1 引 言

紫外线辐射具有强烈的生物学效应，长期暴露于紫外辐射，尤其是中波紫外线(Ultraviolet B，UVB)，对皮肤可产生强烈的光损伤，被照射部位真皮血管扩张，皮肤会出现红斑、炎症、老化现象，严重者可引发皮肤癌[1～5]。过量的UVB照射可导致机体中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)下降，由照射产生的自由基及活性氧可以攻击免疫器官，导致其氧化损伤，免疫细胞的及细胞因子分泌发生改变，继而机体的免疫功能逐渐减弱，甚至产生免疫抑制作用[6～8]。药物代谢动力学是定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄规律，并运用数学原理和方法阐述血药浓度随时间变化的规律的学科。近年来，质谱技术在药代动力学研究方面的应用较为广泛[9～11]，但是机体受UVB辐射损伤状态下的相关代谢研究鲜有报道。

人参(Panax ginseng C.A.Mey.)具有良好的抗辐射功效，人参皂苷作为人参的主要活性成分之一，在抗氧化、清除氧自由基和抗衰老等方面具有较强的活性[11～15]。人参皂苷Re的质量分数约占总皂苷的30%，具有清除自由基，保护不饱和脂肪酸等活性，有显著的抗衰老功效，发挥着重要的抗肿瘤和抗癌作用[16～20]。

本研究利用超高效液相-质谱联用技术，检测人参皂苷Re经正常和UVB辐射损伤模型大鼠口服后的血药浓度变化情况，计算相关的药代动力学参数，比较两组间的差异，为初步揭示紫外线辐射对机体代谢的影响提供理论依据，同时也对人参皂苷Re的药用开发与基础研究提供了参考。

Buck/Boost双向DC-DC变换电路如图2所示,输入端直流电压为24 V～36 V,5节锂电池串联后正负极两端电动势最高为24 V。充电电流为1 A～2 A,步进0.05 A,输出功率最大值约为48 W。锂电池放电时,30 Ω电阻作为锂电池放电负载,电路采用同步整流,两个MOSFET管交替导通。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

1200型液相色谱系统，6520 Accurate Q-TOF仪， TSQ ENDURA质谱仪，配有ESI离子源及Xcalibur数据处理系统，均购自美国Agilent公司; Thermo UltiMate 3000系统; TDL-5-4型离心机(Anke公司)，WS2-261-79高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司); 超低温冰箱(美国热电公司); 窄谱中波紫外线光源采用飞利浦紫外线灯(TL-01，峰值311～313 nm); 紫UV-340A外线辐照计(台北路昌公司)。

空白对照组与UVB模型组继续按照上述照射条件饲养至第15 d，口服G-Re皂苷(混悬于0.5% CMC-Na) 50 mg/kg剂量混合液，在0.08、0.17、0.33、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12、24、36、48和72 h眼眶取血，每个时间点取血0.5 mL，血液冷却后3000 r/min离心10 min，取上清血浆100 μL，测定前加入100 μL G-Rf内标液和 300 μL冰甲醇，涡旋30 s，以12000 r/min离心10 min，上清液用0.22 μm滤膜过滤，于4℃保存, 待测。

质谱条件：碰撞气为超纯氦，鞘气和辅助气为高纯氮; 电喷雾电离(ESI)，检测模式为负离子模式; 鞘气压力：35 psi; 辅气压力：10 psi; 离子转运管温度：325℃; 气化温度：275℃; 采用多反应监测(MRM)方式检测。

雄性Wistar大鼠12只，体重(180±20) g，动物合格证号：SCXK-(辽)2015-0001，由辽宁长生生物技术有限公司动物中心提供。在标准环境下(湿度 50%±10%; 温度(25±2)℃; 12 h 昼夜循环)进食进水，放入代谢笼内适应性饲养3天，实验前禁食12 h，实验过程中所有动物都受到精心养护。

2.2 实验动物

乙腈(色谱级，美国Tedia公司); 甲酸(色谱级，美国Sigma公司); 人参皂苷Re和人参皂苷Rf对照品(纯度>98%，吉林大学有机化学教研室); 超纯水由美国Millipore公司的Milli-Q系统制得。

2.3 色谱与质谱条件

参考文献[21]的方法对大鼠造模[21]，取上述雄性大鼠12只，用婴儿理发器剃除整个大鼠背部(尾部至颈部)的绒毛，每2天剃毛1次，实验前随机分成空白对照组与UVB模型组，每组6只。UVB照射时，大鼠背部暴露在距光源30～42 cm处，每次剂量为170 mJ/cm2，连续UVB照射5天，从第6天开始，每2天照射一次，共14天(10次)，UVB总剂量为2.38 J/cm2，照射后送回动物饲养室。

试验场地选定为临近河边的场地，地层为回填土，地下超过5 m为湿泥，黏性比较大。选用的钻具外径为60 mm，钻杆外径51 mm，实验深度为5 m时，通过液压绞车起拔钻杆顺利提出。实验深度超过8 m时，利用液压绞车难以起拔，绞车的支撑架发生变形。液压绞车额定拉力为10 kN，加装一个动滑轮，使得实际拉力达到20 kN，质量60 kg。实验深度达到15 m时，使用钢球夹紧起拔器起拔钻杆，顺利提出，起拔出来的钻杆裹满黏性湿泥。由于只带了17根钻杆，最终实验深度为17 m。利用钢球夹紧液压起拔器起拔钻杆时，一次可起拔多根钻杆，且省掉桅杆结构，进一步减轻钻机整体重量。

2.4 溶液配制及样品处理

2.4.1 标准溶液及内标溶液的配制 称取人参皂苷Re 标准品1.00 mg，用甲醇稀释至1.0 mL，配成浓度为1.0 mg/mL母液，然后用甲醇稀释成0.5、1.0、10.0和100.0 μg/mL的工作液。称取人参皂苷Rf 标准品1.00 mg，以甲醇定容至1.0 mL，配制成1.0 mg/mL的内标溶液，然后用甲醇稀释成1.0 μg/mL的工作液。

2.4.2 标准曲线的绘制 取空白大鼠血浆100 μL 于1.5 mL Eppendorf 管中，每个样品中加入不同质量的人参皂苷Re，配成15、25、50、100、250、500、1000、2500、5000、10000和20000 ng/mL的系列标准溶液，加入100 μL 1 μg/mL人参皂苷Rf 作为内标, 混匀，加入200 μL冰甲醇，涡旋30 s，12000 r/min离心10 min，取上清液，经0.22 μm滤膜过滤后进样检测。以G-Re 浓度为横坐标x，以G-Re 与G-Rf的峰面积比值(A/Ai)为纵坐标y，进行直线回归，得标准曲线。

2.5 实验方法

Ascentis® Express C18 色谱柱(5.0 mm×3.0 mm，2.7 μm)，柱温35℃。流动相为0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱程序：0 min，20% B; 0～2 min，20% B; 2～4 min，20%～35% B; 4～7 min，35%～41% B; 7～9 min，41%～70% B; 9～10 min，70%B。 流速 0.3 mL/min; 进样量5 μL。

（1）制定验收制度。对容易出现问题的施工节点制定验收制度，减少出现钻井施工问题的可能性。如二开固控设备验收制度、水平井下FEWD验收制度、沙河街地层验收制度等，实现问题的提前处理。

3 结果与讨论

3.1 质谱条件的鉴定及优化

3.2.6 稳定性 分别取G-Re高、中、低3个浓度的QC样本，在不同的储存条件(室温24 h，-20℃至少15天，3次冻融循环后和4℃下保存8 h)下， 3个QC水平的测定结果见表3。结果表明，在上述条件下，人参皂苷Re样本溶液较为稳定，可满足分析要求。

图1 (A)人参皂苷Re和(B)人参皂苷Rf的二级串联质谱图 Fig.1 MS/MS spectra of (A) ginsenoside Re and (B)ginsenoside Rf

表1 电喷雾质谱分析条件

Table 1 Electrospray mass spectrometric condition

化合物Compounds前体离子Precursorion(m/z)透镜电压RFLens(V)定量离子Quantitativeion碰撞能Collisionenergy(eV)定性离子Qualitativeion碰撞能Collisionenergy(eV)G⁃Re991．54298．43945．5321．68475．6055．00G⁃Rf845．47227．49799．4818．24475．3845．03

3.2 方法学考察

3.2.1 专属性 将供试空白血浆与空白血浆中加入待测物和内标物后得到的总离子流图(Total ion chromatorgram, TIC)和给药后不同时间实测色谱图进行比较。结果表明，血浆中所含内源性物质不干扰被测物和内标物的测定，被测物峰形良好。G-Re和内标G-Rf 的保留时间分别为4.61和6.52 min。空白大鼠血浆样品，空白大鼠血浆中加入G-Re和内标G-Rf样品，给药1 h后的大鼠血浆样品如图2所示。

图2 总离子流图: (A)空白大鼠血浆样品，(B)空白大鼠血浆中加入人参皂苷Re和内标人参皂苷Rf的样品(C)给药后1 h的大鼠血浆样品 Fig.2 Typical TIC of (A) blank rat plasma sample; (B) blank rat plasma sample spiked with Ginsenoside Re and Rf;(C)Rat plasma sample after administration 1 h

3.2.2 线性关系 将G-Re与内标G-Rf的峰面积比值(y)与G-Re浓度(x)进行最小二乘线性回归。结果表明，在15～20000 ng/mL浓度范围内，线性关系良好，得到标准曲回归方程为y=0.0003x+0.0009(R=0.999), 检出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)分别为4.0 ng/mL和13.5 ng/mL。

3.2.3 精密度与准确度 采用高、中、低3个浓度的G-Re血浆QC样本，每个浓度进行6个样本分析，连续测定3天，计算日内和日间精密度和准确度，结果见表2。日内和日间精密度的相对标准偏差(RSD)均小于5%，表明本方法的精密度和准确度良好。

3.2.4 回收率 分别取G-Re高、中、低3个浓度的QC样本，每个浓度进行6个样本分析，将空白血浆中先加入G-Re，处理后计算所测得峰面积，与空白血浆处理后加入相同量G-Re所测得峰面积比值的百分率进行比较，考察样品的提取回收率，结果见表2。G-Re回收率范围为89.6%～91.9%, RSD<15%， 表明本方法可以满足血浆类生物样本的检测要求。

3.2.5 基质效应 分别取G-Re高、中、低3个浓度的QC样本，与等量G-Re的纯标准溶液的峰面积相对应，测量基质效应, 基质效应(%)=A/B×100， 其中A为QC样本中测得G-Re的峰面积， B为等量G-Re标准溶液的峰面积，每个浓度进行6个样本分析，结果如表2所示，G-Re在3个浓度下的基质效应在93.2%～97.8%之间，表明本方法可有效避免基质对人参皂苷Re测定的影响。

表2 大鼠血浆中人参皂苷Re的准确性、精确度、回收率和基质效应

Table 2 Accuracy, precision, recovery and matrix effect of ginsenoside-Re in rat plasma (n=6)

浓度Concentration(ng/mL)日内精密度Intra⁃dayRSD(%)日间精密度Inter⁃dayRSD(%)准确度Accuracy(RE，%)回收率Recovery(%，x±s)基质效应Matrixeffect(%，x±s)150．702．4-3．4489．6±2．297．47±0．765001．91．1-6．4491．8±2．593．22±0．47200000．70．46．491．9±1．297．80±0．52

利用高分辨飞行时间质谱仪在负离子模式下对人参皂苷Re、Rf进行定性分析，结果见图1。分别在正、负离子模式下，采用直接进样方式，优化G-Re和内标G-Rf的三重四级杆质谱的分析条件：毛细管电压为25.0 kV; 离子传输管温度为200400℃; 雾化器温度为200400℃; 鞘气流速2050 psi; 辅助气流速03 L/min; 自动优化G-Re和内标G-Rf在多反应检测(MRM)时所产生的碎片离子种类和所需碰撞能量。本研究选择负离子模式进行分析，详细参数见表1。

表3 人参皂苷Re分析物在大鼠血浆中的稳定性

Table 3 Stability of ginsenoside-Re in rat plasma (n=6)

浓度Concentration(ng/mL)24h，Roomtemperature准确度RE(%)精密度RSD(%)15days，-20℃准确度RE(%)精密度RSD(%)3个冻融循环3Freeze⁃thawcycles准确度RE(%)精密度RSD(%)8h，4℃准确度RE(%)精密度RSD(%)15-2．761．23．533．6-2．014．24．352．1500-2．591．62．911．31．64．22．100．6200004．003．91．822．21．403．82．132．0

3.3 人参皂苷Re的药代动力学比较研究

利用本方法研究大鼠口服50 mg/kg的G-Re后的药代动力学行为。用DAS 2.0软件对数据进行处理，其主要药代动力学参数详见表4。图3为口服后空白组和模型组大鼠的平均血液药物浓度-时间曲线， 通过赤池信息标准(Akaike's information criterion, AIC) 进行房室模型分析，结果表明，G-Re在两组大鼠体内代谢符合二室模型特征。经统计学t检验分析，与正常状态下的药动学参数比较， 在UVB辐射条件下， G-Re在大鼠体内的t1/2β、 AUC、 Tmax和K21均高于正常组，两者之间有显著性差异(p<0.05)，提示在UVB状态下G-Re在大鼠体内的吸收明显升高，而Cmax、 K12和K10无统计学差异，提示在大鼠体内的消除没有发生明显变化[22]。有研究报道，在辐射剂量为800 mJ/cm2 UVB急性照射下，即可导致裸鼠肝细胞GSH与SOD活性水平显著下降[23]。本实验在UVB照射剂量下，模型组大鼠肝脏可能造成了一定的氧化损伤，从而导致其对G-Re的吸收、分布、代谢及排泄过程产生了影响[23] 。

治疗后，观察组症状积分、空腹血糖、餐后24 h血糖、CRP低于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗后，对照组症状积分、空腹血糖、CRP低于治疗前，差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗后，观察组的症状积分、餐后24 h血糖、CRP低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表4 空白大鼠和模型大鼠血浆中人参皂苷Re的代谢动力学参数

Table 4 Pharmacokinetic parameters of Ginsenoside-Re in plasma of normal and model rats. (n=6,

参数Parameter空白组Normalgroup模型组Modelgroupα相半衰期t1/2α(h)0．21±0．040．69±0．072β相半衰期t1/2β(h)17．08±0．5321．40±16．77∗清除速率ClearancerateCL/F(L·h/kg)150．41±0．75117．37±70．50∗曲线下面积AreaundercurveAUC0-t(g/(L·h))321．91±2．27474．99±194．96∗曲线下面积AreaundercurveAUC0⁃∞(g/(L·h))332．44±1．66518．64±231．39∗Tmax(h)0．44±0．090．75±0．00∗Cmax(g/L)49．32±7．4264．76±3．73速率常数(K10)0．42±0．160．22±0．09速率常数(K12)2．64±0．600．51±0．29速率常数(K21)0．35±0．030．38±0．43∗Note：∗p<0．05vsNormalgroup

图3 正常与模型组在大鼠口服人参皂苷Re(50 mg/kg)后平均血药浓度-时间曲线 Fig.3 Mean plasma concentration-time curves of G-Re in normal and model groups following intragastric administration to n=6)

本实验建立了UPLC-QQQ-MS/MS 法对正常和UVB辐射损伤模型大鼠体内G-Re含量的快速检测方法。利用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用的优势，对质谱参数进行了优化，对检测的G-Re和内标G-Rf都分别选择一个定性离子对和一个定量离子对，最终实现对G-Re的定量分析。此方法可在10 min内完成G-Re的分析，检测时间短、线性关系较好、方法回收率高、稳定性良好，可满足分析要求。本实验对正常大鼠和UVB辐射大鼠体内的人参皂苷Re药代动力学比较研究，对比两组代谢检测结果，UVB辐射条件下测得大鼠体内的人参皂苷Re含量较高，说明中波紫外线影响人参皂苷Re在动物体内代谢过程，其详细机制有待于进一步研究。

BAI Liji, SU Xiujuan, HE Chunlin, et al. Study on microwave-assisted grinding mechanism of cassiterite-polymetallic sulfide ore[J]. Conservation and utilization of mineral resources, 2018(6):31-36.

References

1 Moehrle M. Clin. Dermatol., 2008, 26(1): 12-15

2 Halliday G M, Damian D L, Rana S, Byrne S N. J. Dermatol.Sci., 2012, 66(3): 176-182

3 Griffin L L, Ali F R, Lear J T. Clin. Med., 2016, 16(1): 62-65

4 Ravi P R, Vats R. J. Pharm. Pharmacol., 2017, 69(7): 823-833

5 Elhennawy M G, Lin H S. J. Pharm. Biomed. Anal., 2017, 142: 35-41

6 Etemadi L, Pettersson L M E, Danielsen N. Peptides, 2017, 1: 87: 71-83

7 Gonzalez V C, Beheregaray A C M, Peres B M, Sallis E S V, Varela A S, Trindade G S. Photochem Photobiol., 2015, 91(4): 895-900

8 Hao O Y, Joseph S, Curtis C, Yohini A, Darrell R. J. Am. Acad. Dermatol., 2012, 6(67): 1220-1227

9 ZHANG Zhe, TENG Ya-Ran, LYU Zi-Yan, WU Wei, LIU Shu-Ying. Chinese J. Anal. Chem., 2017, 45(2): 191-198

张 喆, 滕亚然, 吕子燕, 吴 巍, 刘淑莹. 分析化学, 2017, 45(2): 191-198

10 WANG Qian-Qian, ZHANG Jing, PI Zi-Feng, LIU Shu, SONG Feng-Rui, LIU Zhi-Qiang. Chinese J. Anal. Chem., 2014, 42(7): 997-1001

王倩倩, 张 静, 皮子凤, 刘 舒, 宋凤瑞, 刘志强. 分析化学, 2014, 42(7): 997-1001

11 HUANG Yong, HE Feng, ZHENG Lin, ZHANG Zhi-Rong, LAN Yan-Yu, WANG Yong-Lin. Chin.J.Pharm. Anal. , 2012, (01): 1-6

黄 勇, 何 峰, 郑 林, 张治蓉, 兰燕宇, 王永林. 药物分析杂志, 2012, (01): 1-6

12 WANG En-Peng, CHEN Xin, XU Xin, WANG Hong-Xin, ZHANG Hong-Chang. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research, 2013, 8(24): 1873-1876

王恩鹏, 陈 新, 许 新, 王洪鑫, 张洪长. 时针国医国药, 2013, 8(24): 1873-1876

13 Biswas T, Mathur A K, Mathur A. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2017, 101(10): 1-2

14 Leena R, Lasse H, Dunlop T W, Petri P, Genevieve B, Maarit K, Malvehy T, Puig S. Photodermatol. Photoimmunol. Photomed., 2017, (6): 2728-2736

15 Cho W S, Chung W S, Lee S W, Leung A N, Cheng C H, Yue K M. Eur. J. Pharmacol., 2006, 550(1): 173-179

16 LUO Lin-Ming, SHI Ya-Ning, JIANG Yi-Na, ZHAN Ji-Hua, QIN Li, CHEN Nai-Hong. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2017, (3): 582-596

罗林明, 石雅宁, 姜懿纳, 詹济华, 覃 丽, 陈乃宏. 中草药, 2017, (3): 582-596

17 Yu S S, Zhou X L, Li F, Xu C C, Zheng F, L J, Zhao H X, Dai Y L, Liu S Y, Feng Y. Sci. Rep., 2017, 7(138): 1-10

18 Zhang Y C, Li G J, Chao Y, Yang B, Yang H J, Xu H Y, Huang L Q. Molecules, 2014, 19(11): 17381-17399

19 Yuri O, Lim H W, Kim K, Lim C J. Acta Pharmaceutica Sinica, 2016, 71(7): 413-419

20 LUO Tai-Min, LI Jin-Qi, TONG Rong-Sheng. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 2014, (2): 332-335

罗太敏, 李晋奇, 童荣生. 中华中医药杂志, 2014, (2): 332-335

21 WANG En-Peng, SUN Yan, YUE Hao, CHEN Huan-Wen, WANG Yang, CHEN Chang-Bao, LIU Shu-Ying. Chinese J.Anal.Chem., 2016, 44(9): 1410-1418

王恩鹏, 孙 岩, 越 皓, 陈焕文, 王 洋, 陈长宝, 刘淑莹. 分析化学, 2016, 44(9): 1410-1418

22 XU Wei-Zhe, ZHAO Yan, QIN Yi, XIA Bin-Bin, GONG Wen-Wen, XU Ping-Xiang, XUE Ming. Journal of International Pharmaceutical Research, 2016, (02): 336-340

徐唯哲, 赵 妍, 秦 一, 夏彬彬, 宫雯雯, 徐平湘, 薛 明. 国际药学研究杂志, 2016, (02): 336-340

23 Svobodova A R, Galandakova A, Sianska J. Biol Pharm Bull, 2011, 34(4): 471-479