区分健康与疾病状态以及监测疾病的发生发展，往往需要在复杂样本中对某种低浓度蛋白质生物学标志物进行检测。整体测量体现的是物质平均水平，检测不出表面上相同但存在微小差异的分子[1]。目前ELISA方法能检测浓度大于10-12 mol/L的蛋白质，但在癌症、神经系统疾病以及感染早期，大部分重要的蛋白质浓度仅为10-16～10-12mol/L[2-3]。在HIV病毒感染早期，每毫升血清中约含有10～3 000个病毒体，p24抗原的浓度相当于50×10-18～15×10-15 mol/L，处于较低水平状态，因此普通免疫学技术难以检测得到[4]。而单分子ELISA通过单分子分离技术同时检测数千个单分子蛋白质，能检测出含量低于10-15mol/L级的蛋白质，具有高分辨率、灵敏、低样本量、短分析时间等优点，能作为一个检测极低浓度蛋白质的有效方法[3]。

图5为Activiti引擎的系统服务结构图，给出了引擎提供的所有功能组件。ProcessEngineConfiguration是配置管理类，管理的对象包括ProcessEngine、XXservice和数据库session等。对于ProcessEngineConfiguration的配置，Activiti默认从activiti.cfg.xml中读取，也可从Spring的配置文件中读取。ProcessEngine提供有很多工作流方法的服务，都是线程安全的，下面对各服务的功能进行介绍。

1 单分子ELISA技术原理

利用一系列材料(如玻璃、硅、尼龙、琼脂糖、丙烯酰胺以及其他聚合物等)制成含上千孔直径为微米级的微孔阵列，即单分子微孔阵列(single molecule array，SiMoA)，其微孔直径与磁珠直径相当，可实现单个分子的分离，再利用双抗体夹心法进行蛋白质含量检测[3,5]。将捕获抗体包被于磁珠上，血清或血浆样本中蛋白质抗原与捕获抗体包被的磁珠结合，生物素化检测抗体再与磁珠上的抗原结合，链霉亲合素β-D-半乳糖苷酶与磁珠上的生物素化抗体结合，捕获磁珠重悬在试卤灵β-D-半乳糖苷底物(resorufin β-D-galactopyranoside，RGP)中，其转导于SiMoA微孔盘上，每个捕获磁珠封闭在SiMoA微孔盘的每个微孔内。如果蛋白质抗原被磁珠捕获，β-D-半乳糖苷酶作用于其底物，产生荧光产物，检测器可检测荧光信号强度。一个蛋白质抗原分子足够提供30 s的荧光信号，可被SiMoA光学系统检测到。SiMoA微孔盘上微阵列中的一个孔即代表一个抗原分子，计数有荧光的孔数即可得到蛋白质抗原的数量，通过与标准曲线对比即可得到样品中蛋白质抗原的含量[5]。

2 单分子ELISA技术的发展

单分子ELISA技术起源于光纤微孔阵列具有测量单个酶活性能力的发现，随后延伸到使用磁珠检测低浓度酶，进而延伸到基于磁珠的免疫学分析技术。1961年，斯坦福医学院的 Boris Rotman首先尝试单分子测量，将β半乳糖苷酶和其荧光底物喷洒到硅油滴上，数小时后观察油滴上不同酶分子催化产生的荧光，检测到单个酶分子的存在[6]。1974年，Hirschfeld报道，将相对分子质量20 000的聚乙烯亚胺(polyethyleneimine)标记80～100个异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate, FITC)分子，并将此多聚物标记γ球蛋白，由于一个标记物可发射很多光子，弥补当时光子检测器灵敏度的缺陷，几乎达到现在荧光分子的检测灵敏度，实现光学单分子检测[7]。1994年Xie等[8]和1997年Le等[9]采用毛细管电泳技术分别分离单分子乳酸脱氢酶和碱性磷酸酶，并检测荧光产物。Le等[9]采用毛细管电泳脉冲分离酶产物和酶，对单个酶进行动力学测量，发现不同酶有不同活性形式。

2008年Li等利用单分子微孔阵列技术来实现检测单个蛋白质分子的数字化平台：使用含50 000孔的光导纤维微孔阵列进行检测，其微孔直径约4 μm，深度约3 μm，体积约40 fL，每个微孔含0～1个微粒，微粒包被抗体，β半乳糖苷酶标记检测抗体，夹心法检测抗原分子，每孔含0个或1个酶分子，加入荧光底物和聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)膜后，每秒钟酶转换几百个底物分子发射荧光，数秒后纳摩尔级的底物转换成荧光产物，几分钟后发射荧光孔可与其他孔区分开来[10]。

单分子阵列能够在fL级体积的孔中捕获单个分子，数字化读取单个磁珠信号以检测是否结合目标分子。单分子阵列试验能够实现单分子和多重分子检测。美国Quanterix公司Simoa HD-1分析仪是一个全自动数字式单分子免疫阵列检测技术平台，采用微流通道光盘，每个光盘包含24个微阵列芯片，每个芯片包含216 000个飞升大小的微孔，每个微孔正好容纳一个磁珠[5]。传统免疫试验的检测需要几百万个分子产生的信号强度，而单分子阵列试验的密封微孔中单个目标分子能快速产生足够的荧光信号，用显微荧光成像技术进行检测。本技术的灵敏度较传统ELISA技术平均提高1 000倍，能检测疾病早期以及放化疗后体液样本中极低浓度蛋白质。

3 单分子ELISA技术的优势和缺点

4.2 监测前列腺癌术后残留以及复发 单分子ELISA技术也用于微量前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen,PSA)的检测，用以在前列腺切除手术后监测前列腺癌复发。前列腺癌经前列腺手术切除以及放化疗后，其PSA的水平处于极低水平状态，含量低于0.1 ng/mL，在PSA含量测定中普通ELISA技术的最低检测限只能达到0.1 ng/mL，检测不出含量低于0.1 ng/mL的PSA蛋白质，而单分子ELISA技术的最低检测限为30 fg/mL，显著较传统ELISA低, 能够精确地测量PSA含量，检测低水平的PSA。有研究报道在经前列腺手术切除以及放化疗后前列腺癌的生化复发以及持续存在与PSA的含量低于0.2 ng/mL密切相关，也说明监测低水平的PSA能早期监测到术后残留，为早期预防前列腺癌复发打下基础[14-15]。

4.3 监测神经变性性疾病和脑损伤 阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)患者脑脊液中能发现淀粉样蛋白质β扩散性配体(amyloid-β-derived diffusible ligands, ADDLs)的存在，其中ADDLs是AD潜在的可溶性致病标志物。由于这个标志物蛋白质的含量太低，低于1 pmol/L，用传统ELISA和免疫分析技术很难检测得到。有研究用单分子微阵列对脑脊液中ADDLs进行追踪，其检测下限达0.3 pg/mL，结果显示，健康正常人脑脊液中ADDL含量低于0.5 fmol/L，均值为200 amol/L左右，而患者脑脊液中ADDL含量大部分都高于0.5 fmol/L，均值为1.7 fmol/L，显著较正常人高[16]。除了脑脊液中ADDL水平检测对AD早期检测诊断具有重要意义，其在血液中的水平检测对AD治疗监测也具有一定意义，可以作为监测γ分泌酶和β位点淀粉样前体蛋白质裂解酶1药物作用的药效性标志物，其水平还能对药物剂量的选用起到优化作用。AD患者经此类药物治疗后，血液中ADDL处于极低水平，低于100 pg/mL，常规免疫学方法检测不到，需要依赖单分子ELISA 技术定量，预示单分子ELISA技术能追踪血液中ADDL的含量以及AD患者对新治疗方案的反应，为临床治疗提供线索[17]。

4 单分子ELISA技术的临床应用

剧烈运动引起脑震荡以及脑缺氧后tau蛋白质含量都显著升高，能清楚地反映脑组织损伤，同时检测淀粉样蛋白质42的水平，能预示在心肌梗死导致脑缺氧后的认知能力[18-20]。单分子ELISA技术能高灵敏地检测轴突损伤生物学分子tau蛋白质的含量，灵敏度能达到0.002 pg/mL，其灵敏度较普通ELISA技术提升约1 000倍[20]。

单分子ELISA技术较传统ELISA技术有以下优势。(1)高灵敏度。单分子ELISA技术的单分子阵列中含有大量的磁珠，每个磁珠表面被一层捕获抗体覆盖，捕获抗体与目标分析物的多重碰撞运动促进两者发生结合。同时单分子阵列微孔限制目标分子扩散，避免目标分子缓慢结合到一个宏观捕获表面，提高目标分子与捕获抗体的结合效率，能够高效检测低浓度的蛋白质含量。其高灵敏性大大减少检测抗体和酶结合物的用量，其中检测抗体的浓度低于1 nmol/L，酶结合物浓度在1～50 pmol/L之间，能检测出含量低于fM级的蛋白质。(2)高精密度。单分子ELISA通过分离单个分子，精确检测每个分子产生的荧光信号，其中每30秒捕获荧光图像，收集2.5 min内单分子产生的所有荧光信号，通过计数从而得到样品中的蛋白质含量。(3)低背景信号。在单分子ELISA技术中，单分子阵列对酶标记物的高敏感性以及单分子阵列中低含量的标记试剂，减少了非特异性结合，大幅度减少分析背景信号。最灵敏的商品化普通ELISA分析法检测TNF-α产生的背景信号相当于85 fmol/L靶蛋白质产生的信号，而单分子ELISA技术检测TNF-α产生的背景信号相当于1.8 fmol/L靶蛋白质产生的信号，其产生的背景信号较普通ELISA降低90%左右。(3)宽线性范围。研究发现单分子ELISA检测样本含量的线性范围为350 zmol/L～3.5 fmol/L，较宽的线性范围适用于大量临床标本的检测[3]。(4)经济、高效、高通量。单分子ELISA技术采用单分子微阵列对多个蛋白质分子同时进行分析，大大减少样本和试剂的用量，减少成本，明显缩短分析反应时间，30 s内捕获蛋白质提供的荧光信号[3,5,11]。

大型锻压机械（主要指机械压力机和液压机）加工工件具有效率高、制品质量好、能耗低和成本低等优点，广泛应用于汽车、农业机械、国防工业和家电等领域或场所。普通锻压机械工作时噪声高，影响操作者的身心健康，还会将人的注意力分散，是各种意外事故发生的根源，也是安全生产的重要点。而大型锻压机械噪音在工业领域中尤为突出，因此，锻压行业降噪已成为目前绿色制造中需要解决的问题。我国《工业企业噪声卫生标准》规定:每个工作日接触噪声时间8小时，容许噪声值为85dB。而大型锻压机械装备的噪声值大都超过或接近容许值。

但单分子ELISA技术仍然存在一些问题。首先是非特异性结合问题，如样品中含有与待测物或酶类似的高浓度蛋白质，其非特异性结合会加大检测背景，此时可以通过使用表面纯化技术来减少蛋白质吸附，从而减少非特异性结合。其次是当待测蛋白质的绝对数量很低时，其结合到磁珠的比率低，导致活化的磁珠数量太低，会造成泊松噪音太大，超过来自泊松噪音总变异系数的可接受范围(如6%～7%)，导致结果不可接受。

4.1 监测早期HIV感染中HIV-1 p24蛋白质含量 单分子ELISA技术基于其高灵敏度、高特异性、低背景信号等特点，可用于HIV-1 p24蛋白质的检测。其检测p24蛋白质含量的标准曲线测量范围为0.017～37.8 pg/mL，能够对fg水平的p24蛋白质进行精确定量，其中单个感染细胞产生的p24蛋白质含量大约在0.096～0.36 pg/mL之间，超出单分子ELISA技术最低检测限(0.017 pg/mL)的5倍，能够被其精确检测。而单个或10个感染细胞产生的p24蛋白质含量却显著低于普通ELISA技术的最低检测限(7.8 pg/mL)，不能被其检测出，说明单分子ELISA技术的应用在监测HIV早期感染中起到重要作用[12-13]。

短暂性脑缺血属于一过性神经功能缺损，病情相对较轻，症状可自行消失，故易被患者、医生忽视[4] ，未能给予及时有效的干预治疗，导致病情的反复发作，进而引起脑梗死等严重后果。本病的治疗以综合对症干预为主，如针对患者的合并疾病，给予病因治疗，在此基础上，应注意给予抗凝治疗。阿司匹林肠溶片即是一种具有抗凝、预防血栓形成、改善微循环的药物，已被广泛应用于多种脑血管疾病的治疗和预防之中。而硫酸氢氯吡格雷则是一种噻吩吡啶类抗血小板药，具有较强的抑制血小板聚集作用，且有扩张脑血管、改善脑部血流量的作用。

4.4 监测炎性疾病发展 单分子ELISA技术还可应用于检测炎性细胞因子，最低检测限范围约为1 fg/mL～0.09 pg/mL，其中，单分子ELISA技术在IL-6、TNF-α含量检测中的最低检测限分别为0.004 3 pg/mL、0.013 pg/mL，而普通ELISA技术却只能达到0.11 pg/mL、0.191 pg/mL，预示单分子ELISA技术能准确检测低浓度细胞因子，可利用治疗后细胞因子浓度的变化来监测疗效[21]。

4月22日上午，水利部抗震救灾供水保障组前方工作组冒雪到规划中的新寨村灾民安置点进行考察，将灾民安置点供水与农村供水结合考虑，深入养老院、居民点详细了解供水现状，初步提出供水方案。

5 展望

单分子ELISA技术通过采用纳米级微孔和微量捕获试剂大大提高检测的灵敏度，满足临床低浓度蛋白质标志物检测的要求。此优势在监测疾病复发以及用处于极低水平的生物学标志物监测疾病发展中起到非常重要的作用。但单分子ELISA技术离应用到临床还有一段距离，其中参考范围的建立以及临床相关性研究等方面还存在很多困难，还需要进一步研究探索。

6 参考文献

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