缺血性脑卒中约占所有脑卒中患者87%［1-2］，现阶段虽进行大量临床试验研究，但除了早期静脉注射重组组织型纤溶酶原激活剂（rt-PA）和介入治疗外，再无其它更有效的临床治疗手段［3-4］。脑卒中触发一系列复杂细胞分子间反应，最终导致神经细胞在脑缺血中发生坏死、凋亡、氧化应激和炎性反应等［5-7］，但脑卒中诱导的细胞死亡和神经功能障碍确切机制目前仍不清楚。既往研究表明肿瘤抑制蛋白p53是一种能介导大量细胞内外反应，并在细胞周期阻滞和凋亡中起关键作用的转录因子［8］。葡萄糖剥夺（glucose deprivation，GD）结合氧糖剥夺（oxygenglucose deprivation，OGD）是脑缺血常见体外模型［9-11］。阐明 OGD/再灌注（reperfusion，R）所诱导神经元死亡的潜在细胞和分子机制，无疑有助于脑缺血神经保护药物开发。微小核糖核酸（microRNA，miRNA，miR）是由19～22个核苷酸（NT）组成的非编码RNA，作为转录后重要调节因子，常与多靶点信使RNA（mRNA）协同调控靶基因［12］。 越来越多研究发现miR在各种生物学过程，如心血管相关疾病中细胞增殖、分化、凋亡和信号转导中具有重要作用［13-15］。有研究证实miR在脑缺血反应中起重要作用［16］，在前脑缺血［17］、局灶性脑缺血［18］及缺血性脑卒中患者中与缺血性脑损伤密切相关［19］，并进一步证实miR-29家族在缺血性脑损伤中发挥重要作用。目前关于miR-29功能的争议在于其到底是对抗还是促进神经细胞凋亡［20］。许多研究显示miR-29在不同细胞或不同病理/生理条件下与不同靶点结合，抗凋亡和促凋亡作用均会产生［21-23］。一项研究表明脑梗死部位miR-29b缺失是脑卒中关键因素之一，miR-29b类似物治疗降低脑卒中引起的神经细胞死亡和脑梗死面积［24］。本研究旨在通过神经细胞损伤和卒中结局背景下细胞生物学和体外实验，探讨miR-29b在脑缺血进展中经p53介导凋亡通路对脑缺血性损伤是否有治疗作用及其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 实验药品及试剂

miR-29b激动剂和抑制剂序列（上海吉玛制药技术公司）、p53小干扰RNA（siRNA）序列和阴性对照siRNA（美国Thermo Fisher科技公司）、溴化噻唑蓝四氮唑（MTT）法检测试剂盒和Hoechst 33258染色液（美国Sigma-Aldrich公司）、乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测试剂盒和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（caspase）-3活性检测试剂盒（上海碧云天生物技术公司）、兔抗-Bax抗体、兔抗Bcl-2多克隆抗体及山羊抗兔辣根过氧化物酶（HRP）共轭二次抗体（美国CST公司）。本实验所有试剂均为分析纯级。

1.2 N2a细胞培养

取小鼠成神经细胞瘤N2a细胞（美国菌种保藏中心，ATCC），置于加入 10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的Dulbecco改良伊格尔培养基（DMEM），37℃、5%CO2、95%O2环境下培养。培养介质1～2 d更换1次。

1.3 OGD/R模型建立及miR-29b激动剂等转染

对N2a细胞作OGD处理，置于脱氧葡萄糖DMEM， 在 5%CO2、1%O2、94%N2缺氧环境下培养4 h，然后置于含葡萄糖DMEM，正常培养条件（5%CO2、95%O2）下于 0、3、6、12、24 h 作 R 处理，体外脑缺血状态模型建立。采用实验浓度Lipofectamine 3000转染试剂（美国Invitrogen公司）对miR-29b激动剂、抑制剂、阴性对照miR、p53 siRNA和阴性对照siRNA进行转染，6 h后按指示时间用OGD/R处理N2a细胞，了解OGD/R模型中N2a细胞miR-29b和p53所起作用。将N2a细胞随机分为6组：空白对照组（C组）、OGD/R组、OGD/R+转染 miR-29b激动剂组（OGD/R+miR-29b M组）、OGD/R+转染miR-29b抑制剂组（OGD/R+miR-29b I组）、转染 miR-29b激动剂阴性对照组（miR-29b M组）、转染miR-29b抑制剂阴性对照组（miR-29b I组）。实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测N2a细胞中miRNA转染效率（基于miR-29b水平），免疫印迹法检测p53 siRNA转染效率（基于p53水平）。hsa-miR-29b激动 剂 有 义 链 为 ：5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’， 反义链为：5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’； 阴性对照miRNA有义链为：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’， 反义链为：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

表妹夫吭吭哧哧地有点不好意思：“我心目中最理想的妻子就是嫂子这样的！能和表哥一起承担养家压力，有自己喜欢的工作，有个人生活和朋友圈子，信任、理解表哥，给表哥充分的自由空间，表哥是我认识的已婚男人当中最有福气的一个！”

1.4 MTT比色法和LDH检测

Trizol试剂（美国Invitrogen公司）提取培养的N2a细胞总RNA，用含miRNA特异性引物的TaqMan miR定量PCR试剂盒（美国Thermo Fisher科技公司）从1 μg总RNA中合成第一链cDNA；PCR反应后，按使用说明书程序，用ABI Prism 7900HT型荧光 qPCR仪（美国 ABI公司）、All-in-OneTMqPCR Mix试剂（美国GeneCopoeia公司）检测miR-29b水平。qRT-PCR 检测过程：94℃变性 5 min，94℃解链 60 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，40 个周期 72℃延伸10 min；RNU6视作内部控制基因；miR扩增引物：miR-29b前引物为 5’-GGGTAGCACCATTTGAAATC-3’，miR-29b 后引物为 5’-TTTGGCACTAGCACATT-3’，U6 前 引 物 为 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，U6 后引物为 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。所有实验重复3次，所有样品均为正常内部控制。采用比较CT分析（2-△CT）获得数据lg2（基因芯片归一化信号）。

1.5 Hoechst 33258染色观察N2a细胞凋亡形态特征

N2a细胞经OGD 4 h，RT-qPCR检测不同R处理时间点（0、3、6、12、24、48 h）N2a 细胞中 miR-29b表达，结果显示miR-29b水平与空白对照组相比明显下调，R处理12 h达平台期（图1①），N2a细胞活力经 OGD（4 h）和 R（12 h）处理显著降低（图 1②），LDH释放增加（图1③）；表明OGD/R处理可诱导N2a细胞毒性，miR-29b水平随之降低，这可能与脑缺血性损伤有关。

Hoechst 33258染色显示，miR-29b激动剂或抑制剂单独应用对N2a细胞凋亡无影响；OGD/R处理增加了N2a细胞中核碎裂现象及作为凋亡细胞代表性的亮蓝色核数量，这些反应会被miR-29b激动剂消除，miR-29b抑制剂放大（图3①）；miR-29b激动剂转染减弱OGD/R处理后细胞凋亡过程中最主要执行者caspase-3活性，miR-29b抑制剂加强OGD/R处理后caspase-3活性（图3②）；结果表明miR-29b有抑制OGD/R诱导的N2a细胞凋亡的作用。

1.6 caspase-3活性检测

按上述方法处理N2a细胞，6孔培养板上接种N2a细胞，处理后4℃、12 000转速离心10 min，收集离心后蛋白提取物，生物蛋白试剂盒（美国Bio-Rad Laboratories公司）测定蛋白浓度；96微孔培养板中加入30 μg等量蛋白提取物，37℃下与caspase-3活性显色底物（Ac-DEVD-pNA，100 μm）培养 4 h；微孔板检测器于D405处检测caspase-3活性。采用非诱导细胞完成检测，也先用Ac-DEVD-CHO进行比较分析。

(3)矩阵一致性检验。矩阵一致性检验是为了保证专家在对评价指标进行打分时，确保每位专家评分的一致性、标准性，以免出现自相矛盾的现象。因此，应用层次分析法时，需进行判断矩阵的一致性检验，以保持判断思维的一致性。可采用检验系数C.R.检验判断矩阵的一致性。

1.7 RNA分离和RT-qPCR分析

N2a细胞接种至96孔5×104细胞/mL培养板，加入 5 mg/mL MTT 液（20 μl/孔）并在 37℃下培育 3～4 h，加入 150 μl二甲基亚砜（DMSO）溶解深蓝色晶体；微孔板检测器（Thermo MK3酶标仪）于490 nm吸光度处检测细胞存活。对照组不作任何处理，表示为100%细胞存活值，其余各组按此值作归一化处理。96孔板中培养N2a细胞，随后同上述处理；微孔板检测器于490 nm吸光度（D490）处测定培养上清液中LDH水平。对照组不作任何处理，表示为100%值，其它组归为此值。

1.8 免疫印迹分析

N2a细胞经野生型p53（wt-p53）siRNA转染后用miR-29b激动剂处和OGD/R处理，免疫印迹法检测显示wt-p53基因可明显增加N2a细胞p53蛋白水平（图5①），MTT法检测显示OGD/R处理后经wt-p53转染，miR-29b激动剂诱导N2a细胞存活率增加明显减弱（图5②），miR-29b激动剂减少LDH漏出率也被N2a细胞转染的wt-p53基因阻断（图5③）；表明p53基因过度表达能逆转miR-29b对抗OGD/R诱导的N2a细胞损伤，p53介导miR-29b调控OGD/R诱导的N2a细胞损伤。

1.9 统计学分析

免疫印迹法检测Bax与Bcl-2表达见图4①，miR-29b激动剂和抑制剂单独转染对N2a细胞凋亡相关蛋白无影响，OGD/R处理显著增加了Bax蛋白表达并降低Bcl-2蛋白表达，miR-29b激动剂对N2a细胞预刺激能阻断这些反应，也可通过miR-29b抑制剂对N2a细胞预刺激加重这些反应（图4②③），miR-29b激动剂下调 p53蛋白水平，miR-29b抑制剂上调p53蛋白水平（图4④）；表明miR-29b激动剂和抑制剂会改变p53介导凋亡信号转导通路，miR-29b对抗OGD/R诱导N2a细胞损伤的作用可能在于p53信号转导通路激活与Bax和Bcl-2蛋白表达的交替变化。

2 结果

2.1 OGD/R处理后miR-29b水平变化

N2a细胞接种至24孔培养板并进行处理，用冷磷酸缓冲液（PBS）轻轻冲洗N2a细胞2次，4%多聚甲醛固定15 min；PBS冲洗3次，Hoechst 33258染色液（5 μg/mL）染色 10 min；PBS 洗涤 3 次，OlympusⅨ71荧光显微镜（日本Olympus公司）下观察细胞核表现出明亮荧光，细胞呈收缩或固缩形态及典型核凝聚现象视为凋亡细胞，弥漫性荧光细胞归为存活或有活性。

  

图1 OGD/R处理对N2a细胞miR-29b水平的影响

 

注：与空白对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；对照组无任何处理，表示为100%值①OGD 处理 4 h 后 RT-qPCR 检测不同 R 时间点（0、3、6、12、24、48 h）N2a细胞中 miR-29b 表达；②OGD（4 h）/R（12 h）处理后 MTT 比色法检测细胞活力；③OGD（4 h）/R（12 h）处理后检测LDH漏出率

2.2 miR-29b对OGD/R处理N2a细胞的影响

经 ODG（4 h）/R（12 h）处理，miR-29b 激动剂转染明显提高了miR-29b水平，miR-29b抑制剂转染明显降低了miR-29b水平，阴性对照组分别对miR-29b水平无影响（图2①）；表明miR-29b激动剂或抑制剂可成功地提高或降低N2a细胞miR-29b水平。MTT法和LDH法分别检测miR-29b激动剂和抑制剂对经OGD/R诱导N2a细胞活性和凋亡的影响，结果显示阴性对照组miR-29b激动剂或抑制剂对细胞活性和LDH漏出率无影响；ODG（4 h）/R（12 h）处理后N2a细胞活力明显减低，这种作用在miR-29b激动剂作用下会逆转，在miR-29b抑制剂作用下会加重（图2②）；miR-29b激动剂降低LDH漏出率，miR-29b抑制剂增加LDH漏出率（图2③）。结果表明，OGD/R诱导的N2a细胞损伤经由抑制miR-29b水平实现。

  

图2 OGD/R处理后N2a细胞中miR-29b激动剂和抑制剂对细胞存活及LDH漏出率的影响

 

注：与空白对照组相比，**P＜0.01；与OGD/R空白对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；对照组无任何处理，表示为100%值①RT-qPCR检测miR-29b水平；②MTT法检测细胞活力；③LDH漏出率检测

2.3 miR-29b对N2a细胞凋亡的影响

全风化片麻岩物理参数描述统计如表4所示。土样土粒比重、各类密度值都较为稳定。土样的测定孔隙比介于0.471～0.953，平均为0.67；孔隙度介于32%～48.8%，平均为39.5%，孔隙比与孔隙度均大于位于其上部的石英砂岩风化残积土。孔隙度标准差与极差偏大，也反应土层中孔隙分布具有非均性。天然含水量介于9.8%～30.2%，饱和度介于55.7%～100%，表明原状土样不完全处于饱和状态。

2.4 miR-29b对N2a细胞凋亡相关信号转导的影响

采用SPSS 18.0软件包对所有统计数据进行比较和分析。所有3个独立实验数值均表示为均数±标准差（x±s），各组间差异先用单因素方差分析检验，后用最小显著性差异检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

  

图3 miR-29b激动剂和抑制剂对OGD/R诱导N2a细胞凋亡的影响

 

注： 与空白非转染组相比，**P＜0.01；与 OGD/R 非转染组相比，#P＜0.05，##P＜0.01①N2a细胞用miR-29b激动剂或抑制剂先预转染，后经ODG（4 h）/R（12 h）处理，Hoechst 33258荧光染色观察凋亡细胞形态学特征；②N2a细胞用miR-29b激动剂或抑制剂先预转染，后经ODG（4 h）/R（12 h）处理的 caspase-3 活性检测结果

2.5 野生型p53特异性质粒DNA对p53过表达的影响

  

图4 miR-29b激动剂和抑制剂对N2a细胞凋亡相关蛋白的影响

 

注： 与空白非转染组相比，*P＜0.05；与 OGD/R 非转染组相比，#P＜0.05，##P＜0.01①免疫印迹检测N2a细胞凋亡相关蛋白表达；②miR-29b激动剂或抑制剂预转染N2a细胞，ODG（4 h）/R（12 h）处理，GAPDH作为载体对照的Bax蛋白定量分析；③Bcl-2蛋白定量分析；④p53蛋白定量分析

低温下用放射免疫沉淀测定（RIPA）裂解缓冲液（海门生物技术公司）提取蛋白30 min后，用二辛可酸（BCA）试剂盒检测蛋白浓度；12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，美国Sigma-Aldrich公司）法分离等量蛋白样品（30～50 μg蛋白/泳道）并转移至硝酸纤维素（NC）滤膜（美国Pall Corporation公司），室温下用5%脱脂奶粉阻断2 h后，NC膜同主要抗体（Bax以1∶1 000稀释，Bcl-2以1∶500稀释）培育一夜；含0.1%吐温Tris缓冲0.9%NaCl溶液（TBST）清洗 3次，HRP标记的羊抗兔（3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH，1∶5 000稀释）培育1 h；化学发光试剂（美国Pierce生物技术公司）检测标记的蛋白条带，用Quantity One灰度分析软件（美国Bio-Rad Laboratories公司）进行图像分析。免疫印迹分析反复进行3次。

3 讨论

脑缺血性损伤由细胞兴奋性毒性、线粒体功能障碍、氧化应激和炎性反应等不同途径介导，具有复杂的相互作用机制，目前临床上用于脑缺血治疗的药物和治疗靶点的生物标志物均不够理想。本研究发现OGD/R诱导的N2a细胞缺血模型在R期间miR-29b水平下调，最重要的是通过负调控p53相关细胞凋亡，miR-29b可诱导神经细胞保护作用，发挥抗细胞凋亡作用。

许多高校微课教学资源主要来源于高校微课大赛作品，制作门槛低。许多作品只追求形式而忽略微课的实质。许多教师或学生只是一味地追求参赛名次，对知识体系没有充分的掌握，在制作微课时抱着“照葫芦画瓢”的心态，导致许多微课徒有其表。这样的微课不仅形式单一，更易使学生在学习时产生厌倦心理，认为知识点模糊不清，缺乏系统性。

  

图5 wt-p53基因编码质粒DNA对细胞活性和LDH漏出率的影响

 

注：与空白非转染组相比，**P＜0.01；与OGD/R非转染组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与miR-29b激动剂和OGD/R联合处理组相比，$P＜0.05①免疫印迹分析p53蛋白表达，GAPDH作为载体对照；②MTT法检测细胞存活率；③LDH漏出率检测

很多实验证实，miR在脑缺血损伤反应中起着重要作用［12，25］。近期研究也确定miR在脑细胞缺血损伤中的作用，miR-29家族在评估损伤和确定脑卒中预后中扮演重要介质作用［26］。Khanna 等［24］研究发现miR-29b水平在大脑中动脉闭塞所致缺血性卒中梗死组织中明显降低。本研究数据也提示OGD/R处理后N2a细胞中miR-29b水平显著降低。miR-29研究目前主要集中在其对细胞凋亡信号通路的调控作用，miR-29b是促凋亡还是抗凋亡尚存争议［20］。脑缺血损伤中，局灶性脑缺血通过提高Bcl2L2（BCL-w蛋白，一种抗凋亡的Bcl-2蛋白家族成员）水平［27］造成miR-29水平下调，促进神经细胞凋亡；但在神经细胞成熟过程［22］中就前脑和局灶性脑缺血［21，24］而言，miR-29 水平上调可发挥抗凋亡作用，保护神经细胞。因此，脑缺血损伤中miR-29b表达及功能有待确定。本研究发现在N2a细胞中，通过miR-29b激动剂造成miR-29b水平有效上调，能明显增加神经细胞活力并减少LDH漏出率，说明miR-29上调可保护神经细胞，对抗OGD/R诱导的细胞毒性。众所周知，由Bcl-2（抗凋亡蛋白）、Bax（促凋亡蛋白）等组成的Bcl-2蛋白家族是一种通过调节线粒体膜完整性、功能和凋亡信号，针对细胞凋亡的主要调节因子。有研究报道Bcl-2蛋白成员过度表达能对体内和体外脑缺血损伤模型产生神经保护作用［28］。本研究还发现OGD/R处理后能显著降低caspase-3活性和Bcl-2表达，增加Bax蛋白表达，但miR-29b激动剂可阻断这些细胞水平调节和变化，miR-29b抑制剂则加剧上述反应；miR-29b可通过调节Bcl-2家族发挥对脑缺血损伤的保护作用。

2015年2月，习近平总书记在陕西考察时指出，“发展红色旅游要把准方向，核心是进行红色教育、传承红色基因”。江桥抗战历史文化资源是黑龙江省红色旅游的宝贵财富，合理发展好江桥抗战文化，对增强民族文化自信，精选爱国主义示范教育意义重大，而且围绕江桥文化发展红色旅游更能带动地方经济，促进区域协调可持续发展。

p53蛋白是细胞周期阻滞、细胞凋亡、DNA修复和遗传稳定性等一系列细胞应激反应的主要协调者。一些研究表明p53参与了脑卒中和神经退行性疾病造成的神经元细胞死亡［29-30］。有研究显示，从急性脑损伤如脑缺血、癫痫及慢性神经变性疾病患者提取的脑组织样本中，p53表达显著升高。本研究显示N2a细胞经OGD/R处理后，p53表达显著增加，与上述报道结果一致。一些研究揭示了一种由p53介导独立转录时促凋亡的新机制［31］，p53通过与Bcl-2家族多结构域成员相互作用直接参与内源性凋亡途径，维持线粒体功能［32］。研究表明，某些神经元损伤可经p53、Bax、细胞色素c释放，线粒体功能障碍和caspase激活等常见信号转导通路发生；线粒体释放促凋亡蛋白前，p53信号转导便可引起缺血神经细胞凋亡［33］，而导致p53信号转导和神经元死亡的上游事件尚不清楚。本研究发现，OGD/R条件下p53水平上调伴随Bax水平上调和Bcl-2水平下调，wt-p53质粒DNA转染可提高p53水平，与miR-29b激动剂和OGD/R联合处理组相比，明显降低N2a细胞活力并增加LDH漏出率。可见，经OGD/R诱导的N2a细胞损伤中miR-29b对p53介导的细胞凋亡有保护作用。

总之，miR-29b水平在OGD/R模拟的脑缺血损伤模型中下调。miR-29b激动剂可减轻OGD/R诱导的细胞毒性和细胞凋亡，miR-29b抑制剂则加重OGD/R诱导的细胞毒性和细胞凋亡，表明miR-29b在N2a细胞OGD/R损伤起保护作用。此外，经OGD/R处理增加p53蛋白表达，可阻断miR-29b对OGD/R损伤的有益作用，故p53在miR-29b抑制OGD/R诱导N2a细胞凋亡中发挥了中介介导作用。miR-29b可调控p53途径介导的体外脑缺血性损伤模型神经细胞凋亡，将来可能为缺血性脑卒中提供一潜在治疗靶点。

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