原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis，PBC)是临床常见的一种自身免疫性肝病，该病以慢性非化脓性胆管炎伴自身反应性T细胞介导的肝内小胆管炎性损伤为病变特征[1]。CD39和CD73是嘌呤能信号体系的核心分子，通过调节三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的代谢参与多种疾病炎性损伤过程[2]。人类的CD39/CD73分子主要表达在全身多种器官的上皮细胞和各种免疫功能细胞的表面。其中，CD39在Foxp3+调节性T细胞(Treg)表面表达较高，且具有降解ATP、抑制树突状细胞成熟的调节功能，因此被认为是Treg细胞的标记分子之一[3]。我们前期研究已经发现PBC患者外周血Foxp3+Treg比例明显降低[4]，但是其在PBC中的确切机制仍不清楚，而不同表型Treg在PBC中的表达和作用机制可能有所不同。CD39和CD73作为Treg的重要表型，在PBC中的表达情况及其作用机制目前尚不明确。本研究通过流式细胞术、高效液相色谱串联质谱等分析技术，对CD39+/CD73+Treg及其介导的腺苷代谢通路在PBC发病机制中的作用进行深入探讨，以期进一步阐明PBC患者炎性损伤的相关机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2016年10月至2017年10月至太仓市第一人民医院和常熟市第二人民医院初次就诊未接受药物治疗的PBC患者49例，男10例，女39例，年龄(60.6±10.9)岁；体检健康者(health controls, HCs)36例，男8例，女28例，年龄(58.8±11.2)岁。两组间年龄、性别比差异无统计学意义。PBC诊断标准参照美国肝脏病协会2009年诊断标准[5]，符合以下3项中的2项可诊断为PBC：(1)有胆汁淤积相关的生化指标显著升高，以碱性磷酸酶(ALP)为主；(2)抗线粒体抗体阳性；(3)病理活检发现汇管区炎性浸润或肝内小胆管破坏。排除各类自身免疫性肝炎及其重叠综合症、病毒性肝炎、药物性肝炎、脂肪肝、肝硬化、肝癌等肝脏疾病。

1.2 主要试剂和仪器 丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)试剂盒及复合校准品(日本世诺临床诊断品株式会社)，ALP试剂盒及复合校准品(北京九强生物技术有限公司)，凝血酶原时间试剂盒及校准品(日本积水医疗株式会社)。淋巴细胞分离液(美国GE公司)，小鼠抗人单克隆抗体CD4-FITC(513414、555346)、CD25-APC(555434)、CD39-percp-cy5.5(564899)、CD73-percp-cy5.5(561260)(美国BD Biosciences公司)，大鼠抗人单克隆抗体Foxp3-PE(12-4776)、Foxp3固定膜剂/破膜剂(4311034)、固定膜剂/破膜剂稀释液(4307648)、穿膜缓冲液(4307693)(美国eBioscience公司)，甲醇、HPLC级乙酸铵(德国默克公司)，Agilent SB-C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm，美国Agilent公司)。FACS Calibur流式细胞仪(美国BD公司)，液相色谱仪(Waters Acquity IUPLC)、质谱仪(Waters Xevo TQ-S)(美国沃特世公司)，全自动生化免疫流水线(德国西门子公司)。

1.3 标本采集 在患者清晨空腹状态，用无抗凝剂采血管(5 mL，阳普公司)采集静脉血，3 000 r/min(离心半径20 cm)离心10 min分离血清，4 h内以全自动生化分析仪检测ALT、AST、GGT和ALP的水平；EDTA-K2抗凝管(2 mL，阳普公司)采集外周血用于流式细胞术分析。

1.4 生化指标检测 用速率法检测ALT、AST和GGT，NPP底物-AMP缓冲液法检测ALP，按照试剂盒说明书进行操作。

患儿治疗前后的睡眠打鼾评分和症状评分对比有统计学意义,P<0.05,见表1;对术后发生憋气和打鼾的患儿进行分析,发现影响手术治疗效果的因素主要有肥胖(5例)、变应性鼻炎(4例)、慢性扁桃体发炎复发(3例)、鼻咽粘连(3例)。

2.3 Treg细胞中CD39+和CD73+Treg表达情况 以CD4+CD25+Foxp3+T细胞作为Treg，CD4+CD25+CD39+Foxp3+T细胞作为CD39+Treg细胞，CD4+CD25+CD73+Foxp3+T细胞作为CD73+Treg。结果发现，PBC组和对照组CD39+Treg占Treg细胞比例分别为(23.75±9.48)%和(54.68±5.18)%，与对照组比较，PBC组结果显著降低，差异有统计学意义(t=13.79，P<0.01)。见图2。而PBC组和对照组CD73+Treg表达水平分别为(28.18±10.52)%和(30.56±8.59)%，两组间差异无统计学意义(t=1.083，P=0.282)。

2.1 患者资料 PBC患者和健康对照者血清肝功能指标ALT、AST、GGT、ALP水平和Mayo评分见表1。PBC组ALT、AST、GGT、ALP水平较对照组均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

自由作为马克思哲学与实践直接相关的核心范畴之一，同样成为学界研究的重要领域。目前的研究主要展开于以下两个方面：

1.5 Mayo评分 PBC患者Mayo评分标准按以下公式进行：R=0.871×loge[0.058×胆红素(μmol/L)]-2.53×loge[0.1×清蛋白(g/L)]+0.039×年龄+2.38×loge[凝血酶原时间(s)]+0.859×水肿积分[6]。水肿积分：无水肿计0分；水肿可控制计0.5分；水肿难控制计1分。

2 结果

1.7 色谱和质谱分析 用高效液相色谱串联质谱技术分析血清ATP水平，检测下限为10 ng/L。以Agilent SB-C18色谱柱进行分离，流动相A为2%甲醇溶液，流动相B为10 mmol/L乙酸铵，梯度洗脱12 min；流速为0.6 mL/min，色谱评价均在室温。质谱条件：毛细管电压3 000 V，离子源温度150 ℃，脱溶剂温度350 ℃，脱溶剂气流量650 L/h，锥孔气流量150 L/h。

1.8 统计学分析 用SPSS 17.0软件进行。对所有数据进行正态分布检验和方差齐性检验，正态分布资料以±s表示，非正态分布资料以中位数(四分位数)[M(P25，P75)]表示，满足正态分布和方差齐性的资料用Student′s t检验，不满足上述条件的资料用Mann-Whitney U秩和检验，率的比较用卡方检验，相关性分析用Pearson分析法。以P<0.05为差异有统计学意义。

 

表1 PBC和对照组患者实验室检查结果

  

对照组(n=36)PBC组(n=49)ZPAST(U/L)18.0(16.0,23.0)50.0(32.0,105.0)6.988<0.01ALT(U/L)15.0(12.0,22.0)59.0(26.5,118.5)6.363<0.01GGT(U/L)16.0(13.0,28.0)116.0(53.0,316.5)6.875<0.01ALP(U/L)45.2(31.2,82.4)176.0(129.5,305.5)5.914<0.01Mayo评分-5.1±1.2--

由于磁盘和非易失存储器（Non-Volatile Memory，NVM）的存储介质不同，数据存储在不同介质上的性能差异较大，所以针对此问题我们设计了相应的数据部署方案。假设所有的数据原本均存储在磁盘中，设定初始数据块的标签表示Label=N，并且以读写、冷热和生存周期标签为迁移标准。

  

图1 PBC组和对照组CD4+CD39+T细胞的流式细胞术分析

1.6 流式细胞术分析CD39+/CD73+Treg的表达情况 用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，以PBS洗涤重悬。取2支试管加入100 μL上述细胞，其中一管加入抗CD4-FITC、CD25-APC和CD39-percp-cy5.5抗体，另一管加入抗CD4-FITC、CD25-APC和CD73-percp-cy5.5抗体，混匀，室温避光反应15 min，然后加入2 mL PBS洗涤，1 500 r/min(离心半径20 cm)离心5 min弃上清。加入1 mL固定剂/破膜剂混合液与稀释液体积比为1∶3的混合液，混匀，4 ℃避光反应60 min，再加入1 mL穿膜缓冲液洗涤，1 500 r/min(离心半径20 cm)离心5 min，弃上清。用回流液混匀细胞，向2支试管分别加入抗Foxp3-PE抗体，混匀，避光反应30 min。洗涤2次后加入约500 μL PBS，混匀，待上机检测。设门条件：根据FSC和SSC圈出来淋巴细胞，然后根据CD4+CD25+Foxp3+圈出Treg细胞，并进一步分析CD39和CD73表达。

基于城市网络视角的“复杂网络中心度测算模型”，对2017年国际重要体育赛事主办城市网络进行了分析，结果显示，上海的网络中心度和中介度总体排名在全球21位，与伦敦、纽约、墨尔本等顶级主办城市相距较大，说明上海与全球体育“资源配置中心”及“连接桥梁”的地位还有较大距离，要建设成为世界一流的体育赛事之都还任重道远。本文基于城市网络的视角，认为上海提升主办城市竞争优势应该从战略和策略两个层面制定长远计划。

2.2 CD4+T细胞表面CD39和CD73表达情况 PBC组和对照组CD4+CD39+T细胞在CD4+T细胞中的占比分别为(5.28±1.92)%和(11.01±3.19)%，CD4+CD73+T细胞在CD4+T细胞中的占比分别为(4.80±1.49)%和(4.12±1.63)%。与对照组比较，PBC组CD4+CD39+T细胞在CD4+T细胞中的占比显著降低，差异有统计学意义(t=10.25，P<0.01)，见图1。而两组间CD4+CD73+T细胞在CD4+T细胞中的占比差异无统计学意义(t=2.235，P=0.078)。

  

图2 对照组和PBC组CD39+Treg的表达情况

2.4 血清ATP水平 高效液相色谱串联质谱技术分析两组血清ATP水平结果见图3。PBC组和对照组血清ATP分别为(200.28±79.41)μg/L和(89.20±33.76)μg/L，差异有统计学意义(t=8.367, P<0.01)。

农业机械化是提高农业生产效率的重要措施。受制于科技技术和地区经济条件，部分地区农业机械化推进速度缓慢。平原地区拥有发展大规模机械化农业的自然资源和社会资源，农业机械化发展水平较高。万州区是丘陵地形，受地理、水文条件限制，不适合发展大规模机械化农业。此外，受到经济水平、社会制度、政府政策等因素的限制，万州区很难实现发达地区那种普遍的大规模机械化生产。

 

注：A，标准品1.84 min流出样品为ATP；B，PBC患者血清标本1.84 min检测到ATP。

图3 血清ATP检测结果

2.5 相关性分析 Pearson相关分析结果表明：PBC组CD39+Treg占Treg比例与ATP、GGT和Mayo评分水平的相关性有统计学意义，r值分别为-0.413、-0.378和-0.382，P值分别为0.003、0.007和0.007，与ALT、AST、ALP相关性无统计学意义(P>0.05)；CD73+Treg占Treg比例与各项指标之间相关性均无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

近年来，多项研究发现Treg可以通过产生腺苷发挥免疫抑制作用。而且小鼠的Foxp3+CD25highTreg表达CD39和CD73分子[7]，这2个分子是介导细胞外ATP/嘌呤核苷酸二磷酸腺苷(ADP)和嘌呤核苷酸单磷酸腺苷(AMP)向腺苷代谢的重要分子。腺苷及其受体A2AR在降低炎症反应和特异性下调T细胞免疫应答方面具有重要作用[8]。研究已经证实，人体Foxp3+CD25highTreg细胞也表达CD39，而且在多发性硬化病中，CD25highCD39+Treg的降低与病情的相关性比CD25+Treg高[5]。我们通过流式细胞术分析发现PBC组CD4+CD39+T细胞和CD4+CD25+Foxp3+Treg中CD39+Treg较对照组均明显降低，而CD4+CD73+T细胞和CD73+Treg差异无统计学意义。该结果提示CD39分子可能在介导PBC患者炎症反应阶段具有重要作用。Wang等[9]对于过敏性哮喘患者研究发现CD4+CD39+和CD4+CD73+T细胞较对照组均显著降低，提示CD39和CD73分子可能在过敏性哮喘疾病进展过程中发挥重要作用。这说明CD39和CD73分子在不同疾病的患者外周血CD4+T细胞中的表达量并不一致，因此所发挥的作用也可能有一定差异。

本研究对CD39+/CD73+Treg细胞进行分析发现，PBC患者CD39+Treg显著降低，而对于多发性硬化病的研究已经证实，CD4+CD25highFoxp3+Treg可以被分为CD39+CD4+CD25high和CD39-CD4+CD25high两个亚群，其中CD39+亚群可以抑制TH17细胞的功能，而CD39-亚群不具备这一能力，因此并非真正的Treg细胞[10]。本实验室前期研究已经发现PBC患者血清IL-17的表达显著升高，且IL-17+单个核细胞在肝组织汇管区数量有所增加[11]，由此推断，可能CD39+Treg的降低导致患者免疫系统对TH17细胞的抑制功能减弱，从而导致IL-17介导的肝脏炎性损伤加剧。CD39是一种2,3磷酸核苷酸水解酶，以钙、镁离子依赖的方式将胞外的ATP和ADP水解为AMP，而CD73则是一种5′-核苷酸水解酶，具有磷酸酶活性，可将经CD39水解产生的AMP进一步水解为腺苷，而最终生成的腺苷可以与多种免疫效应细胞表面的腺苷1型嘌呤-G蛋白偶联受体结合发挥免疫抑制作用[12]。炎性反应介导的ATP释放是中性粒细胞活化和免疫防御机制激活的根本机制。在ATP-CD39-CD73-腺苷这个酶促级联反应过程中，CD39作为限速酶发挥至关重要的作用[13]。通过高效液相色谱串联质谱技术分析患者和对照组血清ATP水平，我们发现PBC患者ATP水平有明显升高，而且与CD39+Treg水平呈正相关关系，而CD73+Treg未发生显著改变。以上结果提示腺苷代谢通路中CD39分子的低表达导致腺苷代谢通路受阻，ATP上升，引起PBC患者炎性反应加剧，进而可导致肝内小胆管上皮细胞损伤和凋亡，并引起ALP升高，出现胆汁淤积症状。本研究的不足之处在于未对单核细胞中的CD39和CD73表达情况进行分析，因此不能肯定单核细胞表达的腺苷代谢分子未参与促进ATP水平的升高和PBC病程进展，这部分工作将在后续研究中进一步完善。

4 参考文献

[1]李勇, 王金湖, 张悦梅，等. 抗线粒体抗体在原发性胆汁性肝硬化筛查中的作用[J]. 临床检验杂志, 2016, 34(1): 73-75.

[2]Paletta-Silva R，Meyer-Fernandes JR. Adenosine and immune imbalance in visceral leishmaniasis: the possible role of ectonucleotidases[J]. J Trop Med, 2012, 2012: p. 650874.

[3]Borsellino G, Kleinewietfeld M, Di Mitri D, et al. Expression of ectonucleotidase CD39 by Foxp3+ Treg cells: hydrolysis of extracellular ATP and immune suppression[J]. Blood, 2007, 110(4):1225-1232.

[4]G Rong, Y Zhou, Y Xiong, et al. Imbalance between T helper type 17 and T regulatory cells in patients with primary biliary cirrhosis: the serum cytokine profile and peripheral cell population[J]. Clin Exp Immunol, 2009, 156(2): 217-225.

[5]Lindor KD, Gershwin ME, Poupon R, et al.Primary biliary cirrhosis[J]. Hepatology, 2009, 50(1):291-308.

[6]Forman LM, Lucey MR. Predicting the prognosis of chronic liver disease: an evolution from child to MELD. Mayo End-stage Liver Disease[J]. Hepatology, 2001, 33(2):473-475.

[7]Roberts V, Lu B, Chia J, et al. CD39 overexpression does not attenuate renal fibrosis in the unilateral ureteric obstructive model of chronic kidney disease[J].Purinergic Signal, 2016, 12(4):653-660.

[8]Bowser JL, Phan LH, Eltzschig HK. The hypoxia-adenosine link during intestinal inflammation[J]. J Immunol, 2018, 200(3):897-907.

[9]Wang LL, Tang HP, Shi GC, et al. CD39/CD73 and the imbalance of Th17 cells and regulatory T cells in allergic asthma[J]. Mol Med Rep, 2013, 8(5):1432-1438.

[10]Fletcher JM, Lonergan R, Costelloe L, et al. CD39+Foxp3+ regulatory T cells suppress pathogenic Th17 cells and are impaired in multiple sclerosis[J]. J Immunol, 2009,183(11):7602-7610.

[11]Qian C, Jiang T, Zhang W, et al. Increased IL-23 and IL-17 expression by peripheral blood cells of patients with primary biliary cirrhosis[J]. Cytokine, 2013, 64(1):172-180.

[12]Vijayan D, Young A, Teng MWL,et al. Targeting immunosuppressive adenosine in cancer[J].Nat Rev Cancer, 2017, 17(12):709-724.

[13]Schetinger MR, Morsch VM, Bonan CD, et al. NTPDase and 5′-nucleotidase activities in physiological and disease conditions: new perspectives for human health[J]. Biofactors, 2007,31(2):77-98.