诺如病毒为单股正链无包膜的RNA病毒，属于杯状病毒科，包括3个开放阅读框(open reading frame, ORF)。ORF1编码非结构蛋白，ORF2编码主要结构衣壳蛋白(VP1)，ORF3编码次要结构蛋白(VP2)。根据VP1核苷酸序列差异，诺如病毒可分为7个基因型GⅠ～GⅦ和40多个基因亚型，感染人类的主要是GⅠ型和GⅡ型，GⅣ型较少见[1]。2014-2015年间，诺如病毒GⅡ.17基因亚型在中国、日本等部分亚洲国家引起暴发性胃肠炎，但其他国家的暴发性胃肠炎疫情中GⅡ.17的感染率并没有显著增长，仅为散发感染病例分布，GⅡ.4基因亚型依然是流行优势株[2-3]。本实验收集2016年浙江省内6家哨点医院的急性胃肠炎患者的粪便样本及临床资料，以诺如病毒VP1核苷酸序列为依据确定基因型，分析急性胃肠炎患者中诺如病毒感染的流行病学和基因型特征。

“另外，我们把国防教育渗透到少先队活动之中。我们把国防教育纳入到少先队活动计划中，开展了学生喜闻乐见的各种活动。今年“八一”建军节，我校组织学生到八路军纪念馆参观，孩子们在这次活动中认真聆听讲解，细心感受，参观结束后每位同学都写下了自己的感悟。我们抓住每个有纪念意义的节日进行生动活泼的国防教育。比如，3月5日是毛泽东同志题词“向雷锋同志学习”纪念日，我们就组织学生走上街头，走上社会开展一些力所能及的为民服务活动。”赵天明校长补充到。

1 对象与方法

1.1 样本采集 收集2016年1-12月浙江省宁波北仑区人民医院、湖州市第一人民医院、浙江大学医学院附属第一医院、舟山市人民医院、丽水市中心医院、台州市三门县人民医院共1 308例急性胃肠炎患者的粪便样本及临床资料。急性胃肠炎病例为24 h内排稀便3次及以上或出现任意一次呕吐的个体，但不包括罹患肠癌、肠易激综合症、克罗恩病、溃疡性结肠炎、囊性纤维化、腹腔疾病，或其他伴有腹泻或呕吐症状的慢性病的个体，或症状是因药物治疗、过量饮酒或妊娠所致的个体[4]。

1.2 主要试剂与仪器 核酸提取试剂盒(型号Ex-RNA病毒，苏州天隆生物科技有限公司)；诺如病毒GⅠ/GⅡ分型RNA检测试剂盒(货号VR-II-202，上海辉睿生物科技有限公司)；反转录试剂盒(货号6210A，大连宝生物公司)；PCR扩增试剂盒(货号203643，德国Qiagen公司)；核酸提取仪(型号NP968，苏州天隆生物科技有限公司)；ABI实时荧光定量PCR仪(型号ABI 7500，美国Applied Biosystems公司)；电泳仪及Gel Doc XR+凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.3 核酸提取 取约0.1 g粪便样本溶于1 mL pH7.2的磷酸盐缓冲液中，充分震荡混匀，制备成0.1 g/mL的粪便悬液，13 000 r/min(离心机半径50 mm)离心5 min，吸取200 μL上清液用核酸提取试剂盒提取核酸，终体积为100 μL。

2.4 诺如病毒GⅡ亚型基因进化分析 诺如病毒GⅡ型(44株)的PCR扩增产物经过测序并构建系统进化树分析，发现7种GⅡ亚型：GⅡ.4亚型18株，与参考株GⅡ.4-2012 Sydney株(GenBank号为JX459908)核苷酸同源性为98.9%～99.4%；GⅡ.17亚型15株，其中13株与参考株GⅡ.17-2015 Kawasaki株(GenBank号为LC037415)同源性为98.9%～100%，2株与LC043139株同源性为99.4%；GⅡ.3亚型4株，与U22498株同源性为92.2%～92.5%；GⅡ.6亚型3株，与AB682736株同源性为93.3%～93.6%；GⅡ.13亚型2株，与KJ196276株同源性为93.9%；GⅡ.2亚型、GⅡ.21亚型各1株，与X81879株、JN899245株同源性分别为95.3%和98.0%。以GⅡ.4与GⅡ.17为主要基因型。见图2。

1.7 统计学分析 用SPSS 21.0软件进行。率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

增活力：打造资讯和文创服务平台，最大限度激发县域人民的文化创造活力，让群众拥抱互联网。改造政务资讯的采编模式，制作接地气的主流新闻舆论产品，提升队伍素质，从区域视角宣传党的政策、党委政府决定等。加强线下活动的组织，积极创造县域活动会展新局面。

2.2 诺如病毒感染的时间分布 诺如病毒引起的急性胃肠炎全年均有检出，见表2。10月至12月为高发季节，阳性率为26.19%～37.50%，其中12月的阳性率最高。虽然夏季急性胃肠炎患者占全年急性胃肠炎患者的比例较高，但诺如病毒的检出率却低。诺如病毒在不同月份的阳性率差异有统计学意义(χ2=96.575，P<0.01)。

2.2.1.3 清洁园田环境 田边、路旁、田埂、沟渠、荒地、防护林等处都是菟丝子极易生长繁殖的地方，如果任其成熟结籽，它们能以每年1～3m的速度向耕地扩散，因此要随时清除菟丝子杂草。可喷洒灭生性除草剂，以减少菟丝子种子的来源。

1.5 诺如病毒GⅠ/GⅡ型基因鉴定 分层抽样抽取诺如病毒阳性RNA进行反转录与PCR扩增。反转录条件：30 ℃反转录10 min，95 ℃灭活反转录酶5 min。扩增引物参照文献[5]。扩增体系：2×HotStar Taq Plus Master Mix 10 μL，正反向引物各(10 μmol/L)1 μL，10×Coral Load Concentrate 2 μL，cDNA 2 μL，RNase-free water 4 μL，总体积为20 μL。扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 7 min；15 ℃终止反应。所有操作严格按照试剂说明书进行。PCR扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后送杭州铂尚生物技术有限公司测序。

2 结果

2.1 诺如病毒感染的人群分布 1 308份粪便样本一步法双重荧光RT-PCR定性检测结果显示，诺如病毒阳性138份，阳性率为10.55%，其中GⅠ型12例，GⅡ型118例，GⅠ/GⅡ型混合感染8例。各年龄组间阳性率差异无统计学意义(χ2=7.120，P=0.068)。急性胃肠炎患者中男性675例，女性633例，两者之间诺如病毒的阳性率差异无统计学意义(χ2=1.966，P=0.161)。见表1。

1.6 序列分析和进化树建立 采用SeqMan软件拼接序列，利用MEGA 7.0软件比对绘制进化树，通过MegAlign软件进行同源性分析。所有诺如病毒GⅠ、GⅡ亚型参考株均来自GenBank数据库。

 

表1 不同年龄和性别患者诺如病毒感染率的比较分析

  

指标nGⅠ感染例数GⅡ感染例数GⅠ/GⅡ混合感染例数诺如病毒阳性例数(%)年龄(岁) <15270032032(11.85) 15～476843556(11.76) 35～357333339(10.92) ≥60205110011(5.37) 性别 男675967379(11.70) 女633351559(9.32) 合计1308121188138(10.55)

表2 2016年浙江省急性胃肠炎患者诺如病毒每月阳性率(%)

  

月份病例数阳性例数阳性率(%)1月1402618.572月61914.753月821821.954月53713.215月158159.496月207136.287月23583.408月17652.849月10487.6910月421126.1911月26934.6212月24937.50总计130813810.55

本研究对2016年浙江省6家哨点医院肠道门诊就诊的急性胃肠炎患者的粪便样本进行诺如病毒检测，全年阳性率为10.55%。与国内研究比较发现，与邻近省市(江苏、上海)报告的阳性率(7.25%～13.4%)接近[6-7]，但显著高于内陆地区(青海、西藏)的阳性率(1.4%～4.0%)[8]，提示地理位置、气温、降雨、湿度等环境因素可能与诺如病毒的流行存在特定关系。与国外研究比较发现，与黎巴嫩(11.2%)、泰国(11.4%)等发展中国家的阳性率较接近，明显低于澳大利亚(42.0%)、美国(52.7%)等发达国家的阳性率[9-12]。

 

注：系统进化树根据诺如病毒衣壳区(VP1)部分核苷酸序列用邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建，包括21株核苷酸序列。●，本研究分离株；※，GⅠ/GⅡ型混合感染株；其他病毒株来自GenBank。

图1 诺如病毒GⅠ型系统进化树分析

1.4 诺如病毒GⅠ/GⅡ型初筛 采用一步法双重荧光RT-PCR技术(诺如病毒GⅠ/GⅡ分型RNA检测试剂盒)进行GⅠ/GⅡ分型。反应体系共25 μL，包括RT-PCR Reaction Buffer 7.5 μL，诺如病毒GⅠ/GⅡ反应液7.5 μL，酶混合液5 μL，样本RNA 5 μL；反应条件：逆转录50 ℃，30 min；预变性95 ℃，5 min；40个循环反应(变性95℃，10 s；55 ℃退火、延伸及检测荧光，45 s)。结果判断：Ct值≥38为阴性结果；35≤Ct值<38为检测灰区需重复测定2次，若两次Ct值均≥38则为阴性结果，若其中1次Ct值<38则为阳性结果；Ct值<35为阳性结果。每一批PCR均设阴性对照和阳性对照。检测通道：FAM(GⅠ型)和VIC(GⅡ型)。

 

注：系统进化树根据诺如病毒衣壳区(VP1)部分核苷酸序列用邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建，包括78株核苷酸序列。▲，本研究分离株；※，GⅠ/GⅡ型混合感染株；其他病毒株来自GenBank。

图2 诺如病毒GⅡ型系统进化树及分析

3 讨论

2.3 诺如病毒GⅠ亚型基因进化分析 诺如病毒GⅠ型(10株)的PCR扩增产物经过测序并构建系统进化树分析，结果显示7株为诺如病毒GⅠ.6亚型，其中6株与AB081723株的核苷酸同源性为95.9%～97.1%，1株与KT732280株的同源性为99.0%；1株为GⅠ.2亚型，与L07418株的同源性为98.1%；1株为GⅠ.5亚型，与AB039774株的同源性为97.1%；1株为GⅠ.4亚型，与AB042808株的同源性为95.2%。GⅠ.2、GⅠ.5、GⅠ.4亚型株均来自GⅠ/GⅡ型混合感染患者，见图1。

4.消费者权益得不到有效保护。网络模式下的餐饮业法律规定不完善，很难确保消费者在网络交易过程中的权益得到有效保护。另外，由于消费者与网络餐饮业对食品质量的评判标准不同，因此在调查取证的过程中容易出现分歧，无法较好地保护消费者的合法权益[1]。

从人群分布分析，各年龄段均有诺如病毒散发感染患者，且诺如病毒的阳性率随着年龄增长呈现下降趋势，少儿组阳性率最高(11.85%)，考虑该年龄段人群免疫力较低，且生活在半封闭场所，增加了被诺如病毒感染的概率[13-14]。虽然我们的结果显示老年人阳性率(5.37%)较低，但是老年人因诺如病毒感染引起的死亡率是婴幼儿的2倍[15]。因此老年人感染诺如病毒后，应引起临床的高度重视。男性感染诺如病毒的病例数高于女性，提示男性可能更易被诺如病毒感染，青岛、苏州等地也有类似报道[16-17]。从时间分布分析，2016年浙江省诺如病毒散发感染全年分布，且冬季高发，与其他报道一致，原因可能是干冷的冬季更适合病毒生存[18]。夏季诺如病毒阳性率低，而夏季急性胃肠炎患者的构成比却高，这可能是因为急性胃肠炎还与细菌或其他肠道病毒感染有关，需进一步全面检测其他病原微生物再研究。

陈少平：2019年，广东垦区上下将全面贯彻党的十九大和十九届二中、三中全会精神，以习近平新时代中国特色社会主义思想为指导，深入贯彻习近平总书记对农垦和广东重要讲话精神，高举新时代改革开放旗帜，抓住粤港澳大湾区建设这一大机遇、大文章，立足农垦定位，发挥垦区优势，持续推进“走出去”发展，让广东农垦的发展搭上新一轮改革发展的快车，为实施乡村振兴战略、质量兴农战略、健康中国战略做出广垦贡献。

本研究发现2016年浙江省急性胃肠炎患者中诺如病毒GⅡ型比GⅠ型传播更加广泛，同时又以GⅡ.4和GⅡ.17基因亚型为主，这与国内近期报道结果一致[16]。对感染GⅡ.4和GⅡ.17型诺如病毒的人群进行分析，发现感染GⅡ.4型诺如病毒患者的平均年龄为28.06岁，男性人数是女性的2倍，且下半年发生的感染例数略多于上半年；感染GⅡ.17型诺如病毒患者的平均年龄为32.93岁，女性略多于男性，且感染主要发生于上半年，提示GⅡ.4型诺如病毒与GⅡ.17型诺如病毒的易感人群及流行季节存在差异。本研究发现8例(20～41岁)诺如病毒GⅠ/GⅡ型混合感染患者，其中日腹泻次数5次及以上的患者占71.43%，高于单一型感染患者的47.06%，提示混合感染患者的临床症状比单一型感染患者的严重，混合感染的发生可能与中青年人群暴露污染食物的机会较多有关，食源性传播是诺如病毒感染的重要途径[6]。

通过诺如病毒GⅠ/GⅡ分型和基因鉴定，发现2016年浙江省诺如病毒GⅡ型比GⅠ型传播更加广泛，以GⅡ.4亚型和GⅡ.17亚型为主的诺如病毒是引起急性胃肠炎的优势病原体。本次研究中各哨点医院收集病例的数量、时间和临床资料齐全程度有差别，可能导致分析存在一定偏差，我们将逐渐完善后续的急性胃肠炎患者监测的各项工作，为我省诺如病毒预防和控制提供更加科学的理论依据。

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