0引言

鱼类是性别决定方式最为多样的一个类群.与高等脊椎动物一样,鱼类性别决定的基础仍然是由遗传基因主导,但由于其进化上的原始性,其性别明显地表现为双向潜力.某些外部环境因素如温度、pH值、盐度、光照、水质、食物丰度和种群内部因素等都可能影响鱼类性别及其分化[1-2].有些鱼类甚至在性别分化完成后还能发生性逆转.目前利用环境因子来调节鱼类的性别只在一些性别可塑性较强的鱼类中有效,因此利用环境因子调控鱼类性别具有较大的局限性,并且效率较低.

目前,结合外源性类固醇激素及其相关受体的抑制剂来控制硬骨鱼类性别成了常规使用的高效方法.17α-甲基辜酮(17α-MT)是目前应用于鱼类性逆转诱导实验的主要外源雄激素,并已在多种经济鱼类中取得了良好的诱导效果.诱导实验一般开始于鱼类性腺分化不稳定期内,因为此时鱼类生殖细胞保持着向雄性或雌性发展的两种潜能.外源性类固醇激素可诱导多种幼鱼性腺分化,通常雄激素诱导雌性化,雌激素诱导雌性化[3].在银鲫[4]中,通过饵料在幼鱼进行投喂,使雄性率大大提高,达到了84%;在红罗非鱼[5]中,通过连续投喂80天,雄性率达到96.7%;将甲基睾酮按30 μg/g和90 μg/g拌入饲料中,分别投喂1日龄的孔雀鱼和玛丽鱼[6],能使雄性化达到100%,玛丽鱼雄性化达到95.8%以上.陈兴汉等利用浸泡的方法,通过甲基睾酮处理7日龄尼罗罗非鱼[7],雄性率高达98%以上;利用不同剂量浓度的甲基睾酮溶液孵化受精卵及浸泡孵化后10 a天的稚鱼40天,使斑马鱼[8]的雄性比提高74.94%以上;目前,通过雄激素诱导,以提高雄性率,在鳗鱼[9]、黄鳝[10]、石斑鱼[11-12]、非洲鲫鱼[13]、鲤鱼[14]、白斑狗鱼[15]、马拉瓜丽体鱼[16]和黄姑鱼[17]等鱼类中获得成功,并取得了显著的生产效益.

如图4，利用几何画板进行验证：给定一个锐角A，拖动点B改变三角形的大小，对边与斜边、邻边与斜边的比值不变，即锐角A的正弦值sinA、余弦值cosA均不变；拖动点A改变锐角A的大小，对边与斜边、邻边与斜边的比值均改变，锐角A越大，sinA的值越大，cosA的值越小.

泰国斗鱼(Bettasplendens)是一种常见的小型淡水观赏鱼.其色彩艳丽、体形多姿和容易饲养成了备受众多消费者青睐的观赏鱼品种之一[18].但在泰国斗鱼的养殖过程中,同样存在着生产价值的性别二态性.只有雄性泰国斗鱼才色彩鲜艳和好斗,显示出斗鱼的商业价值.因此,如何提高泰国斗鱼生产过程中的雄性比例是泰国斗鱼生产至关重要的任务,也是其产业效益提高的关键.目前,泰国斗鱼的性别调控研究及性控技术尚未有报道.因此,开展泰国斗鱼性控研究和提高雄性率技术具有十分重要的生产指导意义.

(3)1型糖尿病患者活动时,应把握好胰岛素剂量、饮食与活动三者之间的相互关系,因其在接受胰岛素治疗时,常波动于相对不足和过多之间。前者可因活动时肝糖输出明显增多而葡萄糖利用不增加导致血糖升高、游离脂肪酸和酮体生成增加;后者易造成低血糖。一般可在活动前少量补充额外食物或减少胰岛素用量,活动量不宜大,时间不宜过长,以15~30min为宜,活动时随身携带甜点及写有姓名、家庭住址和病情的卡片以应急需。

1实验材料与方法

1.1实验动物

泰国斗鱼为本实验泰国斗鱼研究平台提供的雌雄亲本:年龄为2龄、体质重为8-10 g、体长4-5 cm、体色鲜艳、健壮高活力和无体伤及疾病感染.亲本在标准的小型鱼类淡水养殖系统(上海海圣公司)中饲养,温度为恒温28 ℃,光照时间为14 h,并采用商业化饵料进行饲养.

配制含甲基睾酮(MT)的实验组工作液.准确称量MT,并溶解于胚胎培养液,配置成50 ug/L、100 ug/L和200 ug/L的实验组工作液.以胚胎培养液位对照.仔鱼的处理起始时间为3天、5天和10天,处理周期为10天 和20天,每组仔鱼为50条,饲养到3月龄,并根据体型特征和性腺组织学判别雌雄.如果体色鲜艳,并且具有宽大的鳍条成鱼,均为雄性.如果体型特征不明显者,均进行组织学切片验证.数据结果采用SPSS 13.0进行分析,P<0.05表示具有显著性差异.

1.2 实验试剂与配置

根据投喂的实验结果,激素饵料的投喂时间越长,雄性化的效果越显著,雄性率从投喂10天的62%提高到30天的80%,其中,投喂20天和30天的雄性化结果差异不明显.另外,通过投喂的方式进行激素处理,实验鱼的死亡率均相对较低,各处理组的差别不显著(表4).结合雄性率及死亡率和处理周期等因素进行综合评价,利用投喂的方式进行激素处理,20天的投喂效果相对合适.

激素处理工作液配置方法:将甲基睾酮粉末溶于无水乙醇中,母液浓度为10 mg/ml,然后用胚胎培养液作为溶剂,配置50 ug/L、100 ug/L和200 ug/L的激素处理工作液.工作液为现用现配,保证激素药效和浓度.

1.3 泰国斗鱼胚胎获取

整个混合汽修正过程很短暂，大约10s多就结束了。在混合汽修正的整个过程中，我们可以清晰地看到：混合汽浓，氧传感器λ值为0.6，发动机抖动，缩短喷油时间；混合汽变稀，氧传感器λ值趋于1，发动机运转趋于平稳。由此可见，该故障车发动机抖动是由于混合汽过浓所导致的。

1.4 雄激素浸泡处理

④对于直接供水区，一般干旱年份充分利用淮水，同时抽江补给其不足；干旱年份抽江济淮，力求保证工农业生产及航运用水；特殊干旱年份除全力拦蓄地方径流、利用回归水或取用地下水源外，全力运用各项水工程措施，蓄、引、提等各种水源工程实施供水。

通过浸泡的方法进行激素处理,研究结果发现,根据浸泡起始时间来分析,发现越早激素处理的鱼苗,死亡率越高,雄性率效果反而不明显,并随着起始时间的推迟,处理的效果相对较好;处理时间的长短对雄性化的效果同样有显著的影响:浸泡20天的效果普遍比浸泡10天的效果显著;处理的激素浓度对雄性率及死亡率同样具有显著的影响,激素浓度为100 ug/L的处理效果比50 ug/L处理的雄性率高,但死亡率相对50 ug/L的处理结果偏高;200 ug/L的处理,浸泡时间不到5天,死亡率高达到90%,表明200 ug/L的激素浓度远远超过了泰国斗鱼胚胎发育的致死极限浓度,因此不作为处理统计(表2、表3).根据结果进行综合分析,浸泡处理仔鱼从10日龄开始,激素处理20天,激素浓度在50 ug/L和100 ug/L的雄性化效果比较明显,雄性率分别达到是85%和86%,差别不显著.

1.5 雄激素投喂处理

准确称取甲基睾酮(MT)粉末50 mg,并溶于5 ml无水乙醇中,配置成10 g/L的MT母液,用胚胎培养液稀释10倍,制备工作液.然后称取5 g饵料置于50 ml的洁净离心管中,0.5 ml工作液,并混匀,使饵料中的激素终浓度为100 ug/g.置于40 ℃烘箱中烘干,收集后4 ℃保存.激素饵料投喂起始时间为仔鱼孵化后第10天开始,持续投喂10天、20天和30天.每天投喂仔鱼两次,分别是上午9时和下午4时.每组仔鱼为50条,饲养到3月龄,并根据体型特征和性腺组织学判别雌雄.如果体色鲜艳,并且具有宽大的鳍条成鱼,均为雄性.如果体型特征不明显者,均进行组织学切片验证.数据结果采用SPSS 13.0进行分析,P<0.05表示具有显著性差异.

1.6 性腺组织学研究

参考石蜡切片的技术方法[7],将泰国斗鱼麻醉后,取出泰国斗鱼的性腺组织,置于波恩试液中固定过夜,经脱水、透明和石蜡包埋之后,利用石蜡超薄切片机进行组织超薄切片,并通过苏木素伊红染色后,进行光学显微镜观察与拍照分析.

雌雄亲本配对,后置于安静的暗光环境中待产.亲本的交配排卵一般是在下午3点钟左右.收取胚胎时,提前到鱼房的亲本交配缸旁静置等候,细心观察,一发现交配完成,立即将雌雄亲本分开.同时将受精卵收集,用胚胎培养液清洗后,置于120 mm2的玻璃平皿中(约60个胚胎),并加入2/3体积的胚胎培养液,于28 ℃恒温避光通风孵化.每天换一半的胚胎培养液,观察和记录,并及时清理死胚胎.孵化15天之后,将仔鱼转移到0.5L的玻璃缸中饲养,环境条件与亲本一样.

1.7 实时荧光定量表达分析

虽然本研究没能够从遗传上区别出伪雄鱼(遗传上是雌鱼,雄激素的诱导转变为雄鱼),将投喂后效果最显著实验组的雄鱼全部进行性腺组织学鉴定(图1).根据性腺组织学鉴定结果,发现诱导组所有雄鱼的精巢均属于正常发育状态,与正常发育雄鱼(没有甲基睾酮诱导)的精巢在没有组织学上并没有显著性差异,表明甲基睾酮诱导的雄鱼具有完整的精巢结构,预示了诱导雄鱼同样是功能性雄鱼.

 

表1 雄性相关基因的定量分析引物

  

基因引物序列AR正向ATGAGCCAAACTAGCCGACAGC反向TCATGAAACAAAATGGGTTTAAMH正向CCCCACTGAAGGTAACGC反向ACCATCACAAACACGGACASOX9正向CAAGAAAGAGGGCGAAGAAGAG反向GTGCAGGTGCGGGTACTGATDmrt1a正向GGAACAAACCCACGAGCAGA反向GGTCAGCTTGTTTGCCCAGAGDmrt1b正向TGCCTGTTCCCTGTTGAG反向TTACCAGAACCTCGGGACβ-actin正向GAGAGGTTCCGTTGCCCAGAG反向CAGACAGCACAGTGTTGGCGT

2 结果与分析

3)利用计算机视觉和图像处理技术处理采集到的鸡蛋图像，提取鸡蛋图像特征，建立检测模型，并将最终检测结果显示在信号灯上(系统用亮红灯表示为双黄鸡蛋)。

 

表2 浸泡浓度为50 ug/L的雄激素处理结果

  

周期/天起始时间/日龄雄性个体/尾雌性个体/尾死亡/尾雄性率雄性率平均值±平均标准差1032110190．680．68±0．04199220．682210180．6952712110．690．69±0．022511120．69281390．681036950．800．80±0．03

 

续表2

  

周期/天起始时间/日龄雄性个体/尾雌性个体/尾死亡/尾雄性率雄性率平均值±平均标准差35870．8135960．802031910210．660．65±0．031911200．632010200．675327110．820．81±0．11298130．78337100．831040730．850．85±0．0937670．8638750．84

 

表3 浸泡浓度为100 ug/L的雄激素处理结果

  

周期/天起始时间/日龄雄性个体/尾雌性个体/尾死亡/尾雄性率雄性率平均值±平均标准差103164300．800．79±0．08154310．79185270．7852512130．680．68±0．022312150．662611130．701035870．810．81±0．0134880．8135960．80203123350．800．78±0．04154310．79145310．745318110．790．80±0．02266180．8132990．781038660．860．86±0．0236680．8636680．86

试剂:甲基睾酮(MT)购于sigma试剂公司,其他的NaCl、KCl、Na2HPO4和NaHCO3等试剂为国产分析纯.

 

表4 雄激素剂量100 ug/g饵料投喂处理结果

  

周期/天起始时间/日龄雄性个体/尾雌性个体/尾死亡/尾雄性率雄性率平均值±平均标准差1010281750．620．62±0．03261690．622515100．63201037940．800．80±0．0235960．80371050．793010361030．780．80±0．0237850．8236950．80

按照第一链cDNA合成试剂盒的操作说明合成每个正常组、发育组和激素诱导雄性组的精巢cDNA模板.参照SYBR GreenRealtime PCR Master Mix (TOYOBO, Japan)试剂盒说明书进行反应体系构建,利用Roche LightCycler 480 real time PCR system 进行基因表达的检测.雄性发育相关基因的特异引物见表1.荧光定量的热循环程序为:95 ℃预变性1分钟; 95 ℃变性5秒,55 ℃退火10秒,72 ℃延伸20秒,84 ℃收集荧光10秒,共40个循环;溶解曲线:95 ℃1分钟,50 ℃1分钟,95 ℃继续.根据熔融曲线进行引物特异性分析和数据准确性评估.最后利用目的和内参基因的荧光域值(Ct),并按照2ΔCt的方法进行相对定量数据分析.数据结果采用SPSS 13.0进行分析,P<0.05表示具有显著性差异.

  

(注:A 正常发育卵巢;B 正常发育精巢;C 激素诱导组精巢;标尺为100 um)图1 泰国斗鱼性腺的组织学鉴定

利用实时荧光定量的方法检测了雄性性腺发育关键基因的表达,进一步深入比较正常发育雄鱼与激素诱导雄鱼的分子表达差异.其中SOX9、AMH、AR和Dmrt等因子均为重要的雄性性别调控基因,并在雄性的性腺发育中具有关键性的作用.随机挑取正常发育雄鱼与诱导组雄鱼各30条(n=30)进行基因表达检测.结果发现,这些关键雄性因子在正常发育组和激素诱导组中的表达没有显著性差异,预示了正常发育组和诱导组的雄鱼在分子表达调控水平中没有显著差别,从而显示了激素诱导的雄性化技术具有可靠性见图2.

对建筑施工中建筑外墙保温技术与施工工艺的运用研究……………………………………………………… 李春强（4-173）

  

图 2 雄性调控关键基因在正常雄鱼与诱导雄鱼中的表达

3 讨论

根据实验的结果分析,浸泡和投喂两者的实际效果各有优势.利用浸泡方法处理的最佳时间和剂量为100 ug/L 处理20天,起始处理时间为10日龄仔鱼.浸泡甲基睾酮的方法来诱导泰国斗鱼雄性化与激素剂量、处理起始时间和处理周期有关,与其他鱼类相类似[6-10].在尼罗罗非鱼中,通过甲基睾酮浸泡处理,发现处理7日龄仔鱼的效果最好[7],其雄性率高达98%以上,而不是更早期的仔鱼;在斑马鱼[8]中,利用5.00 mg/L、10.00 mg/L、20.00 mg/L的甲基睾酮溶液孵化受精卵及浸泡孵化后10天的稚鱼40天,使斑马鱼的雄性比分别提高74.94%、93.61%和95.3%,表明斑马鱼的雄性化与激素剂量和处理周期相关,其中剂量越大,处理周期越长,雄性化效果越显著.在本研究中,通过初步的浸泡甲基睾酮诱导泰国斗鱼雄性化的探索,使泰国斗鱼的雄性率提高到86%,但相对其他鱼类的结果还是处于偏低的水平.这可能是激素剂量偏低和处理周期偏短的缘故.后续的研究将进一步优化浸泡处理的浓度和时间,以期达到更加显著的雄性化效果.

将激素混合到饵料中进行投喂处理是目前生产应用的常规方法,并在多种鱼类雄性化生产中广泛使用.本研究中,同样采用连续投喂的方式处理泰国斗鱼仔鱼.投喂激素20天后,能将雄性率提高到80%,但相比其他鱼类的诱导结果,还是处于偏低水平.在红罗非鱼[5]中,通过连续投喂80天,雄性率将达到96.7%;将甲基睾酮按30 μg/g和90 μg/g拌入饲料中,分别投喂1日龄的孔雀鱼和玛丽鱼[6],能使孔雀鱼雄性化达到100%,玛丽鱼雄性化达到95.8%以上;在马拉瓜丽体鱼[16]中,投喂甲基睾酮剂量为40 mg/kg的饲料30天、50 mg/kg的饲料20天以上,或者60 mg/kg的饲料10天以上,雄性率均可达到90%以上,并表明雄性率随着激素含量的增加和处理时间延长而提高.但不是所有鱼类都能获得高效的雄性化水平.在银鲫[4]和斑马鱼[8]的研究中,高剂量处理,雄性率同样处于80%的水平.这可能是不同鱼类对激素的反应差异和激素处理方式相关.因此,后续有待于进一步优化,以期获得更显著的效果.

比较浸泡和投喂两种方法,其中投喂方法的死亡率相对较低,操作简单,但雄性率相对低;浸泡方法的雄性率相对高,但死亡率与实际换水等生产操作相对烦琐.不管是浸泡还是投喂方法来诱导泰国斗鱼雄性化,其成活率和雄性率均与激素的浓度、幼鱼的年龄和处理时长相关.因此,根据泰国斗鱼的实际生产需求,投喂的方法将更加合适.

本项目通过初步的实验摸索,采用浸泡及投喂的常规处理方法,探讨了雄激素甲基睾酮对泰国斗鱼雄性化的影响,并获得了实际操作的关键参数及方法,建立了浸泡与投喂诱导泰国斗鱼雄性化的技术方法,同时开展了组织学和分子生物学的评估,表明雄激素诱导的雄鱼与正常雄鱼在性腺组织学和关键分子表达上没有显著性差异,进一步表明该技术的生产适用性强,便于实际的生产操作,显示出简便性、可靠性及适用性.

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