耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP)的克隆传播和感染暴发已被大量报道，由于其可选择治疗药物有限，给临床治疗带来极大困难[1]。目前，产碳青霉烯酶是碳青霉烯类耐药主要的耐药机制，其中以产KPC和NDM酶为主。KPC-2酶为CRKP所产的最主要的酶[2]。本研究对我院急诊重症监护病房(ICU)分离的CRKP进行耐药基因和流行病学调查分析，为院感防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株收集 2015年7月至2016年8月徐州医科大学附属医院急诊ICU分离非重复耐碳青霉烯类[亚胺培南或美罗培南最低抑菌浓度(MIC)≥4 mg/L]肺炎克雷伯菌19株。其中5株分离自血液标本，其余为痰液样本。

本研究数据来自中国知网(CNKI)数据库，根据研究主题，选择期刊一栏，期刊来源类别为核心期刊和中文社会科学引文索引(CSSCI)，以“体育彩票”为主题词进行精确检索，时间节点为1994年—2017年(1994年我国体育彩票首次发行)，截至2017年12月6日，共检索到481篇期刊，根据研究主题和作者信息是否健全进行删选，经过仔细删选共得到407篇核心和CSSCI文献，作为研究对象，建立数据库。

1.2 主要仪器及试剂 PCR mix和Gelred核酸染料(南京诺维赞生物科技公司)；分子量标准和限制性内切酶Xba I(大连宝生物公司)；细菌基因组提取试剂盒(北京天根生化科技公司)；琼脂糖(徐州微科曼得生物公司)；Vitek 2 Compact自动化细菌鉴定和药敏仪、E-test条(法国生物梅里埃公司)；autoflex speedTM TOF/TOF基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MS)(德国布鲁克公司)；T100 PCR扩增仪、CHEF Mapper XA脉冲场凝胶电泳仪(美国Bio-Rad公司)；Bioshine Gel X1850凝胶成像系统(上海欧翔公司)；引物(见表1)由上海生工公司合成。质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922和脉冲场凝胶电泳分子量marker H9812均为本实验室保存。

 

表1 PCR扩增引物及退火温度

  

耐药基因引物序列(5'→3')产物长度(bp)退火温度(℃)碳青霉烯类 blaKPCF:ATGTCACTGTATCGCCGTC88259R:TTACTGCCCGTTGACGCC blaSMEF:AACGGCTTCATTTTTGTTTAG83058R:GCTTCCGCAATAGTTTTATCA blaGESF:ATGCGCTTCATTCACGCAC84662R:CTATTTGTCCGTGCTCAGG blaVIMF:GCMCTTCTCGCGGAGATTGA25759R:TGCGCAGCACCRGGATAGA blaIMPF:CTACCGCAGCAGAGTCTTTG58755R:AACCAGTTTTGCCTTACCAT blaNDMF:GAAGCTGAGCACCGCATTAG98258R:GGGCCGTATGAGTGATTGC blaOXA-48F:TTGGTGGCATCGATTATCGG74362R:GAGCACTTCTTTTGTGATGGC超广谱β内酰胺类(ESBLs) blaSHVF:CGCCGGGTTATTCTTATTTGTCGC101760R:TCTTTCCGATGCCGCCGCCAGTCA blaTEMF:ATAAAATTCTTGAAGACGAAA108058R:GACAGTTACCAATGCTTAATCA blaCTX-M1GroupF:CAGCGCTTTTGCCGTCTAAGC94562R:GGCCCATGGTTAAAAAATCACTGC blaCTX-M2GroupF:CTCAGAGCATTCGCCGCTCA84859R:CCGCCGCAGCCAGAATATCC blaCTX-M8GroupF:ACTTCAGCCACACGGATTCA102458R:CGAGTACGTCACGACGACTT blaCTX-M9GroupF:GTTACAGCCCTTCGGCGATGATTC88164R:GCGCATGGTGACAAAGAGAGTGCAA头孢菌素类(AmpC) blaMOXF:GCTGCTCAAGGAGCACAGGAT52059R:CACATTGACATAGGTGTGGTGC blaCITF:TGGCCAGAACTGACAGGCAAA46266R:TTTCTCCTGAACGTGGCTGGC blaDHAF:AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT40562R:CCGTACGCATACTGGCTTTGC blaACCF:AACAGCCTCAGCAGCCGGTTA34662R:TTCGCCGCAATCATCCCTAGC blaEBCF:TCGGTAAAGCCGATGTTGCGG30264R:CTTCCACTGCGGCTGCCAGTT blaFOXF:AACATGGGGTATCAGGGAGATG19062R:CAAAGCGCGTAACCGGATTGG

1.3 菌株鉴定及药敏试验 临床分离菌株经Vitek 2 Compact细菌鉴定仪及配套GN鉴定卡进行生化鉴定，结果经autoflex speedTM TOF/TOF质谱仪复核；用Vitek 2 Compact配套AST-GN16药敏卡进行药敏试验；用E-test法核实碳青霉烯类药物(亚胺培南和美罗培南)的MIC值。药敏结果按照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)2016标准[3]判读。

1.6 多位点序列分型(MLST) PCR扩增肺炎克雷伯菌7个管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB及tonB)，PCR体系同1.4，反应条件参照肺炎克雷伯菌MLST数据库(http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)。扩增产物送苏州金维智公司测序并上传至上述网页比对，获得相应的等位基因型及ST型。

1.5 脉冲场凝胶电泳(PFGE) 参照文献[5]进行。将37 ℃过夜培养菌落调至4.0麦氏浊度单位，与10 g/L SeaKem Gold琼脂糖按1∶1混匀后加入模具以制备胶块；经蛋白酶K消化2 h并经Xba I酶切胶块后进行PFGE，电泳参数：脉冲时间6～36 s，14 ℃，120°夹角，电泳18 h。电泳后经Gelred染色30 min成像。PFGE图谱参照Tenover等[7]标准判定。

1.4 耐药基因检测 用吸附柱法提取细菌基因组DNA，按照试剂盒说明书操作。PCR法扩增碳青霉烯类基因(blaKPC、blaSME、blaGES、blaVIM、blaIMP、blaNDM和blaOXA-48)[4]、超广谱β内酰胺类(blaSHV、blaTEM和blaCTX-M)[5]以及头孢菌素类耐药基因(blaMOX、blaCIT、blaACC、blaFOX、blaDHA和blaEBC)[6]，引物序列见表1。PCR反应体系为50 μL：PCR mix 25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，模板2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，退火(退火温度见表1)1 min, 72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 5 min。阳性PCR产物送苏州金维智公司测序，结果与GenBank数据库进行比对，确定耐药基因亚型。

2.1 药敏结果 19株CRKP菌株均呈现多重耐药表型，除1株对亚胺培南中介、美罗培南耐药外，其余菌株对亚胺培南、美罗培南均耐药；所有菌株对头孢唑啉、头孢西丁、头孢吡肟、头孢曲松、氨曲南、庆大霉素、哌拉西林/他唑巴坦均耐药，对阿米卡星耐药率为21.1%，对替加环素全部敏感。

2.2 耐药基因检测结果 19株CRKP中有17株blaKPC-2阳性，1株blaNDM-5阳性，另1株(K19号)菌株未检测到本文所列碳青霉烯类耐药基因。15株菌株blaCTX-M阳性，其中blaCTX-M-65型10株，blaCTX-M-15型3株, blaCTX-M-14型和blaCTX-M-27型各1株；16株blaSHV阳性菌株中包括8株blaSHV-12型、5株blaSHV-2a型和3株blaSHV-11型；15株blaTEM阳性菌株均为blaTEM-1型。仅检出blaDHA-1型头孢菌素类耐药基因，检出率为68.4%(13/19)。未检出blaGES、blaSME、blaIMP、blaVIM、blaOXA-48、blaMOX、blaCIT、blaACC、blaFOX、blaEBC。见表2。

2 结果

4.2 康复医学学科分野，协同精进 康复医学在满足残疾人的医疗康复需求过程中发挥着重要作用。由于残疾人的康复需求具有动态变化的特点，为满足残疾人不断变化的康复需求，我国康复医学在不断学习国际康复医学先进理论和技术的同时，将加强开发我国特有的中医康复的宝贵资源，突出中国特色的中西医结合的医疗康复服务特色。同时推进康复医学与社会学、心理学、工程学等众多学科合作，协同发展，发挥更大效果。这不仅是康复医学作为一个学科发展的需要，也是我国康复事业发展的要求。

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表2 19株CRKP的基因型及分子分型

  

编号MIC值(mg/L)亚胺培南美罗培南基因检测碳青霉烯类ESBLsAmpC分子分型STPFGEK116>32blaKPC-2blaSHV-11/blaTEM-1/blaCTX-M-65blaDHA-1ST11A1K216>32blaKPC-2blaSHV-2a/blaTEM-1/blaCTX-M-65blaDHA-1ST11A1K332>32blaKPC-2blaSHV-11/blaTEM-1/blaCTX-M-14blaDHA-1ST11A1K416>32blaKPC-2blaSHV-12/blaTEM-1-ST11A1K532>32blaKPC-2blaSHV-12/blaTEM-1/blaCTX-M-65blaDHA-1ST11A1K632>32blaKPC-2blaSHV-12-ST11A2K732>32blaKPC-2blaSHV-12/blaTEM-1/blaCTX-M-65blaDHA-1ST11A1K832>32blaKPC-2blaSHV-12/blaTEM-1/blaCTX-M-65blaDHA-1ST11A1K916>32blaKPC-2blaSHV-12/blaTEM-1/blaCTX-M-65blaDHA-1ST11A1K1016>32blaKPC-2blaSHV-12/blaTEM-1/blaCTX-M-65blaDHA-1ST11A1K1116>32blaKPC-2-blaDHA-1ST11A1K1216>32blaKPC-2blaSHV-12/blaTEM-1/blaCTX-M-65blaDHA-1ST11A1K138>32blaKPC-2blaCTX-M-15-ST48BK1432>32blaKPC-2blaSHV-2a/blaTEM-1/blaCTX-M-65blaDHA-1ST11A3K1532>32blaKPC-2blaSHV-2a/blaTEM-1/blaCTX-M-65blaDHA-1ST11A1K1632>32blaKPC-2blaSHV-2a/blaTEM-1-ST11A4K1724blaKPC-2blaSHV-11/blaTEM-1/blaCTX-M-15-ST48BK181632blaNDM-5blaTEM-1/blaCTX-M-15-未分型CK1984-blaSHV-2a/blaCTX-M-27blaDHA-1ST37D

2.3 分子分型 MLST显示除1株未能分型的菌株(K18号)外，其余18株CRKP中有15株为ST11型，其余型别包括ST48型2株和ST37型1株。PFGE分型发现4个型别4个亚型(A1、A2、A3、A4、B、C和D)，其中A1型12株，A2型、A3型、A4型各1株，B型2株，C型及D型各1株。15株ST11型菌株均为相同的图谱(A型)，2株ST48型K13和K17号菌为相同的图谱(B型)，另外K18和K19分别为C型和D型。见表2、图1。

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注：M，沙门菌H9812分子量marker；K1-K5、K7-K12及K15，A1型；K6，A2型；K14，A3型；K16，A4型；K13和K17，B型；K18，C型；K19，D型。

图1 19株CRKP菌株的PFGE分析

3 讨论

本研究中19株CRKP菌株均呈现多重耐药，仅对替加环素和阿米卡星具有较好的敏感性。有报道称阿米卡星的细菌清除率较替加环素和多黏菌素高，具有较高的临床应用价值[8]。产KPC-2酶是国内介导肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类耐药的最主要机制[9]。本文19株CRKP中有17株携带blaKPC-2基因，与国内流行趋势一致[9]。另本院检出1株CRKP菌株携带blaNDM-5基因，而NDM-5酶具有比NDM-1酶更高的耐药水平和更高的毒力[10]，需引起关注。K19株菌未检出相关碳青霉烯酶基因，是否携带本研究中未检测的其他碳青霉烯类耐药基因或产ESBLs或AmpC合并外膜蛋白缺失尚待进一步研究。CTX-M-14为中国大部分地区常见的ESBLs[11]，而本研究主要为CTX-M-65型，可能与人口分布和地域差异有关。K17号携带blaKPC-2基因却表现出较低碳青霉烯类耐药水平，是否存在调控blaKPC-2基因表达机制尚待进一步研究。

ST11是我国CRKP菌株主要的克隆型，而在西方国家ST258为主要的克隆型，二者均属于CC528克隆型。ST11型CRKP多携带多种耐药性重组质粒，在传播耐药性方面发挥重要的作用。本研究亦存在克隆相关菌株携带不同耐药基因组合情况，例如多株检出blaKPC-2/blaSHV-12/blaTEM-1/blaCTX-M-65/blaDHA-1耐药基因组合。产KPC-2酶ST11型菌株的克隆传播和暴发感染已在国内部分地区报道[2]。我院急诊ICU同样存在携带blaKPC-2基因ST11型菌株的克隆传播。同时本文首次发现ST48型CRKP菌株的克隆传播，应引起重视。另存在ST37型菌株的检出，并已有关于该型CRKP克隆传播的报道[12]。K18号菌株的tonB基因经多次检测未能获得，是否为新的基因型需进一步研究。

4 参考文献

[1]Nordmann P, Poirel L. The difficult-to-control spread of carbapenemase producers among Enterobacteriaceae worldwide[J]. Clin Microbiol Infect, 2014, 20(9): 821-830. DOI: 10.1111/1469-0691.12719.

[2]Tzouvelekis LS, Markogiannakis A, Psichogiou M, et al. Carbapenemases in Klebsiella pneumoniae and other Enterobacteriaceae: an evolving crisis of global dimensions[J]. Clin Microbiol Rev, 2012, 25(4): 682.DOI:10.1128/CMR.05035-11.

[3]CLSI.Performace standards for antimicrobial suscrptibility testing: M100S[S].26th Edition.Wayne, PA:CLSI, 2016.

[4]Endimiani A, Carias LL, Hujer AM, et al. Presence of plasmid-mediated quinolone resistance in Klebsiella pneumoniae isolates possessing blaKPC in the United States[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2008, 52(7):2680-2682.DOI:10.1128/AAC.00158-08.

[5]Yu Y, Ji S, Chen Y, et al. Resistance of strains producing extended-spectrum β-lactamases and genotype distribution in China[J]. J Infect, 2007, 54(1):53-57.DOI：10.1016/j.jinf.2006.01.014.

[6]Pérezpérez FJ, Hanson ND. Detection of plasmid-mediated AmpC β-lactamase genes in clinical isolates by using multiplex PCR[J]. J Clin Microbiol, 2002, 40(6):2153-2162.DOI：10.1128/jcm.40.6.2153-2162.2002.

[7]Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing[J]. J Clin Microbiol, 1995, 33(9): 2233-2239.

[8]Satlin MJ, Kubin CJ, Blumenthal JS, et al. Comparative effectiveness of aminoglycosides, polymyxin B, and tigecycline for clearance of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae from urine[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2011, 55(12):5893-5899. DOI：10.1128/AAC.00387-11.

[9]钟桥, 陆文香, 高晶晶,等. 碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌耐药基因调查[J].临床检验杂志, 2016, 34(6):474-476. DOI：10.13602/j.cnki.jcls.2016.06.20.

[10]Mei YF,Liu PP,Wan LG,et al. Virulence and genomic feature of a virulent Klebsiella pneumoniae sequence type 14 strain of serotype K2 harboring blaNDM-5 in China[J]. Front Microbiol,2017, 8(e4982): 335.DOI:10.3389/fmicb.2017.00335.

[11]Yu J,Tan K,Rong Z,et al.Nosocomial outbreak of KPC-2- and NDM-1-producing Klebsiella pneumoniae in a neonatal ward: a retrospective study[J].BMC Infect Dis,2016,16(1):563. DOI：10.1186/s12879-016-1870-y.

[12]Zhu J, Sun L, Ding B, et al. Outbreak of NDM-1-producing Klebsiella pneumoniae ST76 and ST37 isolates in neonates[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2016, 35(4):611-618.DOI：10.1007/s10096-016-2578-z.