鸭甲肝病毒(duck hepatitis A virus,DHAV)为小RNA病毒科Picornaviridae禽肝病毒属Avihepatovirus成员，是引起水禽发生病毒性肝炎的重要病原，为严重危害养鸭业健康发展的重要病毒之一，主要包括DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3等3种基因型[1-2]，其中DHAV-1为传统的血清1 型鸭肝炎病毒，DHAV-2 和DHAV-3分别为近来报道的台湾型鸭肝炎病毒[3]和韩国型鸭肝炎病毒[4]，不同基因型的病毒间基因组同源性在仅为73%左右[4-5]。该病毒最早由Levine和Fabricant于1949年在美国纽约长岛的北京鸭中分离获得。黄均建等于1963年首次报道了该病在我国鸭群中的发生[6]，王平等[7]于1980年从患病的北京雏鸭中分离获得该病毒，随后郭玉璞等[8]研究证实该病毒的血清型为鸭肝炎病毒1型。流行病学研究表明，我国鸭群中流行的鸭肝炎病毒以DHAV-1主[9-10]，该病毒在水禽流行过程中不断发生变异。林世堂等[11]在1996年从混合感染的病例中分离到1株与经典鸭1型肝炎病毒血清型存在差异的毒株，陈建红等[12]、何冉娅等[13]对不同地区流行的毒株分析发现，鸭肝炎病毒已发生变异，存在抗原变异毒株。我国防治该病的主要措施是采用弱毒疫苗和灭活疫苗进行预防，然而临床上常出现免疫失败现象。为了解近两年来我国福建省及周边地区鸭群中DHAV-1临床流行毒株的变异情况，本研究对2015-2016年间临床采集的样品进行病原分离鉴定和遗传变异分析，明确当前鸭群中鸭1型甲肝病毒的流行状况及病原的变异情况，为今后制定该病的综合防控措施提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品的来源及处理

样品为2015-2016年间福建、广东、浙江及江西等不同地区送检的病例样品，共计327份，样品来源见表1。采集的样品经磨碎后与含抗生素的0.01 mol·L-1 磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH 7.2)按1∶3的比例制成悬浮液，将上述组织悬浮液冻融3次后，保存于-80℃备用。

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1.2 材料试剂

SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。AMV反转录酶、RNase Inhibitor购自大连宝生物技术有限公司，病毒RNA提取试剂盒、RT-PCR扩增试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；DNA聚合酶购自Thermo生物技术有限公司。

1.3 引物设计与合成

参照文献[14]提供的引物进行DHAV-1检测，VP1基因扩增引物参照GenBank发表的该病毒衣壳蛋白基因序列(GQ130377、JX390982及DQ249299等)进行设计，上游引物 VP1F：5′-CAG TTT ACY GCC CCA CTC TAT-3′，下游引物VP1R：5′-TGG CTT CCA CCT CCT CTT CAT-3′，该对引物间的理论跨幅为699 bp，引物由福州博鸿生物技术有限公司合成。

表1 样品来源 Table 1 Sources of specimens

序号省份 主要来源地样品类型样品数1福建福州、莆田、漳州、三明、福清、南平、宁德肝脏及脾脏等1872广东清远、湛江、广州、惠州肝脏及脾脏等653浙江金华、宁波、湖州肝脏及脾脏等424江西南昌、南城、吉安肝脏及脾脏等33总计肝脏及脾脏等327

1.4 临床样品的检测及病毒分离鉴定

采集的临床样品按常规方法进行匀浆离心处理后，以含双抗无菌PBS缓冲液(pH 7.2)进行1∶3稀释，反复冻融3次后，取上清用病毒RNA提取试剂盒提取样品中的RNA，参照试剂盒操作说明书进行。提取获得的RNA样品参照文献[12]的方法进行DHAV-1检测，随后参照文献[14]的方法对DHAV-1阳性样品进行病毒分离纯化，阳性尿囊液经纯化后保存于-80℃备用。

测序结果经Lasergene 7.0 软件进行拼接编辑后，用MegAlign程序进行序列位点差异及同源性分析；采用 PHYLIP 软件包中的DNADIST 程序(Kimura 2-parameter方法)计算遗传距离；使用MEGA 5.1 软件包中NJ程序(Neighbor-Joining 方法)构建系统进化树，进化树的置信度由Bootstrap 法检验，域值为70%，共1 000次循环。

1.5 VP1基因的RT-PCR扩增

测序结果表明(表3)，所获得的23株病毒VP1基因核苷酸序列同源性在93.3%～99.9%，氨基酸序列同源性介于94.4%～100%，与GenBank中登录的DHAV-1的VP1基因核苷酸同源性介于91.3%～99.7%，其中与2012年的DHAV-1毒株(MPZJ1206)同源性最高，核苷酸同源性达到99.7%；与我国现用疫苗株CH60 VP1基因核苷酸同源性介于94.1%～96.2%，推导氨基酸同源性在95.3%～98.5%，而与DHAV-2和DHAV-3毒株的VP1基因的核苷酸同源性仅分别在64.9%～67.2%和65.9%～70.2%。

1.6 序列分析

可得：△AEC∽，设A(x1，y1)，B(x2，y2)，有设AB：y=px+q，和y=ax2+bx+c联立可得：

2 结果与分析

2.1 病毒的检测及分离鉴定

基于VP1基因的分子遗传进化关系分析表明，现有DHAV-1毒株形成了4个不同的亚群(图1)，本研究所获得23株病毒分属2个不同的亚群，两亚群间的遗传距离为0.06，其中FZ10SD-0703、FQ10SD-0119、MH09SD-0409、CL12SD-0506和MH07SD-0701等5株病毒与2005年前台湾地区分离的03D株构成了DHAV-1c进化亚群，其余18株病毒则与Du/CH/LGD/111239、GD及FJ1220等毒株构成一个大的进化亚群DHAV-1a。毒株溯源发现，该亚群的毒株均为2010年以后分离的毒株，其中毒株MH10MD-0515、FZ12SD-0413和YT15MD-0411与该亚群的MPZJ1206一样，均引起感染鸭表现胰腺泛黄，不同毒株间的亲缘关系极近，遗传距离仅为0.01，而国内外疫苗株5886、CH60、和C80等则处于DHAV-1b和 DHAV-1d等不同的进化亚群中。

表2 分离毒株信息 Table 2 Information on isolated viruses

毒株名称宿主日龄/d采集年份主要剖检病变FQ12SD⁃0111麻鸭122015肝肿大出血FQ10SD⁃0119麻鸭102015肝肿大出血FQ20SD⁃0131麻鸭202015肝肿大出血FZ12SD⁃0413麻鸭122015胰腺泛黄CL26SD⁃0426麻鸭262015肝肿大出血CL12SD⁃0425麻鸭122015肝、肾肿大出血CL12SD⁃0506麻鸭122015肝肿大出血MH07SD⁃0701麻鸭72015肝肿大出血MH09SD⁃0409麻鸭92015肝出血FQ06SD⁃0412麻鸭62015肝、肾肿大出血FZ10SD⁃0703麻鸭102015肝、肾肿大出血MH10MD⁃0515半番鸭102015胰腺泛黄GT15MD⁃0312半番鸭152015肝出血MH08MD⁃0409半番鸭82015肝出血YT15MD⁃0411半番鸭152015胰腺泛黄MH08MD⁃0417半番鸭82015肝肿大出血FZ167MD⁃0517半番鸭1672016肝出血，肾肿大ZZ02MD⁃0617半番胚242016-GT30MD⁃0228番鸭302015肝出血GD20MD⁃0301番鸭202016肝出血SD23CD⁃0825樱桃谷鸭232015肝、脾肿大出血FZ10CD⁃0514樱桃谷鸭102016肝出血JH51Gu⁃0307鹌鹑未知2015肺脏出血、脑膜炎

2.2 流行毒株衣壳蛋白分子特征分析

将已鉴定为DHAV-1阳性的鸡胚尿囊液参照病毒RNA提取试剂盒的操作说明进行病毒基因组RNA提取，参照RT-PCR扩增试剂盒提供的方法进行病毒基因组cDNA第一链的合成及PCR扩增，PCR产物纯化回收后送福州博鸿生物技术有限公司测序。

表3 不同DHAV毒株VP1基因序列同源性分析 Table 3 Homology analysis on VP1 gene of DHAV isolates

基因型毒株名称(分离年份)序列同源性/%核苷酸氨基酸DHAV⁃1本研究分离株(2015-2016)93 3～99 994 4～100FZ05(2005)91 3～93 795 8～97 6ZJ(2007)91 8～95 193 5～96 303D(2005)93 5～95 695 3～98 6LQ57(2011年前)93 5～95 994 9～97 2H(1993)92 7～95 495 8～98 1FJ1220(2012)94 4～99 695 3～100GD(2012)94 4～99 695 8～99 5MPZJ1206(2012)94 3～99 794 9～99 5FJ1407(2014)93 9～99 394 9～99 5JX1405(2014)93 9～99 394 9～99 5Du/CH/LGD/111239(2011)94 1～99 294 4～98 1Du/CH/LGD/111238(2011)94 3～99 094 4～97 6A66(2006年前)94 0～96 295 3～98 5CH60(2000)94 1～96 295 8～98 5C80(2006年前)94 1～96 495 8～99 0DHAV⁃290D(1990)64 9～67 168 9～71 204G(2004)65 1～67 269 2～72 5DHAV⁃3Du/CH/LJS/90905(2009)67 3～70 275 7～78 2G(1999)67 1～70 175 7～78 2AP03337(2004)65 9～69 075 2～78 3

参照文献[14]提供的DHAV-1 RT-PCR检测方法，在327份临床样品中检测到35份DHAV-1阳性样品，阳性率为10.7%，将这些阳性样品接种9日龄SPF鸡胚后，收集所有鸡胚尿囊液并进行RT-PCR检测。检测结果经1%琼脂凝胶电泳结果显示，从23份尿囊液成功检测到DHAV-1，回收纯化扩增产物进行测序表明，所有23份阳性样品均为DHAV-1，其中2015年分离到19株，2016年分离到4株，总分离率为7.03%。不同品种的鸭均有感染，20株来源于30日龄以内的麻鸭、半番鸭、番鸭及樱桃谷鸭，这些雏鸭多表现为肝肿大、出血，其中FZ12SD-0413、MH10MD-0515和YT15MD-0411病毒感染的雏鸭主要剖检病变为胰腺泛黄，但肝脏出血病变不明显；其余的3株病毒分别来源于167日龄的半番种鸭24日龄半番鸭胚及雏鹌鹑，可见DHAV-1感染主要还是以30日龄雏鸭为主，同时还可感染鹌鹑等。毒株的详细信息见表2。

图1 鸭1型甲肝病毒VP1基因遗传进化分析 Fig.1 Phylogenetic analysis on VP1 gene of DHAV-1 注：图中树结处的阿拉伯数字为自举检验置信值(1 000次重复)，低于70的数值未显示；黑三角(▲)标注的毒株为本试验扩增的毒株。

1.《协定公约》与国内税法的有效对接。在国际条约守信原则下，《协定公约》如何通过国内的税收立法安排来履行义务，如何在本国的税收征管中更有效地运用《协定公约》，是国际税收透明度建设实践中面临的一个重要法律问题。BEPS行动计划的参与者需要根据本国国情进行转化适用。把《协定公约》作为一个框架原则，同时又要把《协定公约》内容转化为国内法并与之衔接，建立与全球化相适应的国际税收实体规则与程序规则，完善相关配套制度。对于《协定公约》中本国目前税收立法缺失的内容，通过补充完善税收立法来实现；现行税收立法有规定但与《协定公约》不符或不全面的，需修改和细化国内税法相关规定。

VP1基因编码氨基酸序列在不同进化亚群间存在较大差异(图2)，如2010年以来新出现的DHAV-1a进化亚群的毒株其178位至190位氨基酸序列为178-STALSRGSNGVIP-190，而DHAV-1d亚群的毒株178-STTLSRGSNGVIP-190; DHAV-1c亚群2010年分离的毒株178-STTPSRKSNDVIP-190; DHAV-1b亚群的毒株其178位至192位氨基酸序列变异较大，存在3种氨基酸模式。另外，除DHAV-1c进化亚群毒株的VP1蛋白第3位氨基酸为苏氨酸(Thr)，其他3个亚群毒株的VP1蛋白第3位氨基酸均为丝氨酸(Ser)。

图2 DHAV-1不同基因亚型毒株VP1蛋白178～190位氨基酸序列 Fig.2 Sequences of 178-190 amino acids of VP1 proteins from viruses of different subgenotypes

3 讨 论

鸭甲肝病毒基因型复杂且高度变异，自被发现以来一直是雏鸭养殖防控的重点，是严重危害养鸭业健康发展的重要传染病病原。现有调查研究表明，我国鸭群流行的鸭肝炎病毒以DHAV-1为主，DHAV-3日渐增多[9-10]，这2种病毒均主要侵害3周龄内的雏鸭，其中以北京雏鸭、樱桃谷雏鸭最易感，发病率高达70%，病死率高达60%，病死鸭主要临床特征多为呈角弓反张和肝脏肿大、出血，这些特征为临床快速诊断该病的重要依据[1-2,5]。此外，DHAV-1感染雏鸭还可以引起不同的临床症状及病理变化。2005年法国学者Guérin等[15]发现DHAV-1感染的雏番鸭胰腺发黄、脑膜出血，但其肝脏无眼观出血病变。2011年9月，我国浙江省金华等地区和福建省莆田等地区7～30日龄雏番鸭发生以胰腺发黄为特征的疫病，发病率10%～30%，病死率25%～40%，发病鸭多表现为胰腺发黄、胰腺上皮细胞严重变性和坏死，完全不同于引起典型肝炎的DHAV-1(称为肝炎型DHAV-1)所致的肝脏严重出血、肝细胞严重变性和坏死的特征病变。至今，浙江、福建、广东等6省(市、自治区)的雏番鸭和雏半番鸭均有发生此病[16]。鸭群中流行的鸭甲肝病毒基因型和致病型的复杂性极大影响了该病的有效防治。因此实时开展该病的流行病学调查，掌握该病的流行现状，是有效控制该病的重要举措。本研究对2015-2016年间临床病例中DHAV-1的感染情况进行调查，从收集的327份临床样品中分离鉴定出23株DHAV-1，感染率为7.03%(23/327)，感染宿主中雏麻鸭较多(11/23)，其次是半番鸭。另外，23株病毒中，有3株病毒分别来源于167日龄的半番种鸭、24日龄半番鸭胚及发病的雏鹌鹑，尽管类似感染病例报道较少，但这也提示我们在监测该病毒在雏鸭中流行的同时，也需要适当关注该病毒在其他家禽中的感染情况，病毒在自然界长期的遗传演化过程中其感染的宿主日龄范围、家禽品种及感染途径都可能在发生变化。

VP1基因是小RNA病毒的最重要的抗原编码基因，包含序列高度可变区，是病毒发生抗原变异的核心区域，分析DHAV-1临床流行毒株VP1的分子特征及变异情况，对了解DHAV疫病的流行特征、病原的分子变异规律、疫苗的筛选以及诊断抗原的研制具有重要的指导意义[3-4]。本研究对2015-2016年所分离的23株DHAV-1的VP1基因进行了序列分析，结果表明，23株病毒包含2个亚群，除了5株与2005年台湾地区分离株03D处于同一亚群，其余18株病毒(包括3株分离自表现胰腺泛黄的雏鸭临床样品的毒株)与其他2010年以来的分离株共同构成了一个进化分支，核苷酸同源性均在97%以上。23株病毒的VP1基因核苷酸序列同源性为93.3%～99.9%，与现用的国内外疫苗株(如5886、CH60、C80和X)的VP1基因核苷酸同源性在91.3%～96.2%，推导氨基酸同源性为92.3%～97.5%。VP1蛋白氨基酸差异主要在羧基端的178位至190位氨基酸的差异。这一区域的氨基酸残基在不同亚群内高度保守，是不同亚群病毒的分子标记，可作为不同DHAV-1亚群快速检测的候选靶基因。由此可见，鸭群中流行的毒株之间，以及流行毒株与疫苗株之间存在不同程度的差异，VP1作为病毒的主要抗原蛋白及与宿主互作的蛋白，这些氨基酸位点的差异可能会影响到病毒的抗原性及细胞受体结合活性[17]。因此，应尽快开展流行毒株与疫苗株之间的抗原保护性分析，对现有疫苗的有效性进行评估，对疫苗的抗原性进行优化，为该病的有效防控奠定坚实基础。

一个国家的综合实力包括硬实力和软实力。硬实力是一国的经济实力代表，而“软实力”是以文化为主的实力。硬实力和软实力是缺一不可的。因此，中国的图书出口贸易不只是代表着国家的“软实力”的直接形式，也代表了我国的经济文化的国家竞争力。鉴于这个重大的现实意义，笔者选择这一论题进行研究。

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