1 引 言

水稻作为重要的粮食作物，是全球超过一半以上人口生存的食物来源，深入了解水稻生长发育过程及调控具有重要意义[1]。蛋白质作为基因功能的最终表现者和生物体性状的直接参与者，在蛋白质水平研究水稻发育生物学更具有直接性[2,3]。目前，植物蛋白质组学的分离分析主要分为双向电泳技术 (2-DE) 和多维液相色谱技术[4,5]。双向电泳技术是经典的蛋白质组学研究方法，但是其本身具有对分离极酸、极碱等蛋白的限制和无法与质谱直接联用等不足，而近年出现的基于液相色谱-串联质谱技术逐渐在蛋白质组学研究领域发挥越来越重要的作用[6,7]。多维液相色谱主要通过不同维数色谱对肽段的保留机制差异，提高分辨率及增加系统峰容量，改善复杂样品的分离分析[8]。因此，选择合适的色谱类型组合是建立多维液相色谱系统的关键。现已建立的多维液相色谱主要是二维液相色谱，如离子交换-反相色谱[9]、反相-反相色谱[10]、亲水作用-反相色谱[11]等。离子交换-反相色谱 (SCX-RP) 具有良好的正交性，是最早应用于蛋白质组学研究的二维液相色谱。但是，大多数肽段所带电荷量相似 (+1、+2、+3)，导致保留能力相似，分离效率较低，此外脱盐过程也会有蛋白损失。这些因素都使得SCX-RP在蛋白质组学分析中存在局限[9,10]。研究表明，除选择不同的固定相外，改变流动相酸碱度也可实现二维液相色谱对肽段保留的差异，例如二维反相-反相色谱 (RP-RP) 通过色谱间急剧变化的流动相酸碱度，实现肽段电荷分布差异，进而实现肽段选择性分离分析[12]。

由于二维反相-反相色谱均通过疏水性实现对肽段的选择，反相-反相系统在复杂肽段分离中不能提供良好的正交性[12]。依据对肽段的不同保留机制和对复杂体系高效的分离能力而建立的亲水作用-反相色谱 (HILIC-RP)为多维液相色谱分离技术开创了新的思路[13,14]。Chen等[15]采用在线亲水色谱-反相色谱分析大肠杆菌溶菌酶蛋白质组学。亲水作用-反相色谱已广泛应用于人类及动物体蛋白质组学的分析，但在植物蛋白质领域应用较少，主要是由于植物体本身的次生代谢物等杂质一定程度上干扰色谱分离[16]。至今尚未见将亲水作用-反相色谱应用于水稻器官或组织水平的蛋白质组分析的相关报道。

近年来，在复杂的蛋白质组学实际样品分析中，馏分收集技术被广泛应用于反相-反相二维液相色谱系统，提高了系统分离正交性[17,18]。首先将复杂样品经过一维色谱预分离出多组馏分，各组馏分按照一定的组合方式 (如时间方式) 组合，再进行第二维色谱及质谱的分析。Dwivedi等[17]将馏分收集技术应用到反相-反相二维液相色谱，提高了系统正交性，蛋白质的鉴定量增加了近30%。此外，馏分收集技术的引入，解决了由低碱度肽段的信号抑制和低丰度蛋白的采样过疏等引起的重现性降低的问题[19]。

本研究建立了亲水作用-反相色谱分离-串联高分辨质谱的方法，应用于水稻叶片蛋白质组学分析。利用特征标准肽段系统考察了各维液相色谱在不同酸碱度条件下对二维液相色谱系统分离正交性的影响。此外，由于水稻叶片中蛋白复杂，馏分收集的引入可进一步降低由质谱数据依赖模式扫描对蛋白质的覆盖，提高鉴定重现性，为获得更全面的水稻叶片中蛋白质种类的研究奠定了基础，以促进蛋白质组学对水稻器官发育调控机理等方面的研究，为植物性蛋白质组学研究提供技术参考。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

高效液相色谱-串联四级杆飞行时间质谱系统用于标准肽段评价二维亲水作用-反相色谱系统的正交性，包括1260高效液相色谱仪、6545 四极杆飞行时间液相色谱-质谱联用系统 (美国Agilent公司)。水稻叶片样品的蛋白质簇分析采用离线模式HPLC-Nano-RPLC-MS/MS系统，包括1200高效液相色谱仪、馏分收集装置 (美国Agilent公司); Finnigan Surveyor 液相色谱和LTQ线性离子阱质谱 (Thermo-Electron Finnigan公司)。真空冷冻干燥机 (美国Labcinco公司); UV-2600紫外分光光度计(日本岛津公司)。固相萃取小柱(美国3M公司)。

二硫苏糖醇 (Dithiothreitol, DTT)、碘乙酰胺 (Iodoacetamide, IAA)、NH4HCO3、KCl、乙二胺四乙酸 (EDTA)、三 (羟甲基) 氨基甲烷 (Tris-HCl)、蔗糖、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐 (CHAPS)、甲酸和氨水(美国Sigma公司); 饱和酚溶液 (pH 7.9±0.2)、牛血清蛋白 (BSA)、 BCA蛋白质定量检测试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司); 胰蛋白酶 (Trypsin，美国Promega公司)。21种标准肽段均合成于上海强耀生物科技公司, 基本信息见表1。所用试剂均为分析纯或更高纯度。实验用水为Mill-Q水处理系统 (美国Millipore公司) 纯化的超纯水。水稻叶片收集于自培水稻分蘖期，-80℃储存，备用。

2.2 水稻叶片蛋白的提取、酶解

如果洗澡次数过于频繁、水温过高，或使用碱性较大的肥皂或者药皂，也容易破坏本来就不健全的皮脂膜，令皮肤屏障功能减弱，“砖墙”外露，发生皮肤瘙痒。

2.3 利用标准肽段评价二维亲水作用-反相色谱系统正交性的液相及质谱采集条件

为了得到的数据更加完整和准确，本研究确立了多个统计对象：浙江省农业厅休闲观光协会处得到的“各地区农庆节庆活动调查”资料；百度首页搜索的结果，输入“城市名”+“果名”+节，如“杭州蜜梨节”，“浙江省“2012’四季鲜果采摘游系列活动”中以时鲜水果采摘游的形式串成一线的35个优秀农庆节庆活动；“最具影响力农庆名单”中与果树观光采摘相关的节庆；“浙江省优秀农庆节庆名单”中与果树观光采摘相关的节庆。

质谱采集的数据通过Proteome Discoverer软件 (Version 2.0 Thermo Fisher Scientific)，利用SEQUEST HT检索算法在水稻数据库 (Oryza sativa subsp. Japonica (Rice). fasta) 中进行检索鉴定。检索参数为： 胰蛋白酶酶切，允许最大漏切位点为2，前体离子的质量容忍度为20 ppm，碎片离子的质谱容忍度为0.6 Da，半胱氨酸残基C端+57 Da设为固定修饰，Met (M) +15.995 Da设为可变修饰，使用Percolator卡值保证所有肽段鉴定信息假阳性率≤1%。

表1 标准肽段蛋白肽段位、氨基酸序列、分子量、等电点、疏水性、保留时间和质谱峰强度

Table 1 Peptide position, amino acid sequence, molecular weight, calculated hydrophobicity (GRAVY), retention time (RT), intensity and isoelectric point (pI) of standard peptides

肽段编号Peptidecode肽段位置Peptideposition氨基酸序列Sequence分子量Mwa等电点pIa疏水性GRAVYa保留时间RTc(min)谱峰强度Intensityd1Q650W6[253-262]bLVQLFSEHGK1157．3357．5-0．0732．654．42×1062Q0JBS2[49-68]SSGGGGGTNPGPKPGDDESK1800．8134．3-1．638．00005．83×1073A0A0N7KFT8[35-56]SGGEASAASSSSSGSGDAKPVK1923．9656．4-0．593．9921．74×1064Q75M32[164-171]TFKDENFK1028．1296．4-1．6817．2901．89×1065Q40677[338-347]TWGGQPENVK1115．2116．4-1．429．1296．32×1066P12085[3-18]TNPTTSRPGVSTIEEK1716．8667．4-1．1414．4635．9×1077P0C2Z6[492-500]EAIQEQLER1115．2083．9-1．2715．1491．75×1068P0C5D5[129-145]AGAEVIGISGDDAASHK1597．7024．30．0011．952．76×1069A3BLC3[97-109]AIETVQNNFNTVR1505．6507．4-0．4519．0685．05×10710P0C422[19-32]VGNLLKPLNSEYGK1531．7729．6-0．5121．8721．17×10611Q9ZP20[121-136]VNTDDSPNIATNYGIR1749．8543．9-0．7827．0861．66×10612Q0D5P8[76-96]LGPPPPPSGGLPGTLNSDQAR2028．2527．4-0．7334．7865．38×10613Q6ZF30[123-132]VDFKEPVWFK1294．5166．4-0．3339．9791．18×10614Q7X8A1[89-106]GDSSPLDVIAINDTGGVK1757．9153．60．0046．4056．15×10715Q0DEU8[221-232]FEALGWHTIWVK1486．7367．50．3051．4935．05×10716Q7XV11[193-204]FFDPLGLGGETR1308．4564．2-0．152．4843．34×10617Q7XZW5[315-331]AGAEEVLPLGPLNDFER1827．0243．7-0．2460．3473．74×10618Q6ZBZ2[70-92]AAVTPAFVGQFPGVNGLGISAAR2200．52511．20．7783．9531．28×10619Q8GTK4[165-192]TDSEGGFESDAVATANILESSAPVVGGK2708．8723．5-0．0637．5202．35×10620Q69S39[188-217]VVSQVPWFGIEQEYTLLQR2292．6194．5-0．01101．2041．25×10621P14655[175-193]GPAPLSLALVHADVDDGKVLFVPWVETDFR3264．7284．20．5099．8761．36×107a：标准肽段的相关参数(Mw、pI和GRAVY)的计算通过ExPASy在线工具(http：//www．expasy．org)；b：蛋白序列号来源于NCBI；c：标准肽段在纳升级反相色谱中的保留时间；d：标准肽段在质谱中峰强度。a：Theparametersofstandardpeptides(Mw、pIandGRAVY)wereestimatedonhttp：//www．expasy．orgwithProtParam．b：TheproteinaccessionnumbersweresearchedfromNCBI．c：RetentiontimeofstandardpeptidesinNano⁃RP⁃LCsystem．d：TheintensityofstandardpeptidesinNano⁃LC⁃MS/MS．

2.4 水稻叶片样品分析系统液相及质谱条件

在反相色谱流动相为酸性的基础上，亲水作用色谱从酸性上升到中性，21种标准肽段在二维液相色谱系统的正交性几乎未受影响(图2D和2E); 但当亲水作用色谱从中性上升到碱性，二维液相色谱对肽段的保留行为表现出明显差异，校正保留时间线性拟合系数从0.59887降低到0.34113(图2E和2F)。以肽段2和21为例, 亲水性肽段2 (GRAVY=-1.625) 从HILIC色谱柱到RP色谱柱的保留时间从50 min缩短到14 min; 疏水性肽段21 (GRAVY=0.503) 在两维色谱的保留时间从25 min延长到116 min。综上所述，pH 9.3和pH 3.3分别被选择为亲水作用色谱和反相色谱的流动相酸碱度。

蛋白质提取和酶解参照文献[20]的方法。提取： 研磨分蘖期水稻叶片，称取3 g 叶片粉末，加入20 mL蛋白提取缓冲液，振荡混匀; 加入等体积饱和酚，混匀，4℃振荡后，离心收集上层酚相; 重复2次上述步骤; 将3次收集酚相汇总，加入0.1 mol/L 乙酸铵的甲醇溶液， -20℃沉淀过夜; 4℃振荡离心，弃上清液; 甲醇、丙酮清洗沉淀; 晾干，加入蛋白裂解液，离心，取上清液，测定蛋白浓度。酶解： 为保证二维液相色谱上样浓度，取适量上述粗蛋白，加入适量1 mol/L DTT，于37℃振荡; 加入适量IAA，避光放置烷基化; 加入适量50 mmol/L NH4HCO3溶液，保持尿素浓度低于2 mol/L; 按照底物与酶质量比50∶1加入胰蛋白酶，于37℃酶解过夜; 加入甲酸终止反应。酶解结束，样品经固相萃取小柱除盐，冷冻干燥，备用。

作为中国古代最长的抒情诗，《离骚》更多的是直抒胸臆，表达了虽处境困厄却坚守节操的主题。司马迁在《史记·屈原贾生列传》中这样陈说《离骚》的创作背景：“屈原正道直行，竭忠尽智以事其君，馋人间之，可谓穷矣。信而见疑，忠而被谤，能无怨乎？屈平之作离骚，盖自怨生矣。”虽“怨生”，但仍可见屈原对高尚品格的追求不懈。

图1 馏分收集组合示意图 Fig.1 Scheme of concatenation strategy for fraction collection

第二维纳升液相色谱系统采用Thermo EASY 1000 Nanoflow液相色谱仪，色谱条件： Acclaim PepMap RSLC色谱柱 (15 cm × 50 μm, 2 μm)和Acclaim PepMap 100 Trap柱(2 cm × 70 μm， 3 μm); 流动相： (A) 0.1%甲酸, (B) 0.1%甲酸-乙腈; 流速： 0.3 μL/min; 进样体积： 2 μL。梯度洗脱： 0～4 min， 4%～8% B; 4～106 min，8%～30% B; 106～116 min，30%～90% B; 106～120 min，90% B。

多维液相色谱系统由于各维色谱分离机理的差异，对复杂样品分离表现出较高的分辨率和峰容量。多维液相色谱正交性是衡量各维色谱分离机理差异的一个指标，也是影响相色谱分离能力的重要因素[11]。

2.5 数据分析

RP色谱条件为： XBridge peptide C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm, 3.5 μm); 流动相包括2种酸碱度体系，依次为酸性体系： (A)0.1% 甲酸溶液 (pH 3.3)，(B)0.1% 甲酸 (乙腈-水，9∶1，V/V); 碱性体系： (A)5 mmol/L NH3·H2O (pH 9.3)，(B)5 mmol/L NH3·H2O (乙腈-水，9∶1，V/V)。流速：0.5 mL/min，进样体积： 5 μL。柱温： 25℃。液相梯度洗脱如下： 0～4 min，4%～8% B; 4～106 min， 8%～30% B; 106～116 min，30%～90% B; 116～120 min，90% B; 120～135 min, 4%B。质谱条件： 离子化模式： 正离子模式; 2 GHz，调谐范围： m/z 100～1400; 干燥气温度及流速： 350℃ 和11 L/min; 鞘气温度及流速： 350℃ 和12 L/min; 碎裂电压： 135 V; 锥孔电压： 45 V; 采集质量范围： m/z 100～1400。内标参比离子： 嘌呤 (m/z 121.050873) 与 HP-0921 (m/z 922.009798)。

（3）数据结果及分析。从表1数据可知，底泥样品pH均值为7.7，为中性偏碱；而在EC方面，其均值为689μS/cm，是正常土壤EC的范围（100～300μS/cm）最大值的2倍多，显示出底泥中存在高浓度的游离离子；NAG-pH均值为8.6，大于产酸阈值5.0，无产酸能力，净产酸NAG为0kg H2SO4/t。在营养情况方面，底泥样品总氮和总磷含量均较低，均为0.4g/kg，分别为缺乏和甚缺乏水平。另外，我们测定了底泥样品总钙和有效钙的含量，其均值分别为115 842mg/kg和96535mg/kg，可以看出底泥样品中总钙和有效钙均非常高。

HILIC色谱条件： XBridge Amide色谱柱(250 mm × 4.6 mm, 3.5 μm); 流动相包括3种酸碱度体系，依次为酸性体系： (A)10 mmol/L 甲酸铵 (pH 4.5)，(B)10 mmol/L 甲酸铵 (乙腈-水，9∶1，V/V); 中性体系： (A)10 mmol/L 甲酸铵 (pH 6.8)，B： 10 mmol/L 甲酸铵 (乙腈-水， 9∶1， V/V); 碱性体系： (A) 5 mmol/L NH3·H2O, (B) 5 mmol/L NH3·H2O (乙腈-水，9∶1，V/V)。流速： 0.5 mL/min，进样体积： 5 μL。柱温： 25℃。液相梯度洗脱程序： 0～60 min，90%～60% B; 60～80 min，60%～40% B; 80～88 min，40%～10% B; 88～103 min，10% B。

3 结果与讨论

质谱鉴定利用Thermo LTQ线性离子阱质谱仪，质谱条件： Nano源，正离子扫描方式，设置离子传输毛细管温度为300℃; 电喷雾电压： 1.9 kV; 归一化碰撞能量为35%。数据依赖模式对MS和MS/MS进行图谱信息扫描，扫描方式为全扫描 (m/z 300～2000)，全扫描中丰度最高的10个离子峰进行MS/MS扫描。动态排除 (Dynamic exclusion) 设置为： 重复次数为1次，动态排除时间 (Exclusion duration) 为30 s，采用Xcalibur软件进行系统数据处理。

给排水工程对于城市现代化有着重要作用，在工程建设过程中，做好质量控制，一方面可以确保给排水管道的质量能够满足人们的应用需求，另一方面可以确保工程建设的经济效益，从而促进城市的健康发展。

3.1 利用标准肽段评价二维液相色谱正交性

目前，肽段保留时间图谱法 (Peptide retention time plots) 因其数据处理简便和直观，在利用标准肽段评价系统正交性分析中广泛应用，以肽段在各维液相色谱的保留时间 (或相对保留时间) 为横、纵坐标，绘制保留时间图谱，计算保留时间线性回归系数 (Correlation coefficient，R2),评价多维液相色谱正交性[21,22]。本研究在亲水作用色谱和反相色谱系统中，利用标准肽段考察了各维液相色谱在不同酸碱度条件下对二维液相色谱系统分离正交性的影响，并选择最佳酸碱度组合方式，实现二维液相系统正交性最大化[23]。在预实验中，利用一维纳升液相色谱系统预分离，结合质谱技术 (相关仪器参数见2.4节)，分析肽段的等电点、疏水性、肽段长度 (氨基酸数)、质谱峰强度以及肽段在色谱中的保留时间，选择氨基酸数目在8～30之间、肽段疏水性 (GAVAY) 在-1.675～0.77之间，以色谱保留时间横跨前、中、后时间段且质谱响应超过105的肽段为特征肽段 (见表1)。

试验组患者的临床治疗有效率为77.08%，对照组患者的临床治疗有效率为46.15%，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

参照文献[21]，本实验考察了亲水作用色谱在酸 (pH 4.5)、中 (pH 6.8)、碱 (pH 9.3) 条件下及反相色谱在酸 (pH 3.3)、碱 (pH 9.3) 条件下对二维系统正交性的影响。本研究未讨论反相色谱在中性条件下对分离度的影响，因文献[24]表明反相色谱在中性条件下对大多数肽段的保留与在酸性条件下保留相似。如图2所示，在任一酸碱度下，亲水作用色谱和反相色谱均表现出明显的分离正交性。值得注意的是，相比于反相色谱在碱性条件下，酸性条件的反相色谱与任一酸碱度下的亲水作用色谱组合形成的二维液相色谱系统对标准肽段保留分布更加分散，校正保留时间线性拟合系数越小，正交性越好。因此，选择pH 3.3作为反相色谱流动相的酸碱度。

第一维液相色谱系统HILIC色谱条件： XBridge Amide色谱柱(250 mm × 4.6 mm, 3.5 μm); 流动相组成： (A) 5 mmol/L NH3·H2O, (B) 5 mmol/L NH3·H2O (乙腈-水，9∶1，V/V)，流速： 1 mL/min，进样体积： 50 μL。梯度洗脱： 0～60 min, 90%～60% B; 60～80 min, 60%～40% B; 80～88 min，40%～10% B; 88～92 min, 10% B; 92～107 min, 90%B。 采用自动馏分收集器，馏分收集时间: 0～90 min，按照时间方式每分钟收集为1个组分。 将组分按照时间顺序编号(V1～V90)。根据文献[20]报道，前10 min，高有机比例肽段含量较少，按照V1～V5、V6～V10 方式合并成2个组分; 编号V11～V90的组分按照顺序合并成20个组分，共计22个组分，具体合并方式见图1。合并后的组分通过真空旋转浓缩至干，以0.1% 甲酸复溶，离心，取上清液，供第二维液相色谱分析。

此外，反相色谱因分离效率高、流动相与质谱兼容等优点被广泛应用于二维液相色谱系统的最后一维 [12,23]，因此选择亲水作用色谱和反相色谱分别作为二维液相色谱系统的第一维和第二维。

图2 21种标准肽段在不同酸碱度下的HILIC-RP系统的校正保留时间图 Fig.2 Normalized retention time plots of 21 peptides at different pH for hydrophilic interaction-reversed-phase (HILIC-RP) liquid chromatography system (A) HILIC pH 9.3 versus RP pH 9.3; (B) HILIC pH 4.5 versus RP pH 9.3; (C) HILIC pH 6.8 versus RP pH 9.3; (D) HILIC pH 4.5 versus RP pH 3.3; (E) HILIC pH 6.8 versus RP pH 3.3; (F) HILIC pH 9.3 versus RP pH 3.3

3.2 结合馏分收集技术评价二维液相色谱技术在水稻叶片蛋白质分析中的正交性

根据3.1节的结果，本研究建立的二维亲水作用-反相液相色谱分析21种特征标准表现出较好正交性，但其在分析复杂蛋白质组学实际样品的正交性还需要进一步验证。实际复杂蛋白质组学样品在二维液相色谱结合馏分收集系统中的正交性评价主要通过分析质谱鉴定到的肽段在所有馏分中出现次数[19]及肽段在色谱中分离分布情况[24]。本研究通过分析实际水稻叶片中鉴定到的所有肽段在22个馏分收集组分中出现的次数，评价二维液相系统在实际样品分析中的正交性。如图3A所示,约50.7%肽段在22个馏分收集组分中出现次数不超过2次; 图3B所示，一维液相色谱馏分收集组合后，肽段在第二维色谱及质谱分离分析中，可以较好地分布在不同时间段的洗脱窗口，此结果与文献[13]一致，且21种标准肽段在实际样品分析的22个馏分组分中均匀分布，说明采用亲水作用-反相二维色谱法结合馏分收集技术分析水稻叶片蛋白质具有良好的分离正交性。

图3 (A) 肽段在22个馏分收集组分中鉴定次数图; (B) 馏分收集组在第二维液相色谱系统保留时间分布图 Fig.3 (A) Frequency of peptides identification profile across 22 fractions; (B) Retention time of pooled fraction on the second dimensional LC-MS/MS system. The number 1-21 from panel B are expressed as the standard peptides

3.3 水稻叶片蛋白质结果分析

图4 3次水稻叶片蛋白质鉴定结果重复性分析 Fig.4 Reproducibility of triplicate identification results for rice leaves proteomics

分蘖期水稻叶片根据2.2节样品前处理后进行二维液相色谱-串联质谱分析。由于实际样品的复杂性以及质谱数据依赖模式无法在有限时间内分析所有的共洗脱肽段[19]，本研究每组分样品进行3次重复质谱分析，将质谱分析数据在水稻蛋白质库中进行检索，3次重复共鉴定到207345个肽段，归属于2930个蛋白质簇，其中3次共同鉴定到的蛋白质簇为1374个，占3次鉴定蛋白质簇总数的51.1%，而单次鉴定到的蛋白质簇从第一次的235个逐渐减少到第三次的60个，第三次鉴定蛋白质簇数目仅约占鉴定总数的2.2%，说明3次重复质谱分析可实现对大多数蛋白质簇 (86.6%) 的可靠鉴定(图4)。相比于Breci等[25]采用阳离子交换-反相二维液相色谱鉴定水稻叶片蛋白，本研究多鉴定到200349个肽段和2352个蛋白质簇。可能是由于相比于阳离子交换色谱，亲水作用色谱更能提供较为特异性的分离能力[21,26]，使得肽段在梯度时间内均匀分布，相对延长了质谱采集时间，因而增加了蛋白鉴定量。在阳离子交换-反相系统中，为实现与质谱的良好匹配，色谱分离得到的高盐分肽段混合物需要经过多步脱盐，此过程可能会导致肽段损失，降低鉴定效率。

图5 水稻提取蛋白质Gene Ontological 分析： (A) 生物进程， (B) 分子功能， (C) 细胞组分 Fig.5 Pie chart distribution of centipede proteins identified on gene ontological. (A) Biological process; (B) Molecular function; (C) Cellular component

根据生物信息学工具PANTHER进行聚类分析[27,28]，考察了水稻叶片蛋白质的细胞组分、生物进程以及分子功能，具体分布如图5所示，图中数值代表具有该功能的蛋白质占总鉴定蛋白质的百分比。从分子功能分布图(图5B)可见，鉴定到的蛋白质其分析生物学功能主要有催化活性 (Catalytic activity)、结合活性 (Blinding activity)、结构组成 (Structural molecule activity)、运输活性 (Transporter activity) 等，其中催化活性相关的蛋白质鉴定量约占55.1%，例如具有酶催化活性的蛋白质包括异构酶、氧化还原酶和水解酶等。

4 结 论

建立了亲水作用-反相二维液相色谱串联质谱鉴定水稻蛋白质的方法。碱性条件下 (pH 9.3) 的亲水作用色谱和酸性条件下 (pH 3.3) 的反相色谱组合，提高了分离正交性; 在实际复杂水稻叶片样品分析中，引入馏分收集技术，进一步提高了色谱分离的正交性，最终鉴定到207345个肽段，归属于2930个蛋白质簇。 结果表明，本方法是一种高正交性、高分辨率的蛋白质组学分析技术，适用于大规模的蛋白质鉴定分析，为植物蛋白质组学提供了新思路和技术方法。

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