金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA)是一种人畜共患病原菌，是革兰阳性菌的代表菌株。SA可分泌多种毒力因子，严重者可造成败血症、骨髓炎等[1]。耐甲氧西林SA的逐渐增多以及耐万古霉素SA的出现，给临床治疗带来极大挑战，亟需寻找新型抗SA药物。芦荟是一种常见的中草药，其提取物能抑制伤口愈合中可能产生的微生物感染。芦荟粗提物对大肠埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、铜绿假单胞菌的生长均有抑制作用，其中芦荟大黄素、芦荟酊以及芦荟苷是主要活性成分[2]。芦荟苷具备消炎杀菌、抗肿瘤、祛除疤痕等作用。本研究探讨芦荟苷在体外对SA的生长抑制作用及对菌株溶血素表达的影响。

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1 材料与方法

1.1 菌株来源 金黄色葡萄球菌ATCC 25923由江苏大学医学院检验医学研究所保存；金黄色葡萄球菌临床菌株编号SA1.5分离自江苏大学附属医院临床分泌物样本，并经Vitek 32全自动细菌鉴定仪鉴定，经K-B纸片扩散法进行药敏分析，对庆大霉素、克林霉素、四环素、利奈唑胺敏感，对红霉素、青霉素、复方磺胺甲噁唑耐药。

躁狂是情感障碍疾病中较为常见的一种,该病的临床主要表现为思维奔逸、情感高涨和意志行为增强。利培酮是治疗精神性疾病的一种非典型性药物,其可作为一种受体阻断剂作用于多种脑神经传递质,遵循躁狂症的发病机理原则治疗躁狂症。利培酮具有依从性较好、服用方便、起效快等特点。

1.2 主要试剂与仪器 纯度为90.13%的芦荟苷(西安汇林生物科技公司)；胰蛋白胨、酵母提取物(Oxoid公司)；M-H平板(河南美凯生物科技公司)；庆大霉素(杭州滨和微生物试剂公司)；Trizol试剂(北京全式金生物公司)；逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒(诺唯赞生物科技公司)；脱纤维兔血(南京茂捷微生物公司)；引物由上海桑尼生物公司合成。

1.6 凝固酶效价测定 将ATCC 25923培养至A600 nm=0.3，将菌液分成4份，每份10 mL，加入配制好的芦荟苷溶液，使药物终浓度分别为0 mg/mL、1/2MIC、MIC和2MIC，37 ℃ 200 r/min继续培养至A600 nm=2.5，收集全部菌液，10 000×g离心10 min,收集上清，用无菌LB肉汤分别将上清1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32倍比稀释，分别取100 μL于EP管中；用PBS将新鲜人血浆4倍稀释，取500 μL稀释人血浆于上述EP 管内，混匀置37 ℃ 6 h，观察凝集效价。具体方法参照文献[6]，以产生凝集的最高稀释倍数作为凝固酶效价。实验重复3次。

任务型教学法是基于完成交际任务的一种语言教学方法，它通过师生共同完成语言教学任务，使外语学习者自然习得语言，促进外语学习的进步。基于这些理念，在大学英语零班的教学实践活动中，笔者对大学英语零班的教学活动进行了重新的设计，采用任务型教学方法，在教学中以布置任务为主，引导学生完成任务，主动构建语言知识，以期充分发挥学生的主动性。英语零班中的任务形式设计主要有如下几种：

1.5 时间-抑菌曲线测定 参照文献[5]进行，将ATCC 25923菌液浓度调整为105 CFU/mL，取菌液1 mL，分别加入不同浓度的芦荟苷溶液9 mL，使终浓度达到MIC、2MIC和4MIC，37 ℃培养2、4、6、8、10、12 h时将试验管中液体充分混合后取等量样，用平板法计数其活菌数，以不加任何药物的菌液作为对照组。重复3次取均值，绘制时间-抑菌曲线。

第一，进一步明确了“值百抽五”的关税税负标准。《中英通商章程善后条约》第一款规定：“……倘有货物名目，进、出口税则均未赅载，又不在免税之列者，应核估时价，照值百抽五例征税。”即税则上没有列举的商品，都按5%的从价关税税率。

1.3 芦荟苷水溶液的制备 称取0.56 g芦荟苷粉末加入56 ℃ 10 mL的蒸馏水中，振荡混匀，使其充分溶解，配制浓度为50 mg/mL的芦荟苷水溶液。

1.9 统计学分析 采用Graphpad Prism 7.0及SPSS 17.0统计软件进行。对数据进行正态性和方差齐性分析，符合正态分布数据采用均值±标准差表示；不符合正态分布的数据以中位数(四分位数)[M(P25，P75)] 表示，多组比较采用Kruskal-Wallis H检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2.2 芦荟苷对SA的时间-抑菌曲线 见图1。对照组呈现正常的生长趋势；3个芦荟苷实验组MIC组、2MIC组、4 MIC组均可抑制SA生长，并随芦荟苷药物浓度的增大，对SA的抑制作用增强。

 

表1 荧光定量PCR引物

  

基因引物序列(5'→3')产物长度(bp)16SrRNAF:ACTGGGATAACTTCGGGAAA147R:CGTTGCCTTGGTAAGCChlaF:TTGGTGCAAATGTTTC102R:TCACTTTCCAGCCTACTagrAF:AAAACGTGGCAGTAATTCAGTG-TA98R:GGTTATCTAAATGGGCAAT-GAGTC

1.7 α-溶血素活力测定 将ATCC 25923培养至A600 nm=0.3，将菌液分成4份，每份10 mL，加入芦荟苷溶液使得药物终浓度为0 mg/mL、1/2MIC、MIC和2MIC，37 ℃ 200 r/min继续培养至对数生长后期，将菌液离心，收集上清。参照文献[7]中的方法，取100 μL上清加875 μL灭菌PBS，加25 μL脱纤维兔血，混匀，阴性对照为975 μL PBS及25 μL脱纤维兔红细胞，阳性对照为975 μL ddH2O和25 μL脱纤维兔红细胞。37 ℃水浴30 min，5 500×g 1 min后取上清，在543 nm处测吸光度。以药物浓度为0 mg/mL组的上清溶血程度作为100%溶血，计算加入药物后的菌液上清的溶血率，溶血率(%)=A实验组/A阳性对照组×100。实验重复3次。

对于矿工而言，如果不存在奖励（贿赂）的情况下，是否添加攻击者进行的交易获得的奖励是相同的，因此攻击者在步骤3只需要较少奖励即可诱使矿工在主链中不加入这笔交易。攻击者在整个攻击过程中，只需要贿赂金额小于商品金额即可攻击成功。

1.4 芦荟苷抑菌效果测定 (1)打孔法检测抑菌圈直径：取100 μL浓度为0.5麦氏浊度单位SA菌悬液均匀涂布M-H平板，在每个平板上打3个孔径为7 mm的孔，分别加入50 μL浓度为50 mg/mL的芦荟苷原液、灭菌生理盐水和1 280 μg/mL的庆大霉素药液，平行接种3个平板，37 ℃ 24 h[3]，测定各抑菌圈直径。(2)肉汤倍比稀释法测定最低抑菌浓度(MIC)：用LB肉汤调配0.5麦氏浊度单位SA菌悬液，并用LB肉汤1∶100稀释后备用。用倍比稀释法获得不同药物浓度，使每管芦荟苷的终浓度为25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.25 mg/mL、3.125 mg/mL、1.562 mg/mL、0.781 mg/mL、0.391 mg/mL、0.196 mg/mL，每个浓度重复2孔。再分别加入上述制备好的SA菌液1 mL，使每管菌液终浓度为5×105 CFU/mL，37 ℃培养24 h，并参照临床和实验室标准化协会(CLSI)的标准方法[4]，观察MIC结果。实验重复3次。

2 结果

2.1 芦荟苷水溶物的抑菌效果及MIC 芦荟苷对受试SA均有抑制作用，其中对ATCC 25923和SA1.5抑菌环直径分别为(21.50±1.29) mm和(17.00±0.91) mm；对ATCC 25923和临床菌株SA1.5的MIC分别为12.5 mg/mL和15 mg/mL。

1.8 芦荟苷对hla、agrA基因表达的影响 参照文献[8]合成hla、agrA基因扩增的引物，同时以16S rRNA作为内参，见表1。挑取单个SA 菌落于液体LB管中，37 ℃ 200 r/min过夜培养，取上述0.4 mL至40 mL LB培养基，37 ℃ 200 r/min培养至A600 nm =0.3，将菌液等分为4组，分别加入不同浓度芦荟苷水溶物(终浓度分别为1/2MIC、MIC、2MIC)以及不加药对照，继续培养至对数生长后期(A600 nm=2.5)，10 000×g 10 min，收集全部菌泥。采用Trizol-氯仿法提取RNA。逆转录体系：5×qRT superMix 2 μL，模板RNA 500 ng，ddH2O补足至10 μL。反应条件：25 ℃ 10 min，50 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。逆转录产物于-20 ℃保存。Real-time PCR检测体系10 μL：2×SYBR Mix 5 μL，DYE1 0.2 μL，ddH2O 2.8 μL，上、下游引物各0.5 μL(agrA上、下游引物浓度分别为0.706 nmol/μL和0.732 nmol/μL；hla上、下游引物浓度分别为1.182 nmol/μL和0.732 nmol/μL；内参上、下游引物浓度分别为0.85 nmol/μL和1.178 nmol/μL)，cDNA模板1 μL。反应条件：95 ℃ 10 min，退火1 min(agrA退火60 ℃，hla退火51.5 ℃)，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。每组设3个复孔，agrA、hla和内参基因扩增产物的熔解温度分别为(74.8±0.3)℃、(75.2±0.3)℃、(80.8±0.4)℃。PCR后温度从60 ℃缓慢递增到95 ℃，连续测定荧光强度,以获取熔解曲线来确定产物是否为目的产物。用 2-△△Ct来表示目的基因的相对表达水平。其中 ΔΔCt=ΔCt芦荟苷处理组-ΔCt对照组；ΔCt=目的基因的平均Ct值-内参基因的平均Ct值。

 

图1 不同浓度芦荟苷对金黄色葡萄球菌ATCC 25923时间-抑菌曲线

2.3 芦荟苷对凝固酶效价的影响 对照组凝固酶效价为32，1/2MIC组为16，MIC组为4，2MIC组为2。

2.4 芦荟苷对α-溶血素活力的影响 标准菌株ATCC 25923在不同浓度芦荟苷的作用下，溶血活力均受抑制，呈浓度依赖性。1/2MIC组、MIC组及2MIC组溶血率分别为(77.4±3.4)%、(42.2±2.4)%和(38.7±2.4)%。

2.5 芦荟苷对金黄色葡萄球菌hla、agrA表达的影响 1/2MIC组、MIC组及2MIC组hla表达量分别为0.020 3(0.019 6，0.028 8)、0.011 6(0.010 6，0.013 1)和0.033 7(0.020 2，0.042 9)，差异有统计学意义(H=16.807，P<0.05)；agrA表达量分别为0.074 6(0.066 2，0.098 2)、0.020 8(0.012 2，0.032 6)和0.021 3(0.010 2，0.029 6)，差异有统计学意义(H=16.320，P<0.05)，随着药物浓度的增加基因的表达未呈现明显的浓度依赖性。

3 讨论

本研究表明芦荟苷能够抑制SA ATCC 25923的生长，但由于芦荟苷易受温度、pH等的影响,在使用时注意避免高温、高pH，尽量做到现用现配，以免加剧芦荟苷降解[9]。芦荟苷作用后SA的凝固酶分泌受到明显抑制，说明芦荟苷能够减少细菌凝集因子的产生，从而能够进一步抑制SA的毒力；同时随着芦荟苷浓度的增加α-溶血素的产生相应减少，表明芦荟苷能够减少α-溶血素的产生，从而降低对机体的损伤。本实验中所用的芦荟苷纯度为90.13%，除有效成分芦荟苷外还含有少量的灰分和大黄酚葡萄糖苷，此类单糖苷具有微量的致泻作用，对于杀菌抑菌作用暂无明确的报道。

参与金黄色葡萄球菌毒力因子表达的系统有16个二元调控系统以及Sara蛋白家族。而Agr是目前研究的比较清楚的一个二元调控系统，agr基因包含两个转座子RNAⅡ、RNAⅢ，分别由2个核心启动子 P2 和 P3 启动，P2 启动转录的 RNAⅡ可编码AgrA、AgrB、AgrC 和 AgrD 4组蛋白，而P3启动转录的 RNAⅢ参与多种毒力因子的转录和表达。Lyon等[10]研究报道通过抑制agr二元调控系统的活化可抑制金葡菌的致病力。本研究通过荧光定量PCR检测芦荟苷对SA的hla、agrA基因表达量的影响，发现hla和agrA的表达变化不呈药物浓度依赖性，说明芦荟苷降低α-溶血素的表达不仅仅作用于agr调控系统，可能受到其他调控系统的调控，其具体的表达机制还有待进一步研究。

4 参考文献

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[2]贝宇飞, 何苗, 殷晓芹, 等. 不同品种芦荟的蒽甙的抑菌作用研究[J]. 湖南师范大学学报(医学版), 2017, 14(6): 39-42. DOI:10.3969/j.issn.1673-016X.2017.06.011.

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