多孔结构的微球由于具有大比表面积和高孔隙率，近些年得到人们的广泛关注[1-2]。采用可生物降解材料制备的多孔微球在许多领域具有广泛的应用前景，特别是在药物释放和组织工程领域[3-4]。聚乳酸（PLLA）属于可生物降解的材料，由于原料来源广泛、无毒、生物相容性好，被大量应用于药物释放载体和组织工程支架材料[5-6]。

目前有许多方法被应用于制备多孔微球，例如发泡法[7]、乳液法[8]、喷雾干燥法[9]、相分离法[10]和静电纺丝法[11]等。可生物降解多孔微球主要是通过水包油包水的双乳液溶剂挥发方法制备[12-13]。然而这些方法需要通过多步制备双乳液，制备工艺复杂、消耗时间长，且需要额外工艺处理致孔剂，限制其应用于大规模制备多孔微球。除此之外，上述方法易导致表面活性剂残留在微球内，而该类物质往往具有过敏性和致癌性。

基于以上原因，亟需开发一种工艺简单、可大规模生产可降解多孔微球的方法，应用于生物医疗领域。目前热致相分离（TIPS）被广泛应用于制备纳米纤维结构。该方法制备的纳米纤维具有良好的生物活性，广泛应用于骨组织工程支架材料[14-15]。然而应用该方法制备纳米纤维结构的微球却无相关报道。本研究将PLLA/四氢呋喃（THF）溶液淬火致-30℃，溶液发生液-液相分离形成聚合物富集相和溶剂富集相。在聚合物富集相内具有相似构象的PLLA分子链聚集取向排列生成晶核，并沿晶核附近扩散，使晶体沿着径向生长形成PLLA球晶，即多孔微球。以等温DSC模拟热致相分离过程，求得热致相分离过程中形成 PLLA微球的结晶动力学参数。

1 实验部分

1.1 原料与仪器

PLLA，重均分子量为10000，购于深圳光华伟业有限公司；乙醇、异丙醇和四氢呋喃，分析纯，购于国药化学试剂有限公司。其余试剂为市售分析纯，蒸馏水为实验室自制。DZF-6020型真空干躁箱，上海一恒科技有限责任公司；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；DW2FL90型超低温冷冻存储箱，中科美菱低温科技有限责任公司。

1.2 PLLA多孔微球的制备

将0.7g PLLA加入9.3g THF溶液中，在60℃磁力搅拌5h溶解，得到PLLA/THF淬火溶液。将PLLA/THF溶液倒入培养皿中，盖上盖子。将培养皿放入-30℃的低温冰箱中，淬火 120min。淬火结束后将培养皿快速放入 5℃的蒸馏水中萃取以除去THF溶剂。每隔6h换蒸馏水一次，连续换4次。最后将得到的样品60℃真空干燥24h，放干燥器中备用。

2016年，山东省有6个果蔬区域公用品牌成功入选为第一批著名农产品区域公用品牌名单，胶州大白菜作为其中一个。2017年，11个区域公用品牌，如胶州大白菜被选为最受欢迎的农产品区域公用品牌。胶州大白菜协会继续研发白菜品种、栽培技术和白菜深加工产品的创新和开发形成较强的市场竞争力。

1.3 PLLA多孔微球的结构表征

对采集的62组水样的主要离子检测数据进行汇总，通过统计分析了解研究区地下水化学成分的含量变化(表1)。

式中，分别表示PLLA多孔微球熔融焓和PLLA 100%结晶所对应的熔融焓 [16]。

图3为PLLA多孔微球的N2吸附-脱附等温线，根据国际纯粹与应用化学协会（IUPAC）划分的吸附等温线6种类型，该等温线属于Ⅲ类和Ⅳ类混合型吸附等温线。在 P/P0＜0.9区域内，随着压力的增加，吸附量缓慢增加，在高压力区（P/P0＞0.9），随着压力的增大，吸附量急剧增加。在脱附过程中，在高相对压力区出现了一定的滞后现象，该滞后属于H3滞后环。根据BJH计算得到PLLA多孔微球的平均孔径为 42.92nm，对应的平均孔体积为0.1135cm3/g。根据IUPAC协会规定，大孔（＞50nm）、介孔（2～50nm）、微孔（＜2nm），PLLA多孔微球的平均孔径为42.92nm，因此可以推断PLLA多孔微球的孔大部分为介孔和大孔。一般情况下，介孔呈现Ⅳ类吸附等温线，而大孔呈现Ⅲ类吸附等温线。因此PLLA多孔微球出现了Ⅲ类和Ⅳ类混合型吸附等温线。根据BET计算得到PLLA多孔微球的比表面积为14.18cm2/g，根据乙醇吸附法测定PLLA多孔微球的孔隙率为93.15%。

 

采用Mettler-Toledo DSC822e差示扫描量热分析仪表征热参数，测量条件：温度范围20～200℃，升温速率 10℃/min，氮气保护。结晶度计算采用式(1)。

采用JSM-7500F型（日本JEOL公司）冷场发射扫描电子显微镜（SEM）观察样品形貌，样品表面喷金处理，喷金条件30mA，90s。使用仪器配套软件Smile-View 2.0测量微球直径求统计平均值。取少量样品分散在2mL异丙醇中，超声分散3min，将分散液滴在载玻片上，盖上盖玻片，放在偏光显微镜（美国，Leica，DMLP）下观察黑十字消光图像。采用日本Belsorp-Max分析仪测定液氮温度下样品的N2吸附-脱附等温线，用BET方法计算比表面积。采用乙醇取代法测定PLLA多孔微球的孔隙率。采用荷兰菲利浦X’pert MPD Pro型X射线粉末衍射仪（XRD）对PLLA多孔微球进行物相结构分析，使用 Kα射线 Cu靶作为光源（λ =1.542Å，1Å=0.1nm），工作电压30mA，工作电流40kV，扫描范围10 o～60o，扫描速度8o/min。

采用溶液DSC模拟PLLA/THF溶液低温淬火过程，测试步骤如下：将20～25mg PLLA/THF溶液加入铝坩锅中，盖上坩锅盖。将溶液以50℃/min速率从25℃加热到40℃，保持10min，以除去预先形成的晶核。接着将溶液以50℃/min速率分别降温到-4℃、-2℃、0℃和2℃，保持一定时间，记录此过程中的等温结晶DSC曲线。此实验过程中测量测试前后铝坩锅质量，发现铝坩锅质量并无发生改变，说明测试过程中溶剂并没有挥发。

2 结果与讨论

2.1 PLLA多孔微球扫描电镜图

AL104型电子秤 梅特勒-多利多仪器(上海)有限公司；恒温培育箱 上海一恒科学仪器有限公司；标准试验筛 上虞市银河测试仪厂。

图2(b)为PLLA多孔微球的DSC图。PLLA多孔微球在 156.8℃处有一个吸热峰，该吸热峰属于PLLA晶区熔融吸热峰。根据该吸热峰计算得到PLLA结晶度为36.05%。PLLA为半结晶性聚合物，通过熔融挤出造粒得到的PLLA原料的结晶度一般低于 10%，因此本研究通过低温熔融淬火得到的PLLA多孔微球的结晶度得到了大大提高，该研究结果与XRD结果相一致。除了156.82℃处出现的熔融吸热峰外，在 74.29 ℃处出现了较小的吸热峰。PAN[21]和PYDA等[22]在研究PLLA结晶过程中在 60～70℃附近也发现了该吸热峰。PAN认为该吸热峰为PLLA局部有序区域的熔融，而PYDA认为此吸热峰为玻璃化转变区域内自由体积的明显恢复。

2.2 PLLA多孔微球XRD和DSC分析

图2(a)为PLLA多孔微球的XRD图。从图中可知 2θ=12.55°、14.82°、16.74°、19.09°、22.44°、27.22°和 29.14°吸收峰所对应的晶面为(004)/(103)、(010)、(200)/(110)、(203)、(105)、(207)和018。利用谢乐公式，以2θ=16.74°衍射峰计算得到晶粒尺寸大小为 17.25nm。查阅相关文献发现[17-18]，该晶型属于α晶型，晶胞内含有两条反向平行103螺旋分子链，每个晶胞内含有20个乳酸单元，对应的晶胞参数为 a=1.07nm，b=0.645nm，c=2.78nm。一般认为PLLA熔融或溶液结晶主要生成α晶型。然而ZHANG等[19-20]在研究PLLA熔融结晶过程中发现了α’晶型，该晶型结构与α晶型略有差别，α’晶型的 103螺旋链较为松散，堆积不紧密。而本文通过溶液淬火结晶所形成的α晶型，分子链堆积更紧密，晶型结构更加完整。

将PLLA/THF溶液放入低温冰箱中淬火，淬火结束后，将PLLA/THF溶液从冰箱中拿出，可明显观察到PLLA/THF溶液失去流动性，形成了凝胶。该现象一般认为凝胶的形成是低温淬火过程中聚合物PLLA微晶的形成。将凝胶快速放入5℃水中萃取。由于 THF和水能以任意比例互溶，因此将PLLA/THF凝胶放入冷水中，溶剂THF能快速从凝胶体系中渗出进入水溶液中，而水是PLLA的不良溶剂，PLLA从凝胶体系中析出形成固体状。因此保持了其在凝胶中的固有形貌。

  

图1 PLLA多孔微球扫描电镜图

图1(a)为 PLLA/THF溶液，通过-30℃淬火120min，从低温冰箱中拿出后，萃取、洗涤、干燥得到的 PLLA形貌图。样品呈微球状，直径为30.92μm±1.55μm，且微球是由球中心向外辐射直径为 0.34μm±0.06μm 纤维组成[图 1(b)]。图 1(c)为一个微球的断面，微球内部也由中心向外辐射生长的纳米纤维组成，与微球表面结构一样。图1(d)为微球在偏光显微镜下的图像，出现了明显的黑十字消光图，因此可以断定制备的聚乳酸微球为球晶。聚乳酸球晶主要是通过低温淬火热致相分离过程中所形成的。溶液在降温的过程中，当温度低于溶液的浊点时，溶液首先发生液-液相分离形成聚合物富集相和溶剂富集相，在聚合物富集相内具有相似构象的聚乳酸分子链聚集取向排列生成晶核，并沿着浓度梯度方向即低浓度方向扩散，使晶体沿着径向生长形成聚乳酸球晶。

  

图2 PLLA多孔微球的XRD及DSC图

2.3 氮气吸附脱附曲线分析

建造苹果树繁育苗圃是繁育苹果树幼苗的第一步，好的开头是成功的一半，所以，种植者应该合理的建造苹果树苗圃，从而达到提高苹果树产量的目的。苗圃中幼苗之间的行距为不宜太过密集，一般距离是1米×0.5米。使用这样的栽培技术可以十分有效地解决常见的苹果质量问题，例如果实成熟晚、果实个头过小和质量参差不齐的问题。

  

图3 PLLA多孔微球的N2吸附-脱附曲线

2.4 等温结晶动力学

前文讨论到PLLA多孔微球是一种球晶结构，即微球是PLLA/THF溶液低温淬火结晶过程中所形成的。因此本研究拟采用DSC模拟低温淬火结晶过程，以求得结晶过程中各动力学参数值。图 4(a)为-4℃、-2℃、0℃和2℃条件下等温结晶 DSC曲线。4个温度下等温结晶均出现了放热峰，该放热峰为PLLA的结晶放热峰。各温度下的结晶焓（ΔHc）总结于表1中，不同温度下等温结晶对结晶焓无太大影响，平均结晶焓变为 16.23J/g。且从图 4(a)可知，结晶温度从-4℃增加到2℃，结晶放热峰变宽，说明结晶温度升高，结晶时间变长。

  

图4 等温结晶DSC曲线及Avrami双对数曲线

 

表1 PLLA/THF溶液等温结晶动力学参数

  

结晶温度/℃ 结晶焓变/J·g-1 n K/min-n 2 15.71 2.32 0.13 0 15.14 2.35 0.38-2 17.42 2.24 1.54-4 16.63 2.23 4.67平均值 16.23 2.29 1.68

Avrami方程是一种最常用的研究聚合物等温结晶动力学的方法，方程的具体形式为式(2)。

 

式中，X(t)为时间为 t时的相对结晶度；n为Avrami指数，与聚合物的结晶和成核方式有关；K为结晶速率常数，包括晶核形成速率和晶体生长速率。以对lgt作图，直线的斜率和截距分别为n和K值。图4(b)为Avrami双对数曲线，不同的结晶温度下，双对数曲线显示出非常好的线性关系。说明Avrami方程非常适合于本体系的等温结晶动力学研究。动力学参数n和K值总结于表1中。不同的结晶温度，n值并没有发生太大的变化，在2.23～2.35范围内，说明PLLA在THF溶液中的结晶为异相成核和三维生长[23]。然而K值却从0.13（Tc=2℃）增加到4.67min-n（Tc= -4℃），说明结晶温度降低，结晶速率增大。

3.1.1 万华生态板业（信阳）有限公司基本概况 万华生态科技园位于河南省信阳市工业城工十四路19号，其公司成立于2007年是万华生态板业股份有限公司的子公司，每年生产5万m3禾香板。公司产品是使用秸秆生产的禾香板，供货给好莱客、亚丹、欧派等知名厂商。

3 结论

采用低温淬火、萃取等方法从PLLA/THF溶液中成功制备由纤维组成的PLLA多孔微球。该微球属于α晶型的球晶结构，晶粒尺寸大小和结晶度分别为17.25nm和36.05%。与原材料PLLA相比，低温淬火后结晶度大大提高。说明该过程中PLLA分子链发生了有序规整堆积，因此结晶度大大提高。PLLA多孔微球大部分为大孔和介孔结构，比表面积和孔隙率分别为14.18cm2/g和93.15%。PLLA多孔微球的形成过程中，PLLA在THF溶液中为异相成核和三维生长。

参考文献

[1]CHUNG H J，PARK T G.Surface engineered and drug releasing pre-fabricated scaffolds for tissue Engineering[J].Advanced Drug Delivery Reviews，2007，59（4）：249-262.

[2]HE C，NIE W，FENG W.Engineering of biomimetic nanofibrous matrices for drug delivery and tissue engineering[J].Journal of Materials Chemistry B，2014，2（45）：7828-7848.

[3]FAN J B，HUANG C，JIANG L，et al.Nanoporous microspheres：from controllable synthesis to healthcare applications[J].Journal of Materials Chemistry B，2013，1（17）：2222-2235.

[4]AMBROSCH K，MANHARDT M，LOTH T，et al.Open porous microscaffolds for cellular and tissue engineering by lipid templating[J].Acta Biomaterialia，2012，8（3）：1303-1315.

[5]LIU R L，HAN J，CHEN X J，et al.Fabrication and control of ploylactied honeycomb porous films by breath figure method[J].Acta Polymerica Sinica，2012（3）：291-298.

[6]XIAO G，YIN H，XU W，et al.Modification and cytocompatibility of biocomposited porous PLLA/HA-microspheres scaffolds[J].Journal of Biomaterials Science：Polymer Edition，2016，27（14）：1462-1475.

[7]KIM S，KO J W，PARK C B.Bio-inspired mineralization of CO2 gas to hollow CaCO3 microspheres and bone hydroxyapatite/polymer composites[J].Journal of Materials Chemistry，2011，21（30）：11070-11073.

[8]HU Y，ZOU S，YANG Y，et al.Facile fabrication of macroporous PLGA microspheres via double-pickering emulsion templates[J].Macromolecular Chemistry and Physics，2015，216（7）：714-720.

[9]MEEUS J，SCURR D J，AMSSOMS K，et al.Surface characteristics of spray-dried microspheres consisting of PLGA and PVP：relating the influence of heat and humidity to the thermal characteristics of these polymers[J].Molecular Pharmaceutics，2013，10（8）：3213-3224.

[10]SHIN K C，KIM B S，KIM J H，et al.A facile preparation of highly interconnected macroporous PLGA scaffolds by liquid-liquid phase separation Ⅱ[J].Polymer，2005，46（11）：3801-3808.

[11]QIU K，HE C，FENG W，et al.Doxorubicin-loaded electrospun poly(L-lactic acid)/mesoporous silica nanoparticles composite nanofibers for potential postsurgical cancer treatment[J].Journal of Materials Chemistry B，2013，1（36）：4601-4611.

[12]JIANG B，AKAR B，WALLER T M，et al.Design of a composite biomaterial system for tissue engineering applications[J].Acta Biomaterialia，2014，10（3）：1177-1186.

[13]LIU B，ZHOU X，YANG F，et al.Fabrication of uniform sized polylactone microcapsules by premix membrane emulsification for ultrasound imaging[J].Polymer Chemistry，2014，5 （5）：1693-1701.

[14]KIM H D，BEA E H，KWON I C，et al.Effect of PEG-PLLA diblock copolymer on macroporous PLLA scaffolds by thermally induced phase separation[J].Biomaterials，2004，25（12）：2319-2329.

[15]BARROCA N，DANIEL-DA-SILVA A L，VILARINHO P M，et al.Tailoring the morphology of high molecular weight PLLA scaffolds through bioglass addition[J].Acta Biomaterialia，2010，6（9）：3611-3620.

[16]HE L，ZHANG Y，ZENG X，et al.Fabrication and characterization of poly(L-lactic acid) 3D nanofibrous scaffolds with controlled architecture by liquid-liquid phase separation from a ternary polymer-solvent system[J].Polymer，2009，50（16）：4128-4138.

[17]DE SANTIS P，KOVACS A J.Molecular conformation of poly（S-lactic acid）[J].Biopolymers，1968，6（3）：299-306.

[18]HOOGTEEN W，POSTEMA A R，PENNINGS A J，et al.Crystal structure，conformation and morphology of solution-spun poly（L-lactide） fibers[J].Macromolecules，1990，23（2）：634-642.

[19]ZHANG J，DUAN Y，SATO H，et al.Crystal modifications and thermal behavior of poly（L-lactic acid）revealed by infrared spectroscopy[J].Macromolecules，2005，38（19）：8012-8021.

[20]ZHANG J，TASHIRO K，TSUJI H，et al.Disorder-to-order phase transition and multiple melting behavior of poly(L-lactide)investigated by simultaneous measurements of WAXD and DSC[J].Macromolecules，2008，41（4）：1352-1357.

[21]PAN P，ZHU B，DONG T，et al.Conformational and microstructural characteristics of poly （L-lactide）during glass transition and physical aging[J].The Journal of Chemical Physics，2008，129：184902.

[22]PYDA M，WUNDERLICH B.Reversing and nonreversing heat capacity of poly(lactic acid) in the glass transition region by TMDSC[J].Macromolecules，2005，38（25）：10472-10479.

[23]LORENZO A T，ARNAL M L，ALBUERNE J，et al.DSC isothermal polymer crystallization kinetics measurements and the use of the Avrami equation to fit the data：guidelines to avoid common problems[J].Polymer Testing，2007，26（2）：222-231.