基于ITS的限制性内切酶片段长度多态性分析 (Internal Transcribed Spacer-Restriction Fragment Length Polymorphism，ITS-RFLP)不仅可以快速鉴别相似形态的病菌，还可以分析病原菌的种群间亲缘关系。该方法具有快速、简便的优点，已广泛应用在病原真菌、线虫等真核生物种间、种群的鉴定。赵杰等[1]利用8种限制性内切酶对20个陕西省CCN群体的ITS区PCR扩增产物进行限制性内切酶谱分析，结果这8种限制性内切酶酶切ITS-PCR产物后共产生22个酶切片段，20 个种群的PCR-RFLP谱型一致，表明陕西省小麦禾谷孢囊线虫是同一个群体且与已报道的中国CCN群体的“C”型一致，有别于欧洲的“A”型群体和印度的“B”型群体。李志芳等[2]建立了大丽轮枝菌、黑白轮枝菌、立枯丝核菌、串珠镰刀菌、粉红单端孢和尖孢镰刀菌6种棉花主要病原真菌的ITS-RFLP快速鉴定方法。孙长坡等[3]建立了产毒黄曲霉的PCR-RFLP 快速检测方法，可以从供试的各种曲霉属菌株中鉴别出黄曲霉毒素产毒菌株。

叶点霉属真菌常见于柑橘果园中，它们或寄生危害，或营腐生生活。王兴红等[4]将从我国南方各类柑橘主产区分离获得叶点霉菌株划分成4个分支，即柑橘叶点霉Phyllosticta citricarpa、亚洲柑橘叶点霉Phyllosticta citriasiana、首都叶点霉Phyllosticta capitalensis和中华柑橘叶点霉Phyllosticta citrichinaensis。其中，P.citricarpa是最早发现发生在柑、桔、橙等上面引起黑斑病的病原菌[5]，但未见通过分离证实发生在琯溪蜜柚果园中的报道。P.citriasiana是近年发现危害柚类引起黑斑病的新病原[6]。P.citriasiana为无性阶段，尚未发现其有性阶段。P.capitalensis是一种在柑橘上致病性很弱的腐生菌[7]，它广泛分布在其他植物上[8]。P.citrichinaensis 是在本研究工作开展之后报道的新种，是一种在柑橘上致病性很弱的腐生菌[9]。P.citriasiana和P.capitalensis是琯溪蜜柚上常分离到的2种叶点霉，它们的ITS片段大小相近，序列相似性87.98%，培养形态相似，使用常规的培养形态鉴别方法不易区分，且耗时长。本研究旨在建立一种快速、准确鉴别这两种菌的ITS-RFLP鉴定方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 从福建省平和县采集琯溪蜜柚病果或病叶，使用常规方法分离培养病菌，马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养，获得供试菌株P.citriasiana与P.capitalensis。

1.1.2 主要试剂及仪器 试验需要的主要试剂有PCR premix、pMD-18T、DNA marker和AccI 。主要仪器有英国TECHNE 96孔型普通PCR仪，北京六一DYCP-31DN型核酸电泳槽，北京创美伟业Gel PLUS System凝胶成像系统和上海安亭GL-20G-Ⅱ型台式冷冻高速离心机等。

1.2 试验方法

1.2.1 菌丝体基因组DNA的提取 菌丝体基因组DNA提取方法参考方卫国等[10]的方法并做改良，具体步骤如下：称取冷冻干燥菌丝体50 mg，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5 mL Eppendorf离心管中；加入600 μL 65℃水浴预热的SDS提取缓冲液(200 mmol·L-1 Tris-HCl、500 mmol·L-1 NaCl、50 mmol·L-1 EDTA、2% SDS)，水浴10 min，期间摇匀2次；加入等量的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，涡旋震荡混匀，然后10 000 r·min-1、4℃离心10 min；取上清，加等量的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，混匀，然后12 000 r·min-1、4℃离心10 min；取上清，加2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，-20℃冰箱放置30 min；12 000 r·min-1、4℃离心10 min，弃上清得沉淀，沉淀常附于管壁内；用70%乙醇洗涤沉淀，12 000 r·min-1、4℃离心5 min，再次获得沉淀，重复2遍；沉淀自然风干，再用50～100 μL TE溶解，-20℃保存备用。

1.2.2 病菌rDNA-ITS序列扩增 (1)通用引物：采用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)的通用引物ITS1/ ITS4扩增真菌菌丝体的rDNA-ITS基因片段，该片段含5.8S rDNA 及其两侧的ITS1 和ITS2。通用引物如下：ITS1(5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3′)；ITS4(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)。

(2) PCR扩增：PCR反应总体积25 μL，反应体系为10×PCR缓冲液2.5 μL、dNTP各0.2 mmol·L-1、引物各10 pmol·L-1、Taq DNA聚合酶1.0 U、DNA模板10 ng；扩增条件为94℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。

(3)ITS扩增产物的检测：取ITS扩增产物5 μL加上1 μL 6×溴酚蓝上样缓冲液，混匀，进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶预先加入GoLdview TMDNA染料，凝胶成像仪观测拍照。

可我对蒋利学却并不熟悉，要不是发生这件事，我可能这辈子都不会认识蒋利学，更不会知道这个世界上还有一个叫蒋利学的人。但不管我事先熟悉不熟悉蒋利学，蒋利学这个人都是真实存在的，并且这个叫蒋利学的家伙还和我生活在同一个国家，同一个省。

1.2.3 PCR产物的克隆和测序 回收上述PCR扩增产物，以pMD18-T为载体进行克隆，转化大肠杆菌DH5α，涂抹在含有氨苄青霉素的固体LB平板上，挑取阳性菌株在液体LB中振荡活化，二次PCR验证并测序。

1.2.4 序列比对和系统进化分析 将测序获得的ITS序列登录NCBI GenBank，结合NCBI GenBank上登录来源于柚子的其他叶点霉属真菌的ITS序列，使用Mega 5.0软件(Tamura et al.,2011)中的Muscle(Codons)子程序进行多重比对[11]，采用邻接法(Saiton,1987)[12]和Maximum composite likelihood预测模型构建系统进化树，同时设置1 000次重复的自举分析和省略低于60%的节点以评估其稳健性。间隔视为缺失数据。

1.2.5 限制性内切酶的筛选分析 使用DNA Man软件进行限制性内切酶分析，将获得的序列输入，获得各种酶切位点的限制性内切酶，比较得到各序列共有的内切酶，从而筛选得到能够区分序列的内切酶。

1.2.6 ITS-RFLP分析 酶切底物的制备：取经过二次PCR和测序验证两种菌的rDNA-ITS单克隆菌的LB新鲜培养液10μL于PCR管中，无菌水稀释10倍，100℃水浴裂解10 min；取1 μL裂解液作为模板底物，用引物对ITS1/4再次进行PCR扩增，扩增产物直接用作酶切底物。酶切反应共20 μL，反应体系为PCR产物6 μL、Acc I 1 μL、10×M Buffer 2 μL，双蒸水11 μL。酶切反应条件为37℃水浴1.5 h。最后取10 μL酶切产物进行3%琼脂糖凝胶电泳分析。

2 结果与分析

2.1 病菌分离与rDNA-ITS PCR 扩增结果

从琯溪蜜柚上分离到的病原菌P.citriasiana和腐生菌P.capitalensis的PDA培养物如图1所示。两种菌的生长速度较慢，培养初期的菌落较难区分，需在25～28℃下培养2周左右才能够具有明显的差异特征，如前者产生半埋生的分生孢子器和乳白色分生孢子液，后者产生假囊壳，显然这种常规的形态鉴定方法较为繁琐和耗时。

图1 P.citriasiana和P.capitalensis的PDA培养菌落 Fig.1 Culture on the PDA of P.citriasiana and P.capitalensis 注：A为P.citriasiana，B为P.capitalensis。

如图3所示，从NCBI GenBank上共检索到31条分离自柚子的叶点霉属真菌菌株ITS序列，构建得系统进化树，划分成P.citriasiana、P.citrichinaensis和P.capitalensis 3个种群。本研究获得的序列JN128951 和HM807531分别被划分在P.citriasiana和P.capitalensis群，其他序列划分在P.citrichinaensis群。

图2 病菌DNA PCR检测 Fig.2 DNA PCR detection of pathogens 注：M为DL 2000 DNA Marker，1～4为P.citriasiana的rDNA- ITS扩增产物；5为空泳道；6～8为P.capitalensis的rDNA-ITS扩增产物。

2.2 序列测定及生物信息学分析

综合上述试验结果，A、B,2种新型包装材料的保鲜效果均好于对照组，A材料在肉色保持上效果更佳，B材料则有助于抑制肉的汁液流失和重量保持。下一步，要进一步开展新材料的气氛调节试验和货架期延长试验，同时对材料的生产加工工艺进行进一步开展改良，以降低材料的生产及使用成本。

DNA Man软件分析结果表明，Acc I等限制性内切酶能够区分P.citriasiana和P.capitalensis这2种菌的rDNA-ITS片段，酶切P.citriasiana的ITS片段可产生437 bp和210 bp两个片段，酶切P.capitalensis的ITS片段可产生434 bp、130 bp和75 bp 3个片段。

图3 分离自蜜柚的31个叶点霉属真菌菌株的系统进化树分析 Fig.3 Phylogenetic tree analysis of the 31 Phyllosticta strains seperated from Citrus grandis

提取菌丝体基因组DNA，以其为模板，以ITS1和ITS 4为引物，55℃为退火温度，进行PCR扩增，得到特异性条带。回收目的条带，以pMD18-T为载体、DH5α为菌株进行克隆转化获得阳性克隆子，然后再进行二次PCR验证，结果表明两种菌的ITS序列扩增片段大小相近，均在500～750 bp(图2)，从ITS序列片段大小仍然区分不开。

2.3 限制性内切酶分析

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测序获得两种菌的ITS序列，将之登录在NCBI GenBank上。P.citriasiana菌株的rDNA-ITS 片段长647 bp，其中1～23 bp为部分18S rDNA，24～258 bp为ITS1，259～416 bp为5.8S rDNA，417～582 bp为ITS2，583～647 bp为部分28S rDNA，序列号为JN128951。P.capitalensis菌株的rDNA-ITS 片段长638 bp，其中1～28 bp为部分18S rDNA，29～260 bp为ITS1，358～580 bp为ITS2，581～638 bp为部分28S rDNA，序列号为HM807531。两段序列相似性达87.98%。

如图4所示，经Acc I 酶切，P.citriasiana菌株电泳分离出2个条带，P.capitalensis菌株电泳分离出3个条带。电泳条带的大小与条数，与DNA Man软件预测结果一致。由此反推，产生两个条带的为P.citriasiana，产生3个条带的是P.capitalensis，从而达到鉴别目的。

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图4 病菌rDNA-ITS使用AccI酶切产物电泳结果 Fig.4 rDNA-ITS of the pathogens degested by AccI 注：M为DL 500 DNA Marker，1、5为P.citriasiana菌株的rDNA-ITS扩增产物，3、7为P.capitalensis菌株的rDNA-ITS扩增产物，2为P.citriasiana菌株酶切过夜产物，4为P.capitalensis菌株酶切过夜产物，6为P.citriasiana菌株酶切1.5 h产物，8为P.capitalensis菌株酶切1.5 h产物。

3 结论与讨论

亚洲柑橘叶点霉P.citriasiana是琯溪蜜柚黑斑病的病原菌，首都叶点霉P.capitalensis是前者分离的腐生菌。这两种叶点霉属真菌的PDA培养物生长前期形态差异不明显较难区分，虽到后期菌落渐有差异，且P.citriasiana在燕麦琼脂糖培养基上会产生黄色晕圈[6]，从而不同于其他叶点霉种类，但是无论如何这种常规的培养鉴定方法相对耗时。本研究成功构建了能够有效鉴别这两种真菌的ITS-RFLP鉴别方法，即使用限制性内切酶Acc I酶切ITS-PCR扩增产物，酶切产物电泳分别产生2个和3个特异片段，该结果不仅直观反映了菌株间rDNA-ITS序列的差异性，还可以作为P.citriasiana和P.capitalensis这两种菌的分子鉴定依据，弥补形态学鉴定的不足。本文建立的ITS-PCR鉴定方法快速简便，在实践操作上是可行的，但是随着研究的深入发现从柑橘上分离到的叶点霉种类数量不断增多，未能将后来分离发现的种类考虑进来是本文的不足之处。本研究还将P.citriasiana与P.capitalensis这2种菌的rDNA-ITS序列与其他登录在NCBI GenBank上来自柚子的菌株的rDNA-ITS序列构建进化树并进行分析，得出柚子上的菌株可以划分成P.citriasiana、P.capitalensis、P.citrichinaensis 3个种群的结论。

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