析.如研究发现镜鲤 22个微卫星标记与其体长、体高、体厚、头长等生长相关性状显著相关(P<0.05) [15].基于转录组测序所发掘的微卫星位点大部分位于外显子序列上,其微卫星多态性具有更大可能性直接影响性状的形成.本研究表明多个微卫星位点各自不同基因型个体间性状存在显著差异.可以从这些微卫星位点中发掘对应优势生长性状的基因型,经进一步验证后用于育种亲本的分子性状辅助选育.通过多个优势微卫星基因型在亲本的不断选择和聚合,有可能培育出具有优良生长性状的子代个体.

脓毒症是由感染引起的机体免疫反应失调所致的可危及生命的严重疾病，常导致多器官功能障碍甚至衰竭[2]。血管内皮细胞和免疫细胞在机体炎症环境中功能障碍可导致血管通透性增加、血栓形成及免疫反应失调，并导致多器官衰竭[3-4]。研究[1,5-7]表明，S1P能调节脓毒症发生发展过程中多种免疫细胞和血管内皮细胞功能，是预测脓毒症病情严重程度的重要指标。本文总结了S1P对脓毒症中血管通透性、免疫与凝血功能的影响，期望为今后该领域的研究提供参考。

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