0 引 言

茄子青枯病是全世界危害最大、分布最广、造成损失最严重的植物病害之一,是由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum) 引起的.茄科雷尔氏菌是土传的细菌性病害,化学药剂很难防治[1].青枯病菌通常从茄子根部或茎部的伤口感染,然后在茄子的维管束组织中向上侵染,首先茎干内部褐变,然后白天茎叶萎蔫下垂,最后全株枯死,切开病茎的褐变部位时有乳白色菌液排出[2].茄子青枯病病原菌通过强风暴雨、田间农事操作等途径传播[3-4].茄子青枯病一般减产20%-30%,严重时损失达60% [5].目前茄子青枯病的防治方法主要为高抗品种、 农业措施、 化学药剂和生物农药等[6],然而, 青枯菌的小种多样性高以及与环境之间复杂的互作,使得茄子品种丧失抗性很快[7].在生产上茄子近缘野生种托鲁巴姆(Solanum torvum Swartz)作为茄子嫁接苗砧木被广泛使用,具有很强的抗青枯病的特性,还能提高茄子产量和品质,因此茄子嫁接技术得到了大面积的推广使用[8-9].青枯病从生物形态上鉴定较难.近年来由于分子生物学的飞速发展,由于不同种的真细菌与古细菌间的16S rRNA基因高度保守的,常被用于对各种生物进行的系统发育学和分类方面的研究.利用16S rRNA基因从分子水平上鉴定茄子青枯病非常准确.任海龙等报道采用细菌16S rDNA测序方法,将新疆农业大学南繁基地番茄青枯病菌鉴定为茄科雷尔氏菌[10].刘海龙报道9个分离番茄菌株的BLAST同源性比对结果表明,引起番茄青枯病的病原的9个菌株是茄科雷尔氏菌(R. solanacearum)[11].

“我的整个身体就剩下大脑没有瘫痪了，我能不想吗?小韵，我想，我们还是走出那层虚幻的光环，从现实的角度来重新审视我们的关系，好吗?”

托鲁巴姆为高抗茄病的砧木,托鲁巴姆嫁接苗在三亚周边的发病很重,危害严重,为弄清托鲁巴姆嫁接苗的发病原因,找到有效防治托鲁巴姆嫁接苗病害的药剂,控制病害发生,减少产量损失.本研究对三亚托鲁巴姆嫁接苗高感病的茄子病株进行病原菌分离, 通过菌落形态的初步鉴定,再通过细菌16S rDNA测序进行分子鉴定,以确定托鲁巴姆嫁接苗病株中病菌.在我们前期研究的基础上[12]利用国内农药店出售的防治茄子细菌病害的最新化学药剂,进行室内药剂筛选,期望得到了一批对茄子青枯病菌杀菌效果好的药剂,为今后茄子的病害防治提供参考依据.

了宣布与松下、徕卡达成合作，适马在这次展会上还发布了五支新镜头，其中就包括广受关注的60-600mm f/4.5-6.3 DG OS HSM Sports镜头——一支几乎能涵盖野生动物、体育、航空摄影等一系列题材的镜头。适马还发布了一支规格相对常规的镜头：70-200mm f/2.8 DG OS HSM Sports，两支Art系列的定焦镜头——28mm f/1.4 DG HSM Art和40mm f/1.4 DG HSM Art。还有为APS-C画幅相机设计的56mm f / 1 . 4 D C D N Contemporary。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试培养基

茄子青枯病培养基成分和操作见周运瑶报道[12].

1.1.2 供试药剂

从NCBI网站,随机下载来不同类型的茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)6种,利用Neighbor joining构建发育树.

1.2方法

1.2.1 供试菌株供试病原细菌及分子鉴定

茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)由三亚茄子病田取样分离得到.具体操作见周运瑶2016报道[12].16S r DNA序列分析选用细菌基因组DNA提取试剂盒( 上海天根生物),16S rDNA通用引物：27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和 1492r( 5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3').扩增产物送上海生工生物科技有限公司测序.所测序列在NCBI中进行BLAST同源性搜索与比较.

坚持把提高质量作为军事文艺作品的生命线。军事文艺作品，是军队文艺工作者的立身之本。要贯彻思想精深、艺术精湛、制作精良的要求，坚持讲品位、讲格调、讲责任，坚决抵制低俗庸俗媚俗，为官兵提供更多样更优质的精神食粮，用健康向上的文艺作品陶冶官兵情操、启迪官兵心智、引领时代风尚。

1.2.2三亚茄子青枯病的系统发育树构建

所有14种药剂均从天猫网站购买,具体为：33.5%喹啉铜悬浮剂,兴农药业有限公司；22.5%啶氧菌酯悬浮剂,上海杜邦农化有限公司；20%叶枯唑可湿性粉剂,江西禾益化工股份有限公司；40%王铜霜脲氰可湿性粉剂,江西禾益化工股份有限公司；0.3%四霉素水剂,辽宁微科生物工程有限公司；32.5%苯甲嘧菌酯悬浮剂,先正达南通作物保护有限公司；10%丙硫唑水分散粒剂,贵州道元生物技术有限公司；47%春雷王铜可湿性粉剂,江西禾益化工股份有限公司；3%中生菌素可湿性粉剂,福建凯立生物制品有限公司；1000亿芽孢/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂,德强生物股份有限公司；47%春雷霉素可湿性粉剂,北兴化学工业株式会社；50%多菌灵可湿性粉剂,四川国光农化股份有限公司；72%农用硫酸链霉素可湿性粉剂,四川成都普惠生物工程有限公司,86.2%氧化亚铜水分散粒剂,挪威劳道克斯公司.

1.2.3 药剂对青枯病菌的拮抗活性测试

三亚茄子病秆上分离到茄科雷尔氏菌其中序列结果如下：

三亚托鲁巴姆嫁接苗病株枝叶变褐焦枯,木质部呈褐色,手挤压病茎的横切面,有乳白色的黏液渗出.培养基培养后,菌落呈现粉红色,初步鉴定可能为细菌病害.取出8个病菌克隆,经16S rDNA测序,其中一株病菌克隆测序序列在NCBI中进行BLAST同源性搜索与比较结果详细见表1,测序长度456bp,与美国National Center for Biotechnology Information中心提交的茄科雷尔氏菌一致性为99%,两者序列比对没有间隙,期望值为0,因此可以确定三亚茄子病秆上分离到茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum).其余分离到菌株均不为茄科雷尔氏菌.

2 结果与分析

2.1供试菌株供试病原细菌形态和分子鉴定

叫喊声越来越响，族人们已经离得不远，这让他心里有了点儿底，他警惕着，慢慢俯下身，探二指放到了女尸的鼻下。

病原细菌悬液的制备和拮抗活性测试具体操作方法见周运瑶报道[12].

GGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCATGAGCGTCAGTGTTATCCCAGGAGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACTGCTACACGTGGAATTCTACCTCCCTCTGACACACTCTAGCCGTGCAGTCACCAATGCAATTCCCAGGTTAAGCCCGGGGATTTCACATCGGTCTTGCACAACCGCCTGCGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGGACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTCCTTATTCTTCCGGTACCGTCATCCACACCAGGTATTAACCAGTGCGATTTCTTTCCGGACAAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATTGCTGGATCAGGGTTGCCCCCATTGTCCAAAATTCCCCACTGGTGCATCCCGTAGG

 

表1 青枯病菌测序blast比对结果

  

得分期望一致性间隙提交821bits(444)0．0452/456(99%)0/456(0%)NationalCenterforBiotechnologyInformation，USA(08-AUG-2011)

2.2 三亚茄子青枯病的系统发育树构建

从NCBI网站,随机下载来不同类型的茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)6种,与我们这次分离的到的茄科雷尔氏菌(构建序号Qurey 101181), 利用Neighbor joining构建发育树,结果见图1,图中可以看出三亚茄科雷尔氏菌与随机下载来不同类型的茄科雷尔氏菌均不能归为一类,表明三亚茄科雷尔氏菌可能与以报道的茄科雷尔氏菌有所不同,这也许是造成三亚托鲁巴姆嫁接苗发病的原因.

  

图1 三亚茄子茄科雷尔氏菌的进化树构建

2.2 药剂对青枯病菌的拮抗活性测试

室内抑菌实验筛结果显示：14中药物中筛选出4种抑制效果比较明显的药剂见表2.在培养48 h后,这四种农药的抑制圈直径大小在1.40～2.50 cm之间,随着稀释倍数的增大,抑菌圈直径也逐渐缩小.稀释100倍时药物抑制效果明显,啶氧菌酯稀释100倍抑菌圈直径为1.95 cm、四霉素稀释100倍抑菌圈直径为2.10 cm、中生霉素稀释100倍抑菌圈直径为2.20 cm、农用硫酸链霉素稀释100倍抑菌圈直径为2.50 cm,其中抑制效果最好的是农用硫酸链霉素.其余药物喹啉铜、叶枯唑、霜脲氰、苯甲嘧菌酯、丙硫唑、春雷王铜、枯草芽孢杆菌、春雷霉素、国光多菌灵、氧化亚铜等在培养基滤纸周围没有抑菌圈的形成.四种药物的方差分析见表3-6,P-value表示在相应F值下的概率值,F crit是在相应显著水平下的F临界值,结果可以看出4种药物间稀释浓度间差异显著,重复间差异不显著.

 

表2 4种有效农药抑制效果

  

啶氧菌酯四霉素中生霉素农用硫酸链霉素稀释倍数抑菌圈直径/cm稀释倍数抑菌圈直径/cm稀释倍数抑菌圈直径/cm稀释倍数抑菌圈直径/cm1001．951002．101002．201002．502001．702001．902001．602002．203001．453001．503001．603001．50

 

表3 啶氧菌酯抑制效应方差分析

  

差异源SSdfMSFP-valueFcrit稀释倍数0．35055620．175278252．46．18E-056．944272重复0．02055620．01027814．80．0141726．944272误差0．00277840．000694总计0．3738898

 

表4 四霉素抑制效应方差分析

  

差异源SSdfMSFP-valueFcrit稀释倍数0．60526720．30263379．292580．0006056．944272重复0．00726720．0036330．9519650．4590266．944272误差0．01526740．003817总计0．62788

 

表5 中生霉素抑制效应方差分析

  

差异源SSdfMSFP-valueFcrit稀释倍数0．67268920．336344232．85387．25E-056．944272重复0．00508920．0025441．7615380．2827026．944272误差0．00577840．001444总计0．6835568

 

表6 农用硫酸链霉素抑制效应方差分析

  

差异源SSdfMSFP-valueFcrit稀释倍数1．75028920．875144395．7942．53E-056．944272重复0．00162220．0008110．3668340．7140436．944272误差0．00884440．002211总计1．7607568

3 讨论

本研究通过从三亚托鲁巴姆茄子嫁接苗病株分离得到的菌株,其中一个病菌克隆经16S rDNA测序序列分析鉴定,确定该病菌克隆是茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum),其余病菌克隆均不为茄科雷尔氏菌,结果表明三亚托鲁巴姆茄子嫁接苗病株中病菌复杂. 进化树构建结果是三亚茄科雷尔氏菌与随机下载来不同类型的茄科雷尔氏菌均不能归为一类,表明三亚茄科雷尔氏菌可能与以报道的茄科雷尔氏菌有所不同,以上这些上结果也许是造成三亚托鲁巴姆嫁接苗发病的原因.本研究药剂对青枯病菌的拮抗活性测试结果显示,啶氧菌酯、四霉素、中生霉素、农用硫酸链霉素等四种药剂表现效果很好,其中三种为抗生素.在茄子嫁接苗田间栽培种,由于青枯病菌多从根部侵入,加上青枯病菌变异很快,很短时间能迅速对抗生素产生抗性,因此建议以上药剂可以交替使用,防止青枯病菌对单一抗生素产生抗性.在药剂使用中,利用青枯病菌多从根部侵入的特点,药剂主要用于茄子根部灌根,同时在大雨初晴后及时在茎上部喷施药剂,防止病菌从茄苗上部易感接穗中入侵.

参考文献:

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