Willis环由两侧大脑前动脉起始段、两侧颈内动脉末端、两侧大脑后动脉借前、后交通动脉连通而成，其作用是调节血液分配，维持脑营养和功能活动。Willis环是颅内动脉瘤和脑缺血好发部位，颅内动脉瘤尤其好发于Willis环动脉分叉部［1］。小鼠因体型小、便于操作、价格便宜、转基因种系多等优势常用于脑动脉瘤、脑缺血、阿尔兹海默症等［2-5］模型的Willis环建模。通过小鼠Willis环灌注成像了解其完整结构，可为小鼠脑动脉瘤和脑缺血模型提供有效的实验证据。目前Willis环灌注方法多通过小鼠心尖处（左心室）进行心脏灌注，应用不同灌注剂（混合或不混合染液），最后取脑观察Willis环。这些方法虽可观察到Willis环结构，但多不完整或充盈不良，对微小脑动脉瘤就更难以清晰显示。为解决这些问题，本实验通过小鼠右侧颈总动脉灌注对比剂Microfil显示Willis环，旨在评价其成像可行性和效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级C57BL/6小鼠20只（雄性，约14周龄，重约20 g）。本实验设施环境条件符合中国国家标准《实验动物环境及设施》（GB14925-2001）对屏障动物实验设施的有关标准，动物饲养管理和动物实验操作符合《上海市实验动物管理条例》等法规要求。所有小鼠经标准实验室饮食喂养。研究时间为2016年3月至2017年6月。

1.2 方法

小鼠肌内注射肝素（500 U/kg），30 min后肌内注射氯氨酮稀释液（1∶4）0.2 mL作麻醉；固定小鼠后解剖胸腔，依次自心尖灌注37℃0.9%氯化钠溶液10 mL、4%多聚甲醛溶液和2%戊二醛溶液混合液（1∶1）15 mL；显微镜下分离右侧颈总动脉，将24 g留置针从心尖插入右侧颈总动脉起始部或中段，连接注射器后30 min内匀速缓慢推注Microfil（MV-130∶稀释剂 ∶硬化剂＝4∶5∶0.45）5 mL， 灌注操作示意图见图1；灌注后小鼠4℃过夜，从面部分离颅底骨后取脑，浸入4%甲醛中2～3 d，Stemi 508型和Axiocam 506 color型体视镜（德国Carl Zeiss公司）下观察。

1.3 评价

  

图1 小鼠灌注操作示意图

 

①24 g留置针自小鼠心尖插入右侧颈总动脉起始部或中段，未灌注Microfil；②未灌注Microfil时右侧颈总动脉局部示意图（箭头指向24 g留置针尖端）；③24 g留置针自心尖插入右侧颈总动脉起始部或中段灌注Microfil；④灌注Microfil后右侧颈总动脉局部示意图（箭头指向24 g留置针尖端）

将体视镜下观察到的Willis环定义为3种状况：①完全充盈，即所有血管包括双侧颈内动脉、大脑中动脉和大脑前动脉充盈良好、灌注清晰，立体感强；②大部分充盈，即部分血管充盈良好、灌注清晰；③充盈不良，即仅有少部分血管充盈良好。

2 结果

通过小鼠右侧颈总动脉途径Microfil灌注Willis环成像技术建立的小鼠Willis环形态结构见图2。20只实验小鼠全部灌注成功，总灌注成功率为100%。其中完全充盈11只（55%），大部分充盈4只（20%），充盈不良5只（25%）。大体观察小鼠灌注后Willis环完整，染色血管显示清晰；体视镜下观察小鼠Willis环清晰、充盈、立体。

小鼠Willis环灌注前试验已有学者报道，但方法与本研究有所不同。Lee等［8］对小鼠皮下注射肝素再麻醉30 min后，先灌注温0.9%氯化钠溶液和2%戊二醛，再以持续100 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）压力向左心室灌注多聚甲醛固定血管，脑充盈后在55℃恒温箱过夜聚合，再浸入15%氢氧化钾溶液腐蚀，流水冲洗，浸入5%蚁酸15 min，冷冻干燥机中脱水48 h；脱水样本覆盖上离子涂层后于扫描电镜（韩国COXEM公司）下观察。此方法可观察到清晰的动脉图像，但灌注方法操作复杂，处理时间长，腐蚀剂存在一定危险性，且未经染色，观察效果欠佳。李广意等［9］在实验小鼠麻醉后，体视显微镜下向左心室灌注填充剂（过氯乙稀10 g、乙酸乙脂90 mL、邻苯二甲丁2.7 mL和红色油料适量按比例配制），再将小鼠头部分离并浸于盐酸，对颅骨进行腐蚀软化；待颅骨软化后用手术器械剥离，于体视镜下观察。此方法优点是所取Willis环完整，缺点是取脑操作复杂，需要盐酸反复腐蚀小鼠颅骨，还要再用器械修饰。Sugiyama等［10］在小鼠麻醉后左心室插管，先后注射0.9%氯化钠溶液2 mL和预先混有Mogul L碳黑50 μL的乳胶复合物0.5 mL进行灌注。

钻孔井口为1 m×1 m×20 mm钢板1块，预埋螺栓M20×630 mm 4套，20 mm肋板4块；钻孔井下托盘为1 m×1 m×10 mm钢板1块，4块300 mm×300 mm×12 mm四角托盘，17.8×8000 mm锚索4套。

3 讨论

  

图2 小鼠Willis环形态结构

 

①Willis环完全充盈；②Willis环大部分充盈

通过左心室进行心脏灌注，Willis环不易完全充盈。为解决这一问题，本实验在保留前实验优点基础上对某些步骤加以改进。首先，与之前学者研究的通过心尖-左心室-主动脉弓-头臂干-右侧颈总动脉-右侧颈内动脉-Willis环行心脏灌注途径不同，本实验经右侧颈总动脉-右侧颈内动脉-Willis环途径灌注，省去了心尖-左心室-主动脉弓-头臂干这一中间环节，使得灌注血管充盈度更好，Willis环动脉显像更加具有立体感。相比于其它研究者灌注后易于观察Willis环血管外径，本实验灌注后更易于观察Willis环血管内径，达到MRA观察效果。其次，本实验选择Microfil对比剂进行小鼠Willis环灌注。Microfil是由MV染剂、稀释剂、硬化剂按一定比例混合而成的复合物。在生理注射压力下灌注Microfil即能充满小鼠微血管，并使其不透明；Microfil具有微小收缩性，可完全填充血管，提高血管灌注连续性，保证灌注后微循环在观察时清晰生动；经Microfil灌注的组织颜色具有多样化，便于显微检查和摄片［11］。再次，小鼠经灌注后从面部分离颅底骨取脑，无需腐蚀取脑。经过改进后，操作步骤得以简化且更安全，试验用时相应缩短。

在我国的部分地区，开展的民俗旅游，都出现了同质化现象，而造成这一现象的主要原因，则是开发者过度重视经济利益，而纷纷效仿别的地区的开发模式，并且将本地区原有的民俗文化活动摒弃，造成了本地区民俗文化的失真，而原本引进过来的民俗文化，又因与当地历史背景不符，从而产生了徒有其形的旅游项目，让慕名而来的旅者大失所望，影响了业界的口碑。

相比大型动物，小型动物（如鼠科、兔等）更常用于动脉瘤和脑缺血建模试验［6］。其中鼠科动物体型小、价格便宜，且因转基因技术发展有着广泛种系，可进行复杂分子和细胞技术检测［7］，故最常用于动脉瘤和脑缺血实验研究，而小鼠Willis环灌注常作为实验环节一部分。

实施本实验需注意：①Microfil浓度配比。硬化剂浓度过高可能在未完全灌注前Microfil先凝固，不能完成灌注，浓度过低则长时间灌注也不凝固，导致血管充盈不充分。②0.9%氯化钠溶液和固定剂推速可相对较快。Microfil灌注速度应缓慢匀速，流量过快可能造成小血管破裂，Willis环得不到完全灌注。但应注意Microfil要在30 min内灌注完成。

公开透明。军队行政权力清单制度要求将制定的权力和责任目录及权力运行流程图，根据权力事项秘密等级在一定范围内公开。这使得本来模糊的军队权力通过公开而变得透明起来，确保权力在阳光下公开、透明地运行。

本实验结论认为，通过小鼠右侧颈总动脉途径灌注Microfil显示Willis环方法简单、可行，不仅能使小鼠Willis环充盈良好，还能清晰显示其立体结构，具有MRA成像效果。

［参 考 文 献］

［1］ Alfano JM，Kolega J，Natarajan SK，et al.Intracranial aneurysms occur more frequently at bifurcation sites that typically experience higher hemodynamic stresses［J］.Neurosurgery， 2013， 73： 497-505.

［2］ Nowicki KW，Hosaka K，Walch FJ，et al.M1 macrophages are required for murine cerebral aneurysm formation［J］.J Neurointerv Surg，2018，10：93-97.

［3］ Hecht N， Schneider UC， Czabanka M， et al.Endothelial progenitorcellsaugmentcollateralization and hemodynamic rescue in a model of chronic cerebral ischemia［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2014，34：1297-1305.

［4］ Roher AE， Esh C， Kokjohn TA， et al.Circle of willis atherosclerosis is a risk factor for sporadic alzheimer's disease［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2003， 23： 2055-2062.

［5］ Beckmann N，Schuler A，Mueggler T，et al.Age-dependent cerebrovascular abnormalities and blood flow disturbances in APP23 mice modeling Alzheimer's disease［J］.J Neurosci， 2003，23：8453-8459.

［6］ 杨 飞，姜建威，王 鹏，等.新西兰大白兔脑血管造影：脑底动脉环的解剖与变异［J］.介入放射学杂志，2013，22：216-218.

［7］ Bouzeghrane F， Naggara O， Kallmes DF， et al.In vivo experimental intracranial aneurysm models：a systematic review［J］.AJNR Am J Neuroradiol， 2010， 31： 418-423.

［8］ Lee S， Kim IK， Ahn JS， et al.Deficiency of endotheliumspecific transcription factor Sox17 induces intracranial aneurysm［J］.Circulation， 2015， 131： 995-1005.

［9］ 李广意，邹柯杰，赵 娟，等.利用灌注技术观察昆明小鼠Willis环的形态结构［J］.实验动物科学，2014，31：21-22.

［10］ Sugiyama Y， Yagita Y， Oyama N， et al.Granulocyte colonystimulating factor enhances arteriogenesis and ameliorates cerebral damage in a mouse model of ischemic stroke［J］.Stroke，2011，42：770-775.

［11］ Zhu YQ， Dai DY， Xing HX， et al.Concomitant aneurysm detection in an intracranial dolichoectasia mouse model using a MicroFil polymer perfusion technique［J］.J Neurointerv Surg，2017，9：783-786.