1 引 言

氡是天然放射系中唯一无色、无嗅、无味的气体放射性元素，半衰期为3.82天，是室内放射性气体污染物的主要存在形式[1,2]。经过一系列短寿命子体链的衰变，氡产生的稳定子体210Pb半衰期长达21年[3]。室内氡照射和吸烟具有协同效应，是导致肺癌的第二大杀手[4,5]。世界卫生组织与国际癌症研究机构已将氡列为19种致癌物质之一[6]。研究表明，21世纪以来我国室内平均氡浓度较20世纪80年代和90年代分别上升了57%和42%[7]，室内氡污染的危害受到越来越多的关注。因此，科学有效地采集和检测室内中的氡浓度，建立经济、有效、简便/快捷的检测氡的累积辐射剂量的方法具有重要的卫生学意义[8]。

近年来，核酸适配体(Aptamer)已经广泛应用于生命科学、临床诊断、药物筛选和环境科学等领域[9～11]。在重金属离子的检测中，核酸适配体得到了充分应用，Liu[12]和Jiang[13] 等利用Hg2+可以形成T-Hg-T结构，实现对Hg2+的高特异性和高灵敏度的检测。Lu等[14]通过Pb2+能诱导富G核酸链-TBAA特异性形成G-四链体结构，从而实现Pb2+的高特异性和高灵敏度的可视化检测。邓欢等[15]将门控制效应和核酸适配体结合，构建检测Pb2+的电化学生物传感器。Long[16]与Deng[17] 等基于Pb2+诱导核酸适配体PW17和T30695构型改变导致体系荧光强度变化，开展了氡的非标记荧光传感生物分析新方法研究。

G-四链体构象的稳定性与其所结合的阳离子种类有关，不同构型G-四链体与Hemin结合后催化活性差异明显，表现出不同的过氧化物酶活性[18～20]。Kong研究组基于G-四链体与Hemin结合具有过氧化物酶活性，催化ABTS-H2O2系统显色，构建了Ag+、Hg2+等重金属的检测平台[21～23]。本研究根据氡辐射衰变特点，结合Pb2+的现代分析技术，研究了K+和Pb2+诱导PS2.M分别形成不同结构G-四链体的特性，建立了一种基于Pb2+诱导PS2.M构象改变的过氧化物酶活性“Turn-off”型比色传感器，实现了Pb2+和氡的灵敏检测。

试验所用材料为潍县萝卜种子,由山东省潍坊市农业科学院提供。试验于 2016年在潍坊学院生物与农业工程学院种子科学与工程实验室进行。

2 实验部分

2.1 仪器和试剂

UV-2550紫外-可见分光光度计(日本岛津仪器公司); J-815圆二色谱光谱仪(日本Jasco公司); AB204-S电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司); PB-20(PB-S)型精度酸度计(德国赛多利斯公司); 氡室(南华大学核工业第六研究所); 混合纤维素膜(Merck Milipore公司)。

斯通心里既悲痛也焦急，眼看预定的探察时间所剩不多。5月下旬，肖特拉高原的雨季即将降临。到时候，涓涓细流将会经过山坡，随后汇聚成溪水，迅速冲入洞穴系统，肖特拉洞内的通道将会响彻地下河水咆哮的回声。那时候，休说探险，任何人若不撤出洞穴，都将遭遇灭顶之灾。

在反应管中，依次加入一定浓度的Pb2+标准溶液、50 μL 100 mmol/L Tris-HAC缓冲液(pH=5.0)、10 μL 10 μmol/L K+标准溶液、 20 μL 25 μmol/L Hemin试剂和50 μL 1 μmol/L PS2.M溶液，充分混匀后，在室温下反应20 min。然后加入30 μL 5 mmol/L TMB及20 μL 100 mmol/L H2O2，混匀，室温下放置35 min后，加入50 μL终止液(2 mol/L HCl)，用超纯水定容至500 μL，混匀，用UV-2550紫外-可见分光光度计测定。

2.2 氡样本的采样方法[16]

测定Pb2+系列标准溶液的吸光度值A及未加Pb2+的试剂空白溶液的吸光度值A0。计算各反应的ΔA(=A0-A)值，绘制标准曲线。如图5所示，体系的吸光度差值ΔA与Pb2+浓度在0.5×10-8～1.8×10-7 mol/L范围内呈良好的线性关系，回归方程为ΔA=0.36+0.13CPb(10-8 mol/L)，相关系数R=0.9987。对空白溶液平行测定11次，计算空白溶液的标准偏差为sb=0.165，按照CL=3sb/k计算出Pb2+的检出限为3.76 nmol/L。

2.3 Pb2+标准溶液的紫外可见光谱测定[19]

冰醋酸(HAc，天津市福晨化学试剂厂); 三羟甲基氨基甲烷(Tris)、KCl(上海阿拉丁生化科技股份有限公司); 铅标准溶液(100.0 μg/mL，中国计量科学院); 富含鸟嘌呤的寡核苷酸链PS2.M(5'-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3'，上海生工生物工程股份有限公司合成); 氯化血红素(Hemin)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB， 上海西格玛奥德里奇贸易有限公司); HCl、H2O2(广东光华科技股份有公司); 实验用水均为灭菌超纯水(电阻率为18.25 MΩ·cm)。

3 结果与讨论

3.1 比色传感原理

图1 铅离子诱导PS2.M构象改变原理图 Fig.1 Schematic diagram of Pb2+-induced conformational changes of PS2.M

根据氡最终衰变成为子体铅，210Pb的半衰期达21年的特点，本研究以子体铅作为目标检测物，研究建立氡浓度的核酸适配体生物分析新方法。氡是一种气态放射物质，密度9.73 g/m3，易溶于水，本研究选择稀醋酸作为吸收液，并用微孔混和纤维素膜覆盖采样器进气口，排除了空气干扰物，氡衰变后的子体铅与稀醋酸发生化学反应，生成Pb2+。

如图1所示，未加入Pb2+时，K+诱导PS2.M形成反式平行G-四链体，该四链体与辅因子血红素(Hemin)结合，形成稳定的具有过氧化物酶活性的复合物，催化TMB-H2O2系统氧化显色。当体系中同时引入Pb2+和K+时，这两种离子竞争与PS2.M的反应，但由于Pb2+与之作用能力更强，诱导PS2.M发生构象改变，形成结构更加稳定的G-四链体，抑制了K+的诱导能力，使辅因子血红素游离在溶液之中，抑制了TMB-H2O2体系氧化还原反应的进行，体系吸光度急剧降低。椐此，建立基于Pb2+诱导的PS2.M构象改变的比色法检测Pb2+和氡[19]。

改变Tris-HAc缓冲液的pH值，考察pH值对反应体系的影响。结果表明，pH值对体系吸光度变化值(ΔA)影响较大。pH=4.0～5.0时，随pH值增大，ΔA值逐渐上升; pH=5.0～7.5时，随pH值增大，ΔA值逐渐下降，因此选择pH=5.0的Tris-HAc溶液维持体系的酸碱性。在pH=5.0条件下进行Tris-HAc缓冲液用量的优化，结果表明，当Tris-HAc缓冲液终浓度为10 mmol/L时体系吸光度值变化最显著。

3.2 紫外-可见光吸收光谱和圆二色谱表征

由图2可见，单独TMB+H2O2体系不发生显色反应 (曲线c); 曲线a在451 nm处有最大吸收峰，说明K+诱导 PS2.M形成的G-四链体结合血红素的复合物具有类过氧化物酶活性，对TMB-H2O2氧化还原反应具有明显的催化作用; 曲线b在451 nm处吸光度明显降低，其原因是Pb2+将K+从已经形成的反式平行G-四链体中竞争出去，使PS2.M构象发生改变，辅因子血红素游离在溶液之中，抑制了TMB-H2O2体系的氧化还原反应，体系吸光度响应值急剧降低。

从建筑、工业、旅行、时尚，到汽车、摩托车、食物、杯具，和我认识的许多设计师不同，吴滨的喜好目录真的可以说上三天三夜。而在众多喜好之中，吴滨和我一样都对英国车有着强烈的好感。

按照采样方法，在南华大学核六所氡实验室采集累积浓度分别为0.71、1.45、3.54、6.57、10.17、13.78、17.60、21.70和25.25(104 Bq·h/m3)的氡辐射样品溶液，采用本方法进行测定，结果如表1。ΔA值随着氡累积浓度的增加而增大，根据Pb2+的标准曲线回归方程ΔA=0.36+0.13CPb(10-8 mol/L)，可得知样品中Pb2+含量也逐渐增加。由图6可见，在一定范围内，氡浓度与ΔA值呈现良好的线性关系：ΔA=0.089CRn+0.59， R=0.9906。由此可建立氡的累积浓度与子体铅之间的定量测定模型。本方法对氡的检测范围为7.10×103～1.02×105 Bq·h/m3， 检出限为1.96×103 Bq·h/m3 (3σ)。

我们精心设计的文件包里不仅包含了所有这些处理，同时还包含了一系列边框等素材，大家只需要将文件下载到硬盘并导入自己的作品中，接着只需点击几次鼠标使用这些效果。

图2 不同体系的紫外-可见吸收光谱图，插图为相应的光学照片 Fig.2 UV visible absorption spectra of the system: (a) K++PS2.M+Hemin+TMB+H2O2; (b) Pb2++K++PS2.M+Hemin +TMB+H2O2; (c) TMB+H2O2; Inset is corresponding optical photographs. K+, 200 nmol/L; PS2.M, 100 nmol/L; Hemin, 1 μmol/L; TMB, 300 μmol/L; H2O2, 4 mmol/L

图3 不同体系的圆二色谱图 Fig.3 Circular dichroism spectra of different systems: (a) 10 μmol/L PS2.M; (b) 10 μmol/L PS2.M+ 10 mmol/L K+; (c) 10 μmol/L PS2.M+ 10 μmol/L Pb2+; (d) 10 μmol/L PS2.M+ 10 mmol/L K++ 10 μmol/L Pb2+

3.3 实验条件优化

IEi,t=α0+α1MPi,t-1+α2Levi,t+α3Roei,t+α4Cashi,t+α5Sizei,t+α6Cfoi,t

Pb2+与K+竞争诱导PS2.M发生构象改变需要一定的反应时间。实验表明，加入PS2.M20 min后，ΔA值逐渐增大; 当时间超过20 min后，ΔA值变化比较平缓，故选择20 min作为PS2.M最佳孵育时间。考察了TMB与H2O2显色时间对实验的影响，最终选择在反应40 min后加入HCl终止反应。

TMB作为一种显色剂，其用量对体系吸收值有一定影响。实验结果表明，用量为0.3 mmol/L时体系吸光度值变化显著且反应稳定。Hemin作为辅助因子，用量为1 μmol/L时，体系吸光度值变化最显著。

3.4 共存干扰物的影响

如图4所示，10倍浓度的以及Cr3+和 Hg2+对160 nmol/L Pb2+测定的干扰很小。由于本方法通过采集氡的子体铅进行氡的检测，采样时，在采样器进气口加封0.8 μm的混和纤维素微孔膜，保证气体氡可以辐射进入采样容器，以利于采集子体铅，阻止了空气中其它颗粒干扰物进入采样容器。因此，这些干扰物质在样品采集时大部分已被排除在容器外，其可能产生的影响被进一步降低，不干扰测定。

图4 共存物质对测定体系的影响 Fig.4 Responses of the established Pb2+ sensor in the presence of foreign substances. Concentration of metal ion of Bi3+, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, Cr3+ and Hg2+: 1.6 mol/L; Pb2+: 160 nmol/L

3.5 标准曲线与检出限

以10 mL 0.2%(V/V)冰醋酸作为吸收液，以直径70 mm、高17 mm一次性塑料培养皿为收集器，在平皿口加封混合纤维素膜(孔径为0.8 μm，Milipore公司); 设定采样时间，将采样器放入氡室，被动式采集含铅样本。采样后密封状态、室温放置4天，经过氡的半衰期，用0.2%醋酸定容至10 mL，混匀，4℃保存，待测。

图5 (A)不同浓度Pb2+时体系的吸收光谱; (B)测定Pb2+的标准曲线 Fig.5 (a) Absorption spectra of system in the presence of different concentrations of Pb2+; (B) Calibration curve for detection of Pb2+

3.6 氡累积浓度的测定和模型建立

圆二色谱测定结果如图3所示，体系溶液中只有PS2.M时，在260 nm处出现一个正峰，加入K+后，在295 nm处出现一个正峰，符合K+诱导PS2.M形成反平行G-四链体结构的特征[24]。在PS2.M中加入Pb2+后，在265 nm处有一个负峰，312 nm处出现一个正峰，这是被Pb2+诱导形成反平行G-四链体的峰的典型谱特征[24～26]。当向PS2.M溶液中同时加入K+和Pb2+时，295 nm处的正峰消失，只在312 nm处出现正峰，且“PS2.M+ K++Pb2+”体系和“PS2.M+Pb2+”体系的圆二色谱图形非常接近，说明K+和Pb2+竞争与PS2.M反应，Pb2+的存在，抑制了K+诱导PS2.M构象改变的能力，也说明了Pb2+与PS2.M结合形成的G-四链体结构更稳定、更容易形成[24]。

表1 样品中Pb2+的检测结果

Table1 Determination results of Pb2+ in the samples

Sample氡浓度CRn(Bq·h/m3)吸光度A(a．u．)样品值Found(nmol/L)加标量Added(nmol/L)测得值Totalfound(nmol/L)相对标准偏差RSD(%，n=6)回收率Recovery(%)10．71×1040．616219．7040．0058．433．396．821．45×1040．703228．4940．0069．963．0103．733．54×1040．954945．4040．0086．472．7102．746．57×1041．245867．4740．00109．132．2104．2510．17×1041．445882．6440．00121．602．397．4613．78×1041．496586．4940．00127．052．1101．4717．60×1041．571392．1740．00131．502．298．3821．70×1041．618295．7340．00134．662．397．3925．25×1041．6933101．4340．00140．253．097．0‘Found’and‘Added’refertothefinalconcentration．

图6 氡累积浓度与吸光度强度的关系 Fig.6 Correlation curve of absorbance intensity and radon concentration

3.7 样品分析与方法学比较

我国GB/T18883-2002《室内空气质量标准》规定，室内空气应无毒、无害、无异常嗅味，其中放射性参数氡(222Rn)年平均值 400 Bq/m3(标准值)，达到此水平建议采取干预行动以降低室内氡浓度。径迹蚀刻法是中国国家标准方法，对氡累积浓度的检出限为2.1×103 Bq·h/m3[27]，本方法对氡累积浓度的检出限为1.96×103 Bq·h/m3(< 2.1×103 Bq·h/m3)，检出限更低。

按照采样方法，采集了2个氡样本，用本方法与美国RAD7测氡仪进行对比测定。结果如表2，对两种方法t检验结果表明，在可信区间为95%的范围内，计算出t1=1.35，t2=0.59，均小于理论值t0.05(10)=2.228， 按照α=0.05的水平接受H0，即差异没有统计学意义，可认为两种方法测定结果的总体均数相同，证明本方法测定的结果可靠。

在“1.3.6”条件下绘制标准曲线为 Y＝2.0×106X－15 721 （R2＝0.999 6）。 表明橙皮苷进样量在 0.30～2.25 μg 呈良好的线性关系。

表2 氡样品的检测结果 (n=6)

Table 2 Determination results of radon in samples (n=6)

样品Sample方法Method测得值Found(×103Bq·h/m3)相对标准偏差RSD(%，n=6)t检验ttest12本方法Thismethod8．372．91．35RAD78．062．7本方法Thismethod14．612．70．59RAD714．402．2

4 结 论

以氡辐射衰变最终形成稳定的子体铅作为目标检测物，建立了检测氡累积浓度的核酸适配体生物分析新方法。本方法仪器设备简单、操作简单快速、抗干扰能力强、灵敏度高，Pb2+的检出限为3.76 nmol/L，氡的检出限为1.96×103 Bq·h/m3。在核科学和物理学中，一般针对氡辐射产生的α射线测定氡的累积浓度。本方法避免了现场进行氡辐射剂量测量的放射性危害，具有良好的应用潜能。

References

1 Inácio M, Soares S, Almeida P. J. Radiat. Res. Appl. Sci., 2017, DOI: 10.1016/j.jrras.2017.02.002

2 Midhun M, Rejith R S, Samuel M, Jojo P J, Sahoo B K. International Journal of Pure and Applied Physics., 2017, 13(1): 172-178

3 Kendall G M, Smith T J. J. Radiol. Prot. , 2002, 22(4): 389-406

4 ZHANG Dong-Sheng, ZHANG Wei, MA Li-Qiang, WANG Xu-Feng, FAN Gang-Wei. Journal of China University of Mining & Technology, 2016, 45(6): 1083-1097

张东升, 张 炜, 马立强, 王旭锋, 范钢伟. 中国矿业大学学报, 2016, 45(6): 1083-1097

5 McColl N P, Green B M R, Dixon D W, Fey R, Meara J R, Harrison J D, Cooper J R. Centre for Radiation, Chemical and Environmental Hazards. London: Health Protection Agency, 2010

6 Klervi L, Maria S, Ladislav T, Nezahat H, Margot T, Bernd G, Michaela K, Dominique L. Radiat. Res., 2011, 176(3): 375-387

7 TIAN Rong, LIU Ying-Yun. Journal of Environmental Engineering Technology, 2016, (1): 35-42

田 蓉, 刘迎云. 环境工程技术学报, 2016, (1): 35-42

8 Kreuzer M, Fenske N, Schnelzer M, Walsh L. Br. J. Cancer, 2015, 113: 1367-1369

9 Farokhzad O C, Jon S, Khademhosseini A, Tran T N, Lavan D A, Langer R. Cancer Res. , 2004, 64(21): 7668-7672

10 Hernandez R, Valles C, Benito A M, Maser W K, Rius F X, Riu J. Biosens. Bioelectron. , 2014, 54: 553-557

11 Kikuchi K, Umehara T, Nishikawa F, Fukuda K, Hasegawa T, Nishikawa S. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2009, 386(1): 118-123

12 Liu B. Biosens Bioelectron, 2008, 24(4): 762-766

13 Jiang Z, Fan Y, Chen M, Liang A, Liao X, Wen G, Shen X, He X, Pan H, Jiang H. Anal. Chem. , 2009, 81(13): 5439-5445

14 Lu Y, Li X, Wang G, Tang W. Biosens. Bioelectron. , 2013, 39(1): 231-235

15 DENG Huan, SUN Mi, WEI Xiao-Ping, LI Hong-Zeng, LI Jian-Ping. Chinese J. Anal. Chem., 2016, 44(6): 888-892

邓 欢, 孙 觅, 魏小平, 黎洪增, 李建平. 分析化学, 2016, 44(6): 888-892

16 Long M, Deng H, Tian G, Song C, Liu H, Shen Y, Lv C. Anal. Chim. Acta, 2016, 936: 202-207

17 Deng H,Long M, Tian G, Song C, Liu H, Hu L, Lv C. RSC Adv., 2016, 43(6): 37254-37257

18 Arola A, Vilar R. Curr. Top. Med. Chem., 2008, 8(15): 1405-1415

19 Li T, Wang E, Dong S. Anal. Chem., 2010, 82(4): 1515-1520

20 Jing T, Dai Y, Ma X J, Huang B B. Chinese Optic, 2016, 9(1): 1-15

荆 涛, 戴 瑛, 马晓娟, 黄柏标. 中国光学, 2016, 9(1): 1-15

21 Kong D M, Xu J, Shen H X. Anal. Chem., 2010, 82(14): 6148-6153

22 Zhou X H, Kong D M, Shen H X. Anal. Chem., 2010, 82(3): 789-793

23 Li T, Wang E, Dong S. J. Am. Chem. Soc., 2009, 131(42): 15082-15083

24 Smirnov I, Shafer R H. J. Mol. Biol., 2000, 296(1): 1-5

25 Smirnov I, Kotch F, Pickering I, Davis J, Shafer R. Biochemistry, 2002, 41(40): 12133-12139

26 GB/T16146-2015, Requirements for Control of Indoor Radon and Its Progeny. National Standards of the People's Republic of China

室内氡及其子体控制要求. 中华人民共和国国家标准. GB/T 16146-2015

27 GB/T18883-2002, Indoor Air Quality Standard. National Standards of the People's Republic of China

室内空气质量标准. 中华人民共和国国家标准. GB/T18883-2002

28 GB/T 14582-1993, Standard Methods for Radon Measurement in Environmental Air. National Standards of the People's Republic of China

环境空气中氡的标准测量方法. 中华人民共和国国家标准. GB/T 14582-1993