1 引 言

原人参二醇(PPD)作为中国传统中草药人参的主要成分，对多种肿瘤具有抑制作用[1～8]。然而PPD水溶性差，临床生物利用度很低。纳米药物系统作为一种新型给药系统，由于其副作用较小、药物生物利用度与疗效较好，受到研究者的广泛关注。在各种纳米药物系统中，含有高Z元素 (金，银，碘，钆等)的各种纳米材料作为药物运输载体[9～11]引起研究者的广泛关注。金纳米颗粒 (AuNPs)由于其良好的生物相容性、生物惰性、高原子序数、易于合成和表面修饰等，在纳米药物系统中表现出明显的优势，是药物运输载体的优良材料[12～20]。You等[21]将DOX负载到PEG 修饰的空心金纳米颗粒上，考察该药物传递系统(DOX@ PEG-HAuNS) 的光热治疗-化疗的联合治疗效果，结果表明，相比于游离DOX 和DOX 脂质体，DOX@ PEG-HAuNS 具有更强的抗肿瘤活性和更低的心脏毒性。

基于空心纳米金颗粒的独特性质，本研究将空心金纳米颗粒用于小分子PPD的负载输送。将具有空心结构、体积大、外壳薄而坚固等优点的空心金纳米颗粒和PPD结合起来，构建了一种新型PPD给药系统; PPD经过空心金纳米颗粒的负载，提高了药物的水溶性及生物利用度，更利于肿瘤的治疗。将PEG分子修饰到空心金纳米颗粒表面，提高了纳米材料的生物相容性; 空心金纳米颗粒负载PPD，起到了缓释作用，使得PPD的药效更加持久。本研究还考察了其体外抗喉癌细胞的作用。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

FEITecnai G2 F20 S-Twin透射电子显微镜 (美国FEI公司); X'Pert Pro X射线衍射仪 (荷兰帕纳科公司); Vertex Perkine-Elmer 580BIR傅立叶变换红外光谱仪 (美国瓦里安公司); Prominenece UFLC高效液相色谱仪 (日本岛津公司); U-3310紫外可见近红外光谱(HPLC)仪 (日本日立公司); M630多功能酶标仪 (美国Hercules公司); FACSCan流式细胞仪 (美国Becton Dickinson公司); MCO-20AIC CO2培养箱 (中国Sanyo公司)。

氯金酸 (分析纯，上海萨恩化学技术有限公司); CoCl2·6H2O、柠檬酸三钠和NaBH4 (分析纯,北京化学有限公司); PEG-SH (美国Nanocs 公司); Hep-2细胞株 (中国科学院上海生命科学研究院); PPD (纯度>99%，吉林大学有机化学实验室合成); RPMI-1640培养基、胎牛血清(美国 Hyclone公司); 二甲亚砜(DMSO)、青霉素和链霉素(上海鼎国生物技术有限公司); MTT(美国Sigma公司); TUNEL凋亡检测试剂盒(瑞士罗氏公司)。实验用水为Milli-Q纯水仪(美国Millipore公司) 制备的超纯水(18.2 MΩ·cm)。

2.2 空心金纳米颗粒 (HAuNs)的合成

参照文献[22]的方法合成空心金纳米颗粒(HAuNs)。首先制备钴纳米颗粒，将氯化钴溶液 (0.1 mL， 0.4 mol/L)加入到含有新制备的硼氢化钠溶液 (0.1 mL，1 mol/L)和柠檬酸钠溶液 (0.4 mL，0.1 mol/L)中，混合溶液在氮气氛下反应60 min。将上述制备的无硼氢化钠的钴纳米颗粒溶液 (30 mL)注入脱氧氯金酸溶液 (10 mL， 1 μmol/L)中，在氮气氛下反应10 min后，将溶液暴露于空气中至钴完全氧化。以10000 r/min离心，收集沉淀， 用超纯水洗涤3次。

2.3 HAuNs-PEG的合成

通过配体交换法制备HAuNs-PEG[23]。将合成的HAuNs分散在去离子水中 (1.0 mg/mL)，将150 mg PEG-SH加入到40 mL上述水溶液中，在室温下搅拌过夜。反应结束后，用超纯水洗涤产物3次, 除去未反应的PEG，产物分散在40 mL乙醇中。

2.4 PPD的负载和体外药物释放

将40 mL 1.0 mg/mL PPD乙醇溶液加入到40 mL 1.0 mg/mL HAuNs-PEG的乙醇溶液中，在37℃下搅拌24 h。离心，沉淀用乙醇洗涤3次。合并上清液，通过检测上清液中PPD减少的重量(m)计算PPD的实际负载量，负载率LE (%)= [(初始mPPD-上清液中的mPPD)/mHAuNs-PEG]×100%，测得PPD负载率为30%。

小结：本次调研较为具体、全面地了解了燃料智能化管控系统产品供应商三德科技及其自动制样系统等产品的现场应用情况，达到了调研目的。从调研掌握到的信息来看，三德科技包括研发能力、生产交付能力等在内的综合实力较强，其所生产的自动制样系统在长安益阳电厂运行良好。

聂树斌、呼格吉勒图、陈满……这些重大冤错案件的被告人或不幸被错杀或身陷囹圄。党的十八大以来，司法机关用实际行动自我纠错、敢于担当，这些当事人的沉冤昭雪，充分显现出司法体制改革给司法公正带来的正向效应。

为了验证体外细胞中HAuNs-PEG的分布和细胞对HAuNs-PEG吞噬，测量了不同时间HAuNs-PEG纳米复合材料孵育的Hep-2细胞的暗场散射图像(图5)。如图5H所示，不添加HAuNs-PEG纳米复合材料的Hep-2细胞在暗场中呈现灰色。用HAuNs-PEG纳米复合材料 (图5E～5F)培育后，Hep-2细胞的暗场散射图像由于其在红光频率区域的强烈的纵向表面等离子体振荡而显示散射橙光[25]，散射光的强度随着孵育时间的延长而增强。这些结果提示了纳米复合材料通过非特异性内吞途径[26]而进入细胞的过程比较缓慢。

数据处理：将峰面积带入回归方程，得出药物的剂量，以500 μL复合药物中PPD的量为100%，计算出药物随时间变化的PDD释放率。

当下的现代词学研究更多地局限在词学学科的内部，尚未完全展现在现代学术发展的场域下现代词学与其时代学术背景变化之间的内在关系，尚未充分揭示作为现代文论一部分的现代词学研究与现代文学发展之间的复杂关系样态，未能深度探究词学现代转型背后的动力机制。因此，在“大文学”视域下，我们可以深入探究词学现代转型的四个不同面向作为现代词学研究的出发点，尝试以专题研究的模式重构现代词学研究框架，以此强化词学研究的理论维度，同时辅之以纵向学术史的梳理，揭示现代词学发展的理论复杂性，对于拓展现代词学研究的学术空间和理论深度，消除学科壁垒大有裨益。

2.5 实验分组和体外细胞培养

空白对照组、HAuNs组、PPD组、HAuNs-PEG-PPD组 (药物暴露时以PPD、HAuNs-PEG-PPD浓度、以及相应负载浓度单纯HAuNs计量为统一浓度单位)Hep-2细胞，采用RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清，100 IU/mL青霉素，链霉素100 mg/mL)， 在37℃、5% (V/V) CO2培养箱中培养。

2.6 细胞毒性实验

药物释放体系的研究与应用对临床治疗有着重要意义。本研究将PPD与空心金纳米颗粒共价连接，制备HAuNs-PEG-PPD，构筑了一种靶向Hep-2细胞的药物控释体系，采用高效液相色谱检测HAuNs-PEG-PPD在体外随时间的释放率。

2.7 流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡

将Hep-2细胞接种于六孔板中 (2×105细胞/孔)，并分别暴露于HAuNs-PEG-PPD (IC50)、HAuNs (联合组IC50所对应Au浓度)、PPD (联合组IC50所对应PPD浓度)和空白对照组。培养24 h后，收集培养液，并用不含EDTA的胰酶消化细胞后，1000 r/min离心5 min，弃上清液。再用1 mL在4℃预冷的PBS洗涤细胞两次。将400 μL 1×Annexin V结合液悬浮细胞，浓度为1×106 cells/mL。在细胞悬浮液中加入5 μL Annexin V-FITC染色液，混匀后于2～8℃避光条件下孵育5 min，然后采用流式细胞仪分析。

3 结果与讨论

3.1 空心金纳米颗粒的结构与表征。

图1 (A)空心金纳米颗粒(HAuNs)和(B)聚乙二醇修饰的HAuNs (HAuNs-PEG)的透射电镜图 Fig.1 Transmission electron microscopy (TEM) images of (A) hollow gold nanoparticles (HAuNs) and (B) complex of polyethylene glycol (PEG) and HAuNs (HAuNs-PEG)

图2 空心金纳米颗粒的X射线衍射图谱和金的标准JCPDS卡04-0784 Fig.2 X-ray diffraction (XRD) patterns of as-prepared HAuNs and standard JCPDS card 04-0784 of Au

如图6所示，在共培养24 h后，PPD、HAuNs-PEG-PPD对Hep-2细胞的抑制作用均呈剂量依赖性，低剂量PPD (≤4.61 μg/mL)对Hep-2细胞无明显抑制作用，而低剂量HAuNs-PEG-PPD对Hep-2细胞具有明显的抑制作用。同等浓度的PPD与HAuNs-PEG-PPD相比较，HAuNs-PEG-PPD的抑制作用更明显。而单纯HAuNs对Hep-2细胞本身没有明显的细胞毒性作用。单纯PPD组IC50为67.38 μg/mL，HAuNs-PEG-PPD的IC50为 39.29 μg/mL，与单纯PPD组别相比较，HAuNs-PEG-PPD组IC50降低了1.71倍， 显著降低了PPD对Hep-2细胞的IC50。这与图6的结论一致，HAuNs-PEG-PPD增强了体外PPD对Hep-2细胞生长的抑制作用。

FT-IR光谱图如图3所示。 图3A中，3424 cm-1处的宽带归属于样品中吸收的H2O的H振动和PEG中的伸缩振动，1384和1559 cm-1处的峰由于在制备过程中加入Cit3-离子而归属于拉伸模式[24] 。在图3B中，1665和1047 cm-1 峰分别归属于酯基中的伸缩振动和PEG中的伸缩振动。如图3C所示，加载PPD后，可以观察到PPD在2922和2868 cm-1处的特征峰值，分别归属于甲基中的伸缩振动和亚甲基的伸缩振动。上述结果表明PEG的成功修饰和PPD的加载。

图3 红外光谱表征：(A)HAuNs和HAuNs-PEG的FT-IR; (B)灰色框架的细节; (C)HAuNs Fig.3 Fourier transform infrared (FT-IR) spectra of (A)HAuNs and HAuNs-PEG, (B) detail of gray frameand and (C) HAuNs

3.2 HPLC检测HAuNs-PEG-PPD的缓释性

将PPD溶于无水乙醇中制备成64 mmol/L溶液。将细胞接种于96孔板中(0.3×104细胞/孔)，培养过夜，然后将其暴露于不同浓度的HAuNs、PPD、HAuNs-PEG-PPD (2.30、4.61、9.21、18.43和36.87 μg/mL) 24 h后，将20 μL MTT (0.5 mg/mL)加入到96孔板和细胞继续培养4 h。然后弃MTT与培养基混合液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，用酶标仪在490 nm处测各孔吸光度。计算细胞增殖抑制率 (Inhibitory rate，IR)， IR =[1-(用药组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%。

（10）绿色建筑评价软件实现了以绿色建筑新国标为基础的绿色建筑预评估功能，提供了技术路线指导、绿色建筑地图、具体条文解析、专业提资要求等模块，并附有大量的国内绿色建筑设计要点实例，为设计师提供了一个得力的软件工具。

色谱条件：CORTECS C18色谱柱(100 mm×4.6 mm， 2.7 μm); 流动相A为0.1%冰醋酸，流动相B为乙腈，以A∶B=20∶80(V/V)等度洗脱; 流速0.5 mL/min，室温分离; 进样量：10 μL; 线性关系考察：精密称取PPD，用乙醇定容至10 mL，用流动相分别稀释成 5、10、25、40、100和200 μg/mL系列浓度，4℃保存备用。进样量10 μL，测定峰面积，以PPD的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程; 待测样品的制备：将500 μL的HAuNs-PEG-PPD复合药物加入4 mL的1640培养基中，置于37℃、5%(V/V) CO2培养箱中，分别于30、60、120、180和240 min各取100 μL 上清液，于4℃保存，待测。

图4 高效液相色谱检测纳米药物HAuNs-PEG-PPD的体外释放 Fig.4 Release of HAuNs-PEG-PPD in vitro detected by high performance liquid chromatography

在所建立的色谱条件下，PPD的浓度 (x)在5～200 μg/L之间与峰面积 (y)呈良好的线性关系，线性回归方程为y=36696x -14104 (R2=0.9996)。如图4所示，初期0～0.5 h，药物快速释放，释放量占总量的60%，这段区间释放出来的药物主要是吸附在纳米粒表面的药物; 0.5～4 h, 释放速率有所减慢，药物释放量约占40%，这是因为药物从纳米粒内部释放出来，释放速率比较缓慢。这说明了药物负载于空心纳米粒载体时，既可分布在载体的孔道和空腔内部，也可存在于载体的外部表面区域。同时也说明本研究所制备的HAuNs-PEG-PPD具有较好的药物缓释效果，有望作为一种优良的抗肿瘤药物。

3.3 细胞体外暗场散射成像

2.要有充分的自信，不能因为是非母语而畏惧发表意见或观点，哪怕是慢一点也没有关系。其实外方代表是很有耐心的，他们很乐意一起沟通问题，前提是要能清晰的表达出自身的观点。

图5 用HAuNs-PEG培育不同时间的Hep-2细胞的典型LSPR散射图像 Fig.5 Typical localized surface plasmon resonance (LSPR) scattering images of Hep-2 cells incubated with HAuNs-PEG for different time

3.4 HAuNs-PEG-PPD对Hep-2细胞生长的抑制作用

研究证实，PPD对肝癌细胞HepG2有一定的细胞毒性作用[27]，适量浓度的PPD对Hep-2细胞的生长有一定抑制作用[28]。低剂量的PPD可提高细胞存活率，保护细胞，而高剂量的PPD可抑制细胞增殖[29]。本研究采用MTT法检测不同浓度的HAuNs、PPD、HAuNs-PEG-PPD对Hep-2细胞生长的抑制作用。

图6 HAuNs组、PPD组和HAuNs-PEG-PPD组药物对Hep-2细胞的细胞毒作用 Fig.6 Cytotoxicity of PPD group, HAuNs group and HAuNs-PEG-PPD group on Hep-2 Cells

HAuNs和HAuNs-PEG透射电子显微镜 (TEM)图如图1所示。HAuNs的平均直径约为50 nm，平均金壳厚度约为8 nm(图1A)，可以清楚地看出空心金纳米颗粒壳表面上的PEG层(图1B)。 HAuNs的XRD图和Au (JCPDS No.04-0784)的标准数据如图2所示，结果表明，合成的HAuNs结晶性良好。

3.5 HAuNs-PEG-PPD对 Hep-2 细胞凋亡率的影响

研究证实PPD对多种癌细胞具有促凋亡作用，如神经胶质瘤、肝癌、胰腺癌、乳腺癌和前列腺癌[30]。本研究采用流式细胞术 (FCM)检测HAuNs、PPD、HAuNs-PEG-PPD粒子对Hep-2细胞凋亡率的影响。

图7 流式细胞术检测细胞凋亡状况：(A)Control组, (B)HAuNs组, (C)PPD组, (D)HAuNs-PEG-PPD组; (Q1)坏死细胞, (Q2)晚期凋亡细胞, (Q3)早期凋亡细胞, (Q4)正常活细胞 Fig.7 Cell apoptosis detected by flow cytometry: (A) control group, (B) HAuNs group, (C) PPD group, (D) HAuNs-PEG-PPD group; (Q1) necrotic cells, (Q2) late apoptotic cells, (Q3) early apoptotic cells, (Q4) normal live cells

图8 流式细胞术检测细胞凋亡率的统计分析： 空白组，PPD组、HAuNs组、HAuNs-PEG-PPD组 Fig.8 Cell apoptosis rate of control group (ctr), PPD group, HAuNs group and HAuNs-PEG-PPD group at IC50 concentration

图7为Control 组、HAuNs组、PPD组、HAuNs-PEG-PPD组四组的FCM凋亡图像。HAuNs-PEG-PPD的FCM 检测结果图8显示，应用IC50浓度的HAuNs-PEG-PPD 组 Hep-2 细胞凋亡率 (34.10%±3.24%) 明显高于单纯PPD组 (12.69%±2.48%)，且与之前细胞毒实验中半数致死量细胞凋亡率相符，差异有统计学意义 (p<0.01)，且二者均高于单纯HAuNs组 (6.06%±1.17%，p<0.01) 及对照组(1.69%±0.14%)。上述结果说明，HAuNs-PEG-PPD和PPD都可以诱导Hep-2细胞凋亡，HAuNs-PEG-PPD可以增强PPD诱导的Hep-2 细胞的凋亡率，并通过诱导凋亡使得细胞活性降低。这与上节中HAuNs-PEG-PPD加强了体外PPD对Hep-2细胞生长的抑制作用的结论，都证实了HAuNs-PEG-PPD与小分子PPD相比有更高的抗肿瘤活性。这可能是因为HAuNs-PEG-PPD纳米粒子复合物通过胞吞作用，更好地被肿瘤细胞摄取。由于HAuNs-PEG-PPD纳米粒子中的PEG具有羧基端，与PPD链接形成酯键，酯键具有pH敏感性，在细胞质的酸性环境中能发生断裂，释放出PPD[31]，导致细胞凋亡，从而高效地杀死细胞。

2.1.1 线性关系的考察。以对照品溶液浓度为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得出回归方程。结果显示(表1)，绿原酸、葫芦巴碱、D-(-)-奎宁酸和咖啡酸分别在14.6～146.0 μg/mL(r=1.000 0)、10.2～102.0 μg/mL(r=1.000 0)、11.6～116.0 μg/mL(r=0.999 8)、0.499 5～4.995 0 μg/mL(r=0.999 8)的浓度范围内线性关系良好。

本课程的教学创新体现在以下几个方面：（1）教学过程充分利用网络资源、运用蓝墨云班课等App学生的移动设备变成学习工具；（2）课程教学注重文化熏陶，素养培养贯穿教学过程；（3）课证融合、课赛结合，提高了学生的学习积极性，有效提高了教学效果。（4）全过程学习成效评价，通过云班课记录的学生学习行为实现对学生的过程性考核，完善的激励与评价体系促使学生在移动设备端的自主学习，激发了学生的自主学习兴趣。

4 结 论

本研究将PPD负载到HAuNs-PEG，合成了HAuNs-PEG-PPD，采用HAuNs-PEG-PPD培育Hep-2细胞，并研究了HAuNs-PEG、HAuNs-PEG-PPD的特性以及HAuNs-PEG-PPD对 Hep-2细胞生存率、细胞凋亡率和PPD的释放的影响，证实HAuNs-PEG-PPD在体外可显著增强PPD的抗喉癌细胞效应，有望作为抗喉癌药物PPD新型给药系统，为探索更多新剂型抗肿瘤药物提供了参考。

References

1 Zhao C, Su G, Wang X, Zhang X, Guo S, Zhao Y. Biotechnol. Lett., 2016, 38(1): 43-50

2 Lin G, Yu X, Wang J, Qu S, Sui D. Exp. Ther. Med., 2013, 5(2): 443-447

3 Chen Y, Zhu J, Zhang W. Anticancer Drugs, 2014, 25(9): 983-991

4 Wang W, Zhang X, Qin J J, Voruganti S, Nag S A, Wang M H, Wang H, Zhang R. PLoS One, 2012, 7(7): e41586

5 Xu F Y, Shang W Q, Yu J J, Sun Q, Li M Q, Sun J S. Am. J. Transl. Res., 2016, 8(4): 1708-1718

6 Wang C Z, Zhang Z, Wan J Y, Zhang C F, Anderson S, He X, Yu C, He T C, Qi L W, Yuan C S. Nutrients, 2015, 7(2): 799-814

7 Wang W, Rayburn E R, Zhao Y, Wang H, Zhang R. Cancer Lett., 2009, 278(2): 241-248

8 Gao J L, Lv G Y, He B C, Zhang B Q, Zhang H, Wang N, Wang C Z, Du W, Yuan C S, He T C. Oncol. Rep., 2013, 30(1): 292-298

9 Ma M, Huang Y, Chen H, Jia X, Wang S, Wang Z, Shi J. Biomaterials, 2015, 37: 447-455

10 He L, Lai H, Chen T. Biomaterials, 2015, 51: 30-42

11 Wang J, Tan X, Pang X, Liu L, Tan F, Li N. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2016, 8(37): 24331-24338

12 Al Zaki A, Joh D, Cheng Z, De Barros A L, Kao G, Dorsey J, Tsourkas A. ACS Nano, 2014, 8(1): 104-112

13 Chithrani D B, Jelveh S, Jalali F, van Prooijen M, Allen C, Bristow R G, Hill R P, Jaffray D A. Radiat. Res., 2010, 173(6): 719-728

14 Zhang X D, Wu D, Shen X, Chen J, Sun Y M, Liu P X, Liang X J. Biomaterials, 2012, 33(27): 6408-6419

15 Zhang A W, Guo W H, Qi Y F, Wang J Z, Ma X X, Yu D X. Nanoscale Res. Lett., 2016, 11(1): 279

16 Huang P, Bao L, Zhang C, Lin J, Luo T, Yang D, He M, Li Z, Gao G, Gao B, Fu S, Cui D. Biomaterials, 2011, 32(36): 9796-9809

17 Geng F, Song K, Xing J Z, Yuan C, Yan S, Yang Q, Chen J, Kong B. Nanotechnology, 2011, 22(28): 285101

18 Hainfeld J F, Slatkin D N, Smilowitz H M. Phys. Med. Biol., 2004, 49(18): N309-N315

19 Hainfeld J F, Dilmanian F A, Slatkin D N, Smilowitz H M. J. Pharm. Pharmacol., 2008 , 60(8): 977-985

20 Rahman W N, Bishara N, Ackerly T, He C F, Jackson P, Wong C, Davidson R, Geso M. Nanomedicine, 2009, 5(2): 136-142

21 You J, Zhang R, Zhang G, Zhong M, Liu Y, Van Pelt C S, Liang D, Wei W, Sood A K, Li C. J. Control Release, 2012, 158(2): 319-328

22 Deng X, Chen Y, Cheng Z, Deng K, Ma P, Hou Z, Liu B, Huang S, Jin D, Lin J. Nanoscale, 2016, 8(12): 6837-6850

23 Brias R P, Maetani M, Barchi J J Jr. J. Colloid Interface Sci., 2013, 392: 415-421

24 Gambinossi F, Chanana M, Mylon S E, Ferri J K. Langmuir, 2014, 30(7): 1748-1757

25 Lu J, Li Z, Zink J I, Tamanoi F. Nanomedicine, 2012, 8(2): 212-220

26 Cho E C, Xie J, Wurm P A, Xia Y. Nano Lett., 2009, 9(3): 1080-1084

27 Yang J, Li X, Sun T, Gao Y, Chen Y, Jin Y, Li Y. Steroids, 2016, 106: 26-34

28 Teng B, Jiang J, Zhao L, Gao J, Chen J, Liu Z, Wang H, Lu B. Molecules, 2017, 22(3): 486

29 Wang W, Wang H, Rayburn E R, Zhao Y, Hill D L, Zhang R. Br. J. Cancer, 2008, 98(4): 792-802

30 Zhu G Y, Li Y W, Tse A K, Hau D K, Leung C H, Yu Z L, Fong W F. Eur. J. Pharmacol., 2011, 668(1-2): 88-98

31 Gao W, Chan J M, Farokhzad O C. Mol. Pharm., 2010, 7(6): 1913-1920