1 引 言

毒死蜱(Chlorpyrifos)，化学品名O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸，属于有机磷类杀虫剂。由于毒死蜱对哺乳动物急性毒性中等且在环境中的持久性较低，因此广泛用于我国农作物病虫害和家庭卫生害虫的防治。然而，毒死蜱的大量使用也会引发人和动物产生多种毒性反应[1,2]。

毒死蜱的急性暴露会导致神经毒性的发生，抑制乙酰胆碱酯酶活性，使神经纤维长期处于兴奋状态，正常的神经传导受阻，引发胆碱能综合症[2]。毒死蜱被人体吸收后，主要分布在肝脏、肾脏、脾脏等血流量较高的器官，经脂酶分解成一系列代谢产物[3～5]，包括3,5,6-三氯-2-吡啶醇(3,5,6-Trichloro-2-pyridinol， TCP)、二乙基硫代磷酸酯(Diethyl thiophate， DETP)、二乙基磷酸酯(Diethyl phosphate， DEP)，其结构式见图1。其中TCP是毒死蜱在人体中经肾脏排泄的最主要的代谢产物，具有抑制人体乙酰胆碱酯酶活性的作用，因此，人尿液中TCP的浓度是人体毒死蜱生物负荷的一个特异性生物监测指标，可反映毒死蜱这种外源性污染物质对人体产生的危害，如抑制人体红细胞乙酰胆碱酯酶活性以及导致血色素浓度下降等[6～8]。TCP在代谢过程中很大程度被轭合[9]。因此，尿样中含有烷基(含硫)磷酸酯和醇的碎片更具有化合物的特异性，并且测定DEP和DETP的浓度比例可以对有机磷农药代谢物的来源进一步确证，可作为人体毒死蜱生物负荷的特异性生物监测指标。

随着质谱技术的发展，检测尿液中毒死蜱代谢产物的分析方法主要有气相色谱-质谱法[10～12]和液相色谱-质谱法[12～14]。气相色谱法前处理时需要衍生化，过程较为繁琐。高效液相色谱法前处理较为简单[12]。但由于基质的复杂性，即使使用串联四极杆模式也难免造成假阳性或假阴性的误判[15]。因此需要开发灵敏度更高和选择性更优的分析方法。

这种模式同上述模式的差别主要体现在运营主体参股的阶段方面。在SPV成立时，只有投资主体和建设主体对项目公司持股，建设期结束后，可以将建设主体的全部股份或将投资主体的一部分股份出售给运营方，从而达到运营主体持有股份的目的，实操中，由于政府通常会对建设方或建设阶段有锁定期的约束，因此，需注意满足政府对锁定期的要求[2]。

目前，两大全国性雕塑双年展就看到中国美协艺委会主导的“雕塑双年展”和中国雕塑学会主导的“中国姿态雕塑大展”交替举行，轮番登场。再加上五年一次的全国美展雕塑展以及北京国际美术双年展的雕塑部分，雕塑展的盛况令雕塑家目不暇接，过去那种雕塑展荒芜的情形早已荡然无存。现在经常有这样的一种现象，那就是同样的艺术家，同样的作品到处赶场，更多的雕塑作者在感叹应付参展都忙不过来了。

(2)累计值正确，小时降水量有误。点击“数据修改”，在弹出的快速通道中，修正值栏值保持不变即为累计降水量的值0，备注信息栏填写“经查证，累计降水量无误，应将2014-02-25 04时次降水量由1改为0”，然后点击快速通道中备注信息栏旁边中的“提交”按钮提交。

2 实验部分

2.1 仪器、试剂与材料

根据毒死蜱代谢物及内标物的分子结构特征，选择电喷雾离子(ESI)源负离子模式扫描。采用半自动进样方式，以5 μL/min 的流速将100 μg/L 的标准储备液分别注入离子源; 分别考察了ESI全扫描在正、负离子模式下待测物峰的响应。结果表明，在负离子模式下，TCP、DEP、DETP及内标DBP的分子离子峰[M-H]- 分别是m/z 198、153、169和209。在较低的能量下分别对各个分子离子进行二级质谱扫描，确定目标物的特征离子峰，具体参数见表1。TCP以m/z 198为母离子，其较稳定的碎片离子只有m/z 35，且响应较弱，因此选取m/z 198为定量离子，同时选择TCP的脱氢峰m/z 196为定性离子。

毒死蜱代谢产物：硫代磷酸二乙酯(DETP)、磷酸二乙酯 (DEP)、三氯吡啶醇 (TCP)和内标磷酸二丁酯(Dibutyl phosphate，DBP)标准品(纯度>95%，德国 Dr. Ehrenstorfer公司)。DETP、DEP、TCP和DBP标准品用乙腈配制得1000 mg/L的储备液。β-葡萄糖苷酸酶(5.0×106～2.0×107 units/mg protein，美国Sigma Aldrich 公司)。乙腈(色谱纯，德国Merck公司); HCl(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。分散固相萃取填料(无水Na2SO4、PSA、GCB、NaCl，美国Agilent公司); 人体尿液由居住在江苏省某农药厂附近儿童(3～6岁)提供。

图1 毒死蜱代谢产物TCP、DEP和DETP及内标DBP的化学结构式 Fig.1 Chemical structures of chlorpyrifos metabolites TCP, DEP, DETP and internal standard DBP

2.2 样品前处理

她看了那双眼睛一下。她几乎没有一点表情。她甚至可能和原来没有我的出现时一样地照常做着她应该去做的事。她让我感觉到了我的多余。在这个世界上，我已经成了一个地地道道的多余者了。

基于尿样的基质复杂性，本实验在优化样品前处理方式的基础上，采用UPLC-QTRAP的两种采集模式，即传统的多反应监测扫描(Multiple reaction monitoring, MRM)模式进行定量检测和线性离子阱的增强子离子扫描模式(Enhanced product ion scanning, EPI)获得相应的二级碎片图进行定性确证。当使用数据依赖性获取技术(Information dependent acquisition，IDA)时，可将两种扫描模式相结合，即多反应监测-触发增强子离子扫描模式(MRM-IDA-EPI)，该种模式一次进样可以同时获得高灵敏度MRM的定量数据和二级全扫描质谱图(EPI)进行定性确认。在不降低定性和定量分析性能的同时，既能实现准确定量特定目标化合物，又能在一次运行中高灵敏地定性鉴定化合物。使用本方法对尿样中毒死蜱的代谢产物进行定性和定量分析，简便快速，并将定性和定量方法有机结合在一起，可以满足复杂基质中目标物的准确定性和定量分析要求。

2.3 色谱条件

电喷雾离子源(ESI-); 扫描模式：MRM-IDA-EPI; 离子源温度：400℃; 离子喷雾电压：5500 V; 气帘气压力：0.207 MPa; 喷雾气压力：0.241 MPa; 辅助加热气压力：0.276 MPa。EPI参数设置：探测扫描模式选择负离子模式，碰撞能量CE： -10、-25和-40 eV; 扫描速度：4000 Da/s; 扫描阈值：1000 cps。其它参数见表1。

冰冻尿样于室温下缓慢解冻，取10 mL于50 mL离心管中，加入4 mL HCl(6 mol/L)振荡，于80℃水浴条件下水解2 h。取出后降至室温。继续在尿样中加入10 mL乙腈溶液、3 g NaCl，涡旋1 min后，以8000 r/min离心分离，取上层5 mL乙腈，加入100 mg PSA、20 mg GCB、2 g无水Na2SO4，涡旋1 min后，滤纸过滤，收集滤液，旋蒸近干，N2吹干后，加1 mL乙腈，待LC-MS/MS测定。

2.4 质谱条件

ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm); 流动相：0.02%(V/V)氨水(A)和乙腈(B); 线性梯度洗脱： 0～2 min，99% A; 3～6 min，70%～5% A; 6～8 min，5% A; 13～15 min，99% A。流速：0.3 mL/min; 柱温：40℃; 进样体积：5 μL。

2.5 质量控制与保证(QA/QC)

本实验考察了ZORBAX Eclipse Plus C18(150 mm ×2.1 mm，3.5 μm)、ZORBAX SB-CN(100 mm ×2.1 mm，3.5 μm)、ZORBAX HILIC Plus C18(100 mm ×2.1 mm， 3.5 μm)3种色谱柱。结果表明， 利用ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(150 mm×2.1 mm，3.5 μm)可将4种目标物完全分离, 且响应较高; 其它色谱柱对4种物质均不能有效分离, 因此，本实验选用ZORBAX Eclipse Plus C18作为分离柱。在流动相的选择中，根据目标物分子结构特征，碱性条件可以提高化合物[M-H]- 峰的离子响应，因此采用乙腈-0.2%氨水作为流动相，通过梯度洗脱改变流动相的极性， 使混合物得到更好的分离。

3 结果与讨论

3.1 液相色谱和质谱条件的优化

根据离子对丰度比和保留时间定性，目标化合物通过与标样的保留时间(2%以内)和选择离子的丰度比与标准样品丰度比(25%以内)比较进行定性确认，并进一步使用二级谱库比对确证。采用内标法定量，选择最高丰度或背景干扰最少的选择离子进行定量分析。每一组样品中添加1 个基质空白、1 个样品重复和1 个基质加标回收进行质量控制。 方法空白样品中目标化合物含量均低于检出限。

超高效液相色谱-串联四极杆复合线性离子阱质谱(UPLC-Agilent Technologies 1290 Infinity，MS-AB SCIEX QTRAP 4500，美国); Milli-Q超纯水机(德国Millipore公司); 高速离心机(德国Eppendorf公司)。

这个跨年夜，与往年不同，为了环保减少了烟火释放量，而一场长达6分钟的声光变化表演，让烟火秀与灯光秀巧妙结合，规模非但未缩减，赞誉也收获了新高度，人们纷纷大呼过瘾。

表1 目标化合物主要的MRM参数

Table 1 Multiple reaction monitoring (MRM) parameters of target compounds

化合物Compounds母离子Parention(m/z)子离子Daughterion(m/z)碰撞能量Collisionenergy(eV)去簇电压Declusteringpotential(V)入口电压Entrancepotential(V)出口电压Collisioncellexitpotential(V)TCPDEPDETPDBP196．035．0-30-60107198．0∗35．0-30-55107153．079．0∗-25-65107153．0125．0-14-55107169．095．0∗-26-49107169．0141．0-15-57107209．079．0∗-25-70107209．0153．0-18-70107∗：定量离子(Quantitativeion)．

在优化的色谱和质谱条件下，建立MRM-IDA-EPI扫描模式。质谱分析选取对应的母离子峰，对其子离子进行二级质谱分析，得到碎片离子信息; 并对目标化合物二级质谱的CE、DP、EP、CXP 等质谱参数进行优化。在优化的MRM参数基础上建立IDA的方法。其方法原理见图2，即样品首先通过 Q1 扫描(Q1 Scan)，获取一级质谱全扫描信息，在此基础上通过阈值的设定，响应高于阈值的质谱峰将会被触发(IDA)，Q3 在离子阱(LIT)采集模式下，采用线性离子阱启动增强子离子扫描模式(EPI)，对其进行二级碎片全扫采集，获得相对应的二级碎片图。最终软件通过母离子质荷比、子离子扫描图谱、同位素丰度比等信息，进行未知色谱峰的结构确认。

图2 MRM-IDA-EPI工作原理示意图 Fig.2 Working principle diagram of multiple reaction monitoring-information dependent acquisition-enhanced quadrupole linear scanning (MRM-IDA-EPI)

3.2 尿液前处理过程优化

3.2.1 酶解条件的优化 尿液中毒死蜱代谢产物TCP以游离态和葡萄糖苷酸结合共轭态两种形式存在，且部分代谢物的结合态所占比例较高，因此对样品进行去葡萄糖苷酸的酶解处理十分必要。根据文献[16,17]，可以使用解离酶β-葡萄糖苷酸酶或酸解盐酸化解除TCP的轭合态。本实验分别采用两种方式解除TCP的轭合态：添加50 Units β-葡萄糖苷酸酶，在37℃条件下解离120 min; 添加4 mL HCl(6 mol/L)振荡，于80℃水浴条件下水解2 h。结果表明，使用葡萄糖苷酸酶会使DEP产生基质干扰，同时基线干扰较为严重; 使用HCl处理，对DEP及其它代谢产物均未产生干扰(图3)，且酸解过程对目标物分子均无破坏。同时，酸解可以降低实验成本。因此，本实验采用添加HCl(6 mol/L)解除TCP的结合态。

图3 DEP选择离子流图: (A)为采用β-葡萄糖苷酸酶处理，(B)为采用HCl处理 Fig.3 Select ion chromatogram of DEP: (A) Urine sample treated by β-glucuronide and (B) Urine sample treated by HCl

3.2.2 净化条件优化 尿液是含内源性物质较多的复杂基质。本实验采用QuEChERS法，将净化剂直接分散于提取液中，尽可能多地吸附干扰基质，将待检测的目标化合物保留在溶液中。选用净化剂PSA和GCB，PSA对有机酸、色素、糖和脂肪酸等干扰物质具有较强的吸附能力[18]; GCB主要用于去除色素，但对部分农药组分具有一定的保留[19]，其用量需在去除色素和保证回收率之间进行优化。由图4可知，当GCB添加量分别为5、10、20、30和40 μg时，各种农药的回收率在54.4%～91.4%之间; 随着GCB用量增加，各种农药的回收率逐步降低，其中仅当GCB的用量为20 μg时，毒死蜱各代谢产物的回收率在81.6%～88.2%之间， 基本符合残留检测的要求。

图4 GCB用量对回收率的影响 Fig.4 Effect of GCB amount on recoveries of compounds

3.3 方法学确证

3.3.1 标准工作曲线、方法灵敏度与重复性 本实验采用内标法定量，分别配制1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0和100.0 μg/L的3种毒死蜱代谢物基质标准溶液，以峰面积(y)对目标物的质量浓度(x)绘制标准曲线，目标物在1.0～100.0 μg/L范围内呈良好的线性关系良好(R2>0.995)，以信噪比S/N=3计算方法检出限(LOD)，S/N=10作为方法定量限(LOQ)，同时对50 μg/L的标准溶液连续测定5天，每天测定5次，计算日内和日间精密度。结果表明，毒死蜱各代谢产物的基质标准溶液分析重现性良好，RSD<5%(表2)。

3.3.2 方法的回收率及精密度 吸取适量混合标准工作溶液到尿样空白(低于检出限)，配制3个浓度水平(0.5、5.0 和10 μg/L)的待测样品，每个浓度设置3个平行样。尿样中TCP、DEP和DETP 3种毒死蜱代谢物的平均加标回收率分别在80.3%～84.7%、83.5%～90.0%和85.2%～90.1%之间(表3和图5)，RSD<10%，满足农药残留定量分析的需求。

表2 尿样中毒死蜱代谢产物的线性方程、相关系数、日内和日间精密度、检出限和定量限

Table 2 Regression equations, correlation coefficients (R2), intra- and inter-day RSDs, LODs and LOQs of target compounds

化合物Compounds线性方程Regressionequation线性相关系数Correlationcoefficient(R2)日内相对标准偏差Intra⁃dayRSD(%，n=5)日间相对标准偏差Inter⁃dayRSD(%，n=5)检出限LOD(μg/L)定量限LOQ(μg/L)TCPy=0．03x+0．0440．99663．24．90．732．41DEPy=0．34x+0．280．99911．23．80．170．56DETPy=1．17x+0．010．99571．54．70．100．33

表3 尿样中3种代谢物的回收率和精密度

Table 3 Recoveries and RSDs of target compounds in urine samples

化合物Compounds加标水平Spikedlevel0．5μg/L回收率Recovery(%)RSD(%，n=3)5．0μg/L回收率Recovery(%)RSD(%，n=3)10μg/L回收率Recovery(%)RSD(%，n=3)TCP80．32．583．54．985．23．9DEP84．76．590．05．089．51．2DETP81．43．486．93．890．11．9

图5 (A) 空白尿样和 (B) 加标尿样的总离子流图 Fig.5 Total ion chromatogram of (A) blank urine sample and (B) spiked urine sample

图6 实际尿样检测结果总离子流图 Fig.6 Total ion chromatogram of urine sample

3.3 实际样品的定性与定量分析

3.3.1 定性分析 本实验所选UPLC-QTRAP系统，三重四极杆与线性离子阱技术结合，使用MRM-IDA-EPI模式对尿样中毒死蜱的代谢产物进行定性分析，在此模式下，不仅可以通过MRM进行高灵敏定量分析，得到定性确认的二级全扫描质谱图(EPI图)，同时可利用EPI质谱库进行检索。原理如图2所示。采集了某农药厂附近儿童的晨尿(30份)，按照以上实验方法处理样品，并以实际样品验证所建立的方法。实际尿样的检测色谱图见图6，以TCP为例，将实际尿样中检测到的TCP和标准谱库进行对比，匹配度高达93.372%(表4)，可作为TCP定性依据。

3.3.2 定量分析 采用内标法对毒死蜱的3种代谢产物定量分析(表5)，结果表明，在80%以上儿童尿液中均检出毒死蜱代谢产物， TCP最高检出质量浓度为54.6 μg/L。这一方面可能与农药厂周边人群吸入含有毒死蜱的空气有关; 另一方面也与人群饮食摄入有关。其中DEP与DETP的质量浓度比例基本是1∶1，进一步说明了检出的有机磷类的代谢物来自毒死蜱[20]。

表4 实际尿样TCP谱库检索结果

Table 4 Spectrual library retrieval results of TCP in real urine samples

NameFormulaMolecularweight(DA)FitRevFitPurityCE1TCPC5H2ClNO196．900093．37291．65791．657-30

表5 儿童尿液中毒死蜱代谢产物的分析结果

Table 5 Analysis results of chlorpyrifos metabolites in children's urine

样品编号SampleNo．浓度Concentration(μg/L)TCPDEPDETP19．01．932．14212．65．657．41314．15．614．844NDNDND5ND1．951．99620．27．2010．3076．01．101．64813．33．924．16936．65．606．62109．701．101．361112．83．662．971240．18．957．501348．88．1311．3014NDNDND158．54．033．80样品编号SampleNo．浓度Concentration(μg/L)TCPDEPDETP1654．615．0010．601733．75．964．421815．02．212．221919．02．783．332048．34．975．862114．71．792．212223．52．123．1623NDNDND246．71．331．042515．02．522．3426NDNDND2712．74．365．62288．11．651．622946．45．246．133017．53．112．98ND：未检出(Notdetectable)．

4 结 论

建立了QuEChERS-UPLC-QTRAP方法用于分析人体尿液中毒死蜱的代谢产物。结果表明，本方法操作简单，灵敏度、准确度、精密度均良好，且定性与定量分析准确，并成功应用于实际测定某农药厂附近居民尿液中毒死蜱代谢物的含量。本方法不仅可对游离态的DETP、DEP和TCP进行定性和定量分析，而且可以用于分析TCP的总量(游离态和轭合态之和)。本方法为揭示毒死蜱在体内的代谢方式和暴露途径、科学评价毒死蜱暴露水平与其代谢物之间的关系提供了研究基础。

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