水蜡树Ligustrum obtusifolium Sieb.et Zuce.为木犀科女贞属常见的城市绿化植物[1]，其紫黑色的果实成熟时缀满枝头，数量甚多，却无人对其进行采集和利用，任其自然脱落。目前，国内外对水蜡树果实的研究较少，多集中于多糖[2]和色素[3]提取及微量元素含量[4]的测定，功能上只发现水蜡树果实具有降血糖的作用[5]，而对于水蜡树果实中所含的黄酮类物质研究甚少。黄酮类物质具有较高的药用价值，能延缓衰老、抗氧化、抗肿瘤、抗辐射、降血脂等[6-7]，一直是国内外研究开发的热点，被广泛用于食品、医药及化妆品行业[8]。

因此，基于水蜡树果实资源的丰富性和黄酮类物质的药用价值，本研究采用超声波辅助处理，根据响应曲面法原理，通过对提取时间、乙醇体积分数和液料比等工艺参数进行优化，研究水蜡树果实总黄酮的最佳提取工艺，同时测定总黄酮在小鼠体内的抗氧化活性，为水蜡树果实的深加工提供理论基础。

（2）实验剂量设置：参考《中药药理研究方法学》中剂量换算方法“体表面积比”换算动物临床等效剂量，分别以复方α-酮酸片0.68 g/kg（临床日用量为7.56 g）、培哚普利片6 mg/kg（参考《NKF- KDOQI慢性肾病诊断、分类与分层指南》[15]）、尿毒清2.25 g/kg（临床日用量为25 g）、JYP工艺A组药粉1.93 g/kg、JYP工艺B组药粉1.50 g/kg、JYP工艺C组药粉1.70 g/kg，作为大鼠药效学实验剂量。实验时以蒸馏水按剂量配制成所需浓度。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水蜡树果实，2014年秋采集于忻州市云中河公园，洗净干燥粉碎后，过80目筛，制成果粉，备用。SPF级小鼠40只，雌雄对半，体重18～20 g，由北京市富成畜牧有限公司提供，在实验动物房内饲养并观察7 d后进行试验，饲养环境温度为20℃左右，湿度为40%～60%。芦丁标准品(含量≥95%)，购于国药集团化学试剂有限公司。总超氧化物歧化酶测试盒，购于南京建成生物工程有限公司。AB-8型号大孔树脂，购于安徽三星树脂有限公司。其他药剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的制作 将芦丁烘至恒重，称取芦丁0.01 g，用95%乙醇溶解并定容至50 mL，得质量浓度0.2 mg·mL-1芦丁母液。分别配制0、8、16、24、32、40、48和56 μg·mL-1的芦丁溶液，各取2 mL均加入2 mL 5% NaNO2，摇匀，静置6 min；然后加入2 mL 10% Al(NO3)3，摇匀，静置6 min；最后加入10 mL 4% NaOH，摇匀，静置10 min，测定各管中溶液的OD510nm值。

1.2.2 水蜡树果实总黄酮提取的单因素试验

(1)最优超声时间的确定：称取水蜡树果实粉1 g，以液料比为10∶1的比例加入60%乙醇，设置超声时间(150 W)5、10、15、20、25 min后，定容到50 mL，过滤，石油醚脱色后，取2 mL，按1.2.1方法测定溶液的OD510nm值，通过回归方程计算样品中黄酮的浓度，计算总黄酮产量，确定最优超声时间。

(3)最优乙醇体积分数的确定：称取水蜡树果实粉1 g，以最优液料比的比例分别加入20%、40%、60%、80%、100%乙醇，以最优超声(150 W)时间处理后，定容到50 mL，测定黄酮浓度，计算总黄酮产量，确定最优乙醇体积分数。试验重复3次。

分析得到水蜡树果实总黄酮的最优提取工艺参数：当液料比为10.68∶1(mL ∶g)、超声时间为10 min43 s和乙醇体积分数为59.43%时，理论得率为4.84 mg·g-1。考虑到实际操作，将以上条件简化为液料比11∶1(mL ∶g)、超声时间为11 min和乙醇体积分数为60%，进一步验证，水蜡树果实总黄酮得率为(4.83±0.03)mg·g-1，与预测值接近，证实了该回归模型的可靠性。

以芦丁系列质量浓度为x轴，吸光度为y轴，绘制标准曲线，得到回归方程y=0.0199x+0.0102，R2=0.9988。

⑤加强各种科技计划的衔接，实现技术集成。把技术引进与科学研究、自主创新、转化推广、技术成果产业化作为整体统一考虑，使“948”计划与国家其他科技计划（如863计划、国家农业科技成果推广计划等）、水利部科技计划相互衔接，通过技术集成和有机结合，实现项目最终目标。

1.2.3 响应曲面优化设计试验 分别以各因素的最优值为0水平，其两侧值为-1和1水平(表1)，采用Design-Expert 8.0.6提供的Box-Behnken试验方案，测定各处理的总黄酮得率。以总黄酮得率为响应值分析优化提取条件。

表1 试验因素水平 Table 1 Factors and levels of experiment

水平液料比A/(mL·g-1)超声时间B/min乙醇体积分数C/%-15∶1540010∶11060115∶11580

1.2.4 水蜡树果实总黄酮的粗纯化 称取300 g水蜡树果实干粉，按照最优提取工艺提取总黄酮，并测定浓度。将AB-8大孔树脂浸入95%乙醇，不断搅拌，静置24 h，用蒸馏水洗净；然后用5% HCl溶液浸泡树脂3 h，用蒸馏水冲洗至中性；最后用2% NaOH溶液浸泡树脂3 h，用蒸馏水冲洗至中性，装柱[9]。将提取液通过AB-8大孔树脂进行动态吸附，树脂吸附达到饱和时，停止上样。吸附1 h后，用蒸馏水将上样后的树脂柱洗至无色，用苯酚浓硫酸法检测至无糖，再用60%乙醇洗脱至无色[10]。收集洗脱液并在50℃下减压浓缩制成浸膏。将浸膏用60%乙醇溶解并定容至100 mL，测得纯化后样品溶液浓度， 0.22 μm过滤除菌，配制成0.6、2.0、4.0 mg·mL-1的总黄酮溶液用于小鼠体内抗氧化作用测定。

1.2.5 水蜡树果实总黄酮在小鼠体内的抗氧化作用 将小鼠随机分成低剂量(L)、中剂量(M)、高剂量(H)和对照组(C)，每组10只。L、M、H组每天分别经口灌胃0.6、2.0、4.0 mg·mL-1的总黄酮溶液各1 mL(剂量分别为每天30、100、200 mg·kg-1)，C组则灌胃等体积生理盐水。小鼠喂养按常规条件进行。连续给药12 d后，处死小鼠，取肝组织，用生理盐水制备成10%肝匀浆液，根据试剂盒说明书测定超氧化物歧化酶(SOD)活性。采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定丙二醛(MDA)含量：取3mL 10%肝匀浆液，加入1.5 mL 0.6% TBA溶液，混匀，沸水浴反应15 min，迅速冷却，3 500 r·min-1离心10 min，取上清液分别测定OD532nm、OD600nm和OD450nm值，根据公式计算MDA含量(nmol·L-1)。MDA=6.45×(OD532nm-OD600nm)-0.56×OD450nm。

1.3 数据处理

采用Excel 2003进行数据处理，DPS 6.0中Duncan氏新复极差法进行数据的显著性差异分析， Design-Expert 8.0.6进行响应曲面分析及逐步回归分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的测定

(2)最优液料比的确定：称取水蜡树果实粉1 g，分别以液料比为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1的比例加入60%乙醇，以最优超声(150 W)时间处理后，定容到50 mL，测定黄酮浓度，计算总黄酮产量。试验重复3次。

2.2 各单因素对总黄酮得率的影响

液料比、超声时间、乙醇体积分数对水蜡树果实总黄酮得率的影响见表2。结果表明：液料比在10∶1时总黄酮得率最大，之后随着料液比的增加，总黄酮得率逐渐减少，因此液料比为10∶1时最为合适(P<0.05)。超声时间在10 min时总黄酮得率最大，之后随着超声时间的延长，总黄酮得率逐渐减少，故超声时间为10 min时最为合适(P<0.05)。乙醇体积分数从20%增大到60%时，总黄酮得率也在增加，而从60%增大到100%时，总黄酮得率则下降。因此，认为其他条件都确定的情况下，乙醇体积分数为60%时最为合适(P<0.05)。

表2 液料比、超声时间、乙醇体积分数对总黄酮得率的影响 Table 2 Effect of solvent∶substrate ratio,ultrasonic application duration and ethanol concentration for flavonoid yield

液料比/(mL·g-1)黄酮得率/(mg·g-1)超声时间/min黄酮得率/(mg·g-1)乙醇体积分数/%黄酮得率/(mg·g-1)5∶13 04±0 13b52 46±0 10cd201 30±0 03e10∶15 20±0 33a104 94±0 15a401 57±0 15d15∶12 39±0 11c153 36±0 12b604 78±0 25a20∶11 97±0 03d202 69±0 10c803 91±0 12b25∶11 68±0 10d252 29±0 28d1002 24±0 17c

注：同列数据后不同小写字母表示经Duncan氏新复极差法检验差异显著(P<0.05)。

2.3 响应曲面法优化分析

2.3.1 回归模型的建立及方差分析 响应曲面试验结果见表3，对其进行多元回归拟合，得到以水蜡树果实总黄酮得率(y)为响应值的模拟方程：y=4.78+0.62A+0.34B-0.06C+0.22AB+0.0075AC-0.063BC-2.4A2-1.33B2-1.19C2。该回归模型F检验结果极显著(P<0.01)，失拟项不显著(P>0.05)，决定系数R2=0.9952，调整系数 R2=0.9866，精密度值为30.481>4，说明该模型与实际相符合，且误差较小，可以反映所研究因素与水蜡树果实黄酮得率之间的关系，且在总变异中只有1.34%不能用此模型解释。

表3 总黄酮得率的响应曲面试验分析方案及结果 Table 3 Design and result of response surface methodology for flavonoid yield

编号液料比A/(mL·g-1)超声时间B/min乙醇体积分数C/%黄酮得率/(mg·g-1)编号液料比A/(mL·g-1)超声时间B/min乙醇体积分数C/%黄酮得率/(mg·g-1)11(15∶1)1(15)0(60)2 109-1(5∶1)010 50210(10)1(80)1 7510-1100 4130(10∶1)112 621101-12 8640004 84120-111 7850004 7913-1-100 4460004 7014-10-10 6471-1(5)01 24150-1-11 77810-1(40)1 86

作为美术特长生教师必须不断学习，努力提高自身的美学知识水平、绘画和美术创作能力。美术教师自身有高水平的美术欣赏创作能力，在教学过程中才能有理有据，指导学生学好美术基础知识。因此，作为美术教师必须发挥自己的兴趣特长、提高自身的绘画能力，破除自我封闭性，开阔教学视野，加强横向联系，积极参加学术交流与美术创作。美术教师自身还应有较高的教育水平，只有这样才能为学生所信服，美术教师不等于画家，画家是通过作品的交流来获得价值，而教师的价值则是在通过向学生传授美术知识，培养美术鉴赏能力与绘画创作能力的教学过程实现的。

2.3.2 因素间交互效应分析及最佳工艺研究 依据回归模型绘制3D曲面图(图1～3)，图1为液料比10∶1时超声时间和乙醇体积分数对得率的交互作用，由于其等值线为圆形，可知两者交互作用不显著。当乙醇体积分数达到59%～61%时，得率达到最大值。图2为乙醇体积分数为60%时液料比和超声时间对得率的交互作用。由于曲面比较陡峭，液料比和超声时间对得率的影响都很明显，而二者的交互作用经逐步回归分析后达到显著水平(P<0.05)。当超声时间在10～11 min时，得率达到最大值。图3为超声时间为10 min时液料比和乙醇体积分数对得率的交互作用。液料比对得率的影响很明显，但与乙醇体积分数的交互作用却不明显(P=0.9367)。当液料比过高或过低时，得率随乙醇体积分数的变化较为明显。当液料比在10∶1～12.5∶1时，得率达到最大值。

图1 超声时间和乙醇体积分数对总黄酮得率的影响 Fig.1 Response surface analysis for interactive effect of ultrasonic application duration and ethanol concentration on yield of flavonoids

图2 液料比和超声时间对总黄酮得率的影响 Fig.2 Response surface analysis for interactive effect of solvent∶substrate ratio and ultrasonic application duration on yield of flavonoids

图3 液料比和乙醇体积分数对总黄酮得率的影响 Fig.3 Response surface analysis for interactive effect of solvent∶substrate ratio and ethanol concentration on yield of flavonoids

总黄酮得率/(mg·g-1)=(总黄酮浓度×稀释倍数×提取液体积)/(样品量×1000)。

2.4 水蜡树果实总黄酮在小鼠体内的抗氧化作用

其中Γ是场效应增强系数，F是场强，.ni 是本征载流子浓度。τn和τp分别是电子和空穴的寿命， Ei和ET分别是本征费米能级和复合中心能级。k是玻尔兹曼常数，T是绝对温度，ћ是狄拉克常数，q是单位电子的电荷，mt*是电子的有效隧穿质量。

由表4可知，通过灌胃水蜡树果实总黄酮12 d后，与对照组(C)相比，小鼠肝组织中MDA含量极显著下降(P<0.01)，且随给药剂量的增加而显著下降，分别降低了34.43%、56.29%、86.09%，给药组之间差异极显著(P<0.01)。与对照组(C)相比，小鼠肝组织中SOD活性明显增高(P<0.01)，分别升高了61.93%、127.39%、140.45%；其中，与低剂量组(L)的SOD活性比较，中(M)、高剂量组(H)极显著升高(P<0.01)，而在中(M)、高剂量组(H)之间差异不显著(P>0.01)。说明水蜡树果实总黄酮能显著降低小鼠肝组织的MDA水平，并明显提高SOD活性。

表4 水蜡树果实总黄酮对小鼠肝匀浆MDA和SOD的影响 Table 4 MDA content and SOD activity in livers of mice fed with total flavonoids from fruits of L. obtusifolium

处理组数量/只剂量/(mg·kg-1)MDA/(nmol·mL-1)SOD/(U·g-1)C组1001 51±0 23A7 12±1 98CL组10300 99±0 10B11 53±1 19BM组101000 66±0 19C16 19±1 83AH组102000 21±0 08D17 12±1 03A

注：同列数据内不同大写字母表示经Duncan氏新复极差法检验差异极显著(P<0.01)。

3 讨论与结论

为了有效地利用水蜡树资源，以其果实为原料，采用控制变量法考查了影响总黄酮得率的3个主要因素：液料比、超声时间和乙醇体积分数。乙醇作为提取剂，安全无毒、经济环保且可回收利用[11]，但其体积分数对总黄酮得率的影响在3因素中最小。用60%乙醇提取时，得率最高，说明水蜡树果实中中等极性的黄酮苷类物质含量较高；当乙醇体积分数大于60%时，由于溶剂极性的降低而致使黄酮苷的溶解度下降，同时还会使脂溶性物质，如叶绿素等溶出量增加，进而给后续的分离纯化步骤造成不便。超声时间为10 min时，得率最高，大于10 min时得率下降。可见，在采用超声辅助提取过程中，由于超声的热效应，温度以0.25℃·min-1的速率上升，所以长时间的超声处理会导致热敏感组分转化降解，导致溶剂挥发而使乙醇体积分数降低，反而降低了提取率[11]。在一定条件下，液料比升高，得率升高，可能是由于提取溶剂较少而导致提取液浓度较高，固相与液相之间的浓度梯度小，使总黄酮不能完全溶出；液料比大于10∶1，得率反而有所下降，究其原因可能是由于溶剂量增多造成杂质溶出过多而阻碍黄酮的溶出，反而降低了黄酮的得率[12]，同时溶剂过多会造成资源浪费并对后续分离纯化步骤不利。因此，本试验确定最优单因素条件为：液料比10∶1、超声时间10 min和乙醇体积分数60%。在确定单因素的影响范围后，结合响应曲面分析得到了最优提取工艺，进一步验证提取工艺后，水蜡树果实总黄酮得率为(4.83±0.03)mg·g-1，明显高于张欣等[13]的水蜡树果实总黄酮得率(1.79 mg·g-1)。造成这种差异的原因可能与提取方式不同有关，张欣等[13]采用索氏提取器辅助提取，而本试验采用超声辅助提取法，说明超声辅助对水蜡树果实总黄酮的提取更有益。同时，本试验的总黄酮得率还高于俞灵芳等[12]的女贞果实黄酮的得率(3.2 mg·g-1)，可见同属于女贞属的水蜡树果实黄酮含量较女贞果实的高，有一定的利用价值。

各因素对得率的影响由强到弱依次为A料液比>B超声时间>C乙醇体积分数。在交互作用存在下，对得率的影响依次为AB>BC>AC。其中，A、B、A2、B2和C2对得率的影响均达到极显著水平(P<0.01)，而C、AB、AC和BC对得率无明显的影响(P>0.05)，因此，需要采用逐步回归分析法剔除不显著项，建立回归方程得：y=4.78+0.62A+0.34B-0.06C+0.22AB-2.4A2-1.33B2-1.19C2。该方程所包括的自变量大为减少，但对因变量的回归贡献并未受到显著影响(R2=0.9947)，体现出了较好的可操作性，有利于实际应用，为最优回归方程。

近年来，韩国一直在扩大中国游客多次往返签证数量，专家指出，韩国应考虑给予中国游客免签待遇以增强吸引力。

张崇坚等[14]通过大孔树脂纯化枸杞黄酮的回收率可达85.64%，而本试验利用大孔树脂对提取的水蜡树果实黄酮进行初纯化，纯化率为73%，损失还是较大的。因此，还需探讨水蜡树果实总黄酮的纯化工艺，对上样浓度、大孔树脂径高比、上样液流速等条件进行探究。

生物体存在着一套完善的氧化、抗氧化体系，正常情况下通过机体内各种抗氧化物质和抗氧化酶维持在稳定的范围内[15]。SOD是体内清除的主要酶，对机体的氧化与抗氧化平衡起重要作用[16]。MDA浓度的高低代表机体内不饱和脂质的过氧化程度，可以间接地反映出细胞膜的损伤程度[17]。近年来，植物中总黄酮被称之为“天然的自由基清除剂”，可以增强氧自由基清除酶的活性[18]，具有明显的抗自由基作用及体内抗氧化功能。李全国等[19]发现枣叶总黄酮具有较好的抗氧化能力。孙丽萍等[20]表明油菜蜂花粉黄酮醇苷组分能够显著地降低脂质过氧化小鼠肝匀浆和血清中MDA含量，提高小鼠SOD活性。王安银等[21]发现胡杨叶中总黄酮提取物可显著提高小鼠血清和肝组织中SOD的活性，降低MDA含量，并可有效地清除羟自由基和超氧自由基。同样，本试验发现水蜡树果实总黄酮也具有良好的抗氧化活性，在试验剂量范围内可以显著提高小鼠肝组织中61.93%～140.45%的SOD活性，明显降低肝组织中34.43%～86.09%的MDA含量，可见水蜡树果实总黄酮提高了机体抗氧化酶的活性，降低了脂质过氧化物MDA的含量，进而在一定范围内表现出抗氧化作用，减缓氧自由基对机体损伤，而其抗氧化机理还有待深入研究。

本试验以水蜡树果实为原料，采用超声辅助法以液料比、超声时间、乙醇体积分数进行响应曲面试验设计提取黄酮，得到最佳提取工艺参数：液料比11∶1(mL∶g)、超声时间11 min和乙醇体积分数60%。在此工艺条件下，水蜡树果实总黄酮的实际得率为4.83±0.03 mg·g-1。体内抗氧化试验结果表明水蜡树果实总黄酮可以明显降低肝组织中34.43%～86.09%的MDA含量，显著提高小鼠肝组织中61.93%～140.45%的SOD活性，具有良好的抗氧化作用。本试验从水蜡树果实总黄酮的提取工艺和抗氧化活性方面出发，虽为水蜡树果实的深加工提供了一定的理论基础，但目前还需探讨水蜡树果实总黄酮的纯化工艺和抗氧化机理，从而为水蜡树果实总黄酮的开发利用提供更为有力的依据。

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