目前，肝脏部分切除仍然是治疗肝脏恶性肿瘤的最佳方法。由于多数原发性肝癌患者伴有肝硬化门静脉高压，术后出现的门静脉高灌注状态导致的肝功能衰竭是肝切除术后死亡的重要原因[1-2]。过量的门静脉血流可以影响肝动脉血流，导致肝脏组织的损伤，进而影响肝细胞的再生。本实验使用大鼠肝硬化模型进行肝大部切除术，并建立不同流量的入肝血流模型，通过检测肝功能变化、肝细胞中Ki-67蛋白的表达情况以及残肝重量，来鉴定不同入肝血流对肝硬化大鼠肝切除后肝功能及肝再生的影响。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 实验试剂：CCl4，苏州市第二化工研究所；苏木素，Sigma公司；无水乙醇、二甲苯、盐酸、包埋石蜡、中性树胶、2.5%戊二醛固定液等相关化学试剂均购于国药集团；抗Ki-67抗体，Abcam公司。

1.1.2 实验仪器：JT-12J型脱水机来自武汉俊杰；RM 2016型病理切片机购于德国Leica公司；全自动血生化分析仪来自美国Beckman公司；CX31型生物正置显微镜来自日本Olympus公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠肝硬化模型构建：大鼠购自昭衍（苏州）新药研究中心有限公司，动物质量合格证SCXK（苏）2013-0003。模型制备分诱导期和成模期。诱导期：实验动物在诱导前以每升蒸馏水中含0.35 g苯巴比妥钠的溶液作为大鼠的唯一饮用水，时间1周；饲料使用普通大鼠饲料。成模期按0.5 mL/100 g体重剂量予以腹腔注射40% CCl4中性菜籽油溶液，每周2次，持续4周；同时以10%乙醇溶液为其每周唯一饮用水。第5周开始改为用50% CCl4中性菜籽油溶液，以0.5 mL/100 g体重标准腹腔注射，每周2次，持续4周；同时改为以30%乙醇溶液为其唯一饮用水至实验结束。停药2周后进行肝脏切除+入肝血流改建。

营造技艺研究包含3个部分——“匠意”、“匠技”、“形制”。“匠意”主要指匠师的营造思想、理念以及营造知识等，是营造的设计思路、营造领域的文化准绳，它难以通过书面传播，需要通过访谈、口述史的记录研究进行探索。而“匠意”也是最为灵活多变的，大多会由匠师根据屋主的需求并结合乡土经验和智慧等进行统筹设计[7]。在这种交流中，其实也是营造活动中两者争取主要话语权的一种过程。“匠技”包括具体营造手法、技艺等，具有鲜明的群体色彩。可借匠技对匠师进行分派分帮，如广为人知的“香山帮”、“广府帮”等；“形制”是建筑本体的表现形式，同时其布局也代表了一定的等级制度、使用秩序、文化习俗等。

1.2.2 肝切除手术+入肝血流调控：大鼠麻醉后取上腹部正中切口。肝大部切除手术：使用电刀完整切除左外叶和左内叶，约占全肝总量的45%，肝脏断面管道使用细丝线缝扎。入肝血流调控：门静脉低流量的建立：裸露门静脉，将8号针头与门静脉平行放置，用5-0丝线结扎2道，再将针头拔出；以术前血流动力学检测结果为基准，使术后血流数据较术前数据降低约30%；门静脉高流量的建立：肝大部切除后即有门静脉高流量状态，无需特殊处理；肝动脉低流量的建立：使用胰岛素针头缩窄肝动脉，方法同门静脉缩窄；肝动脉高流量的建立：结扎脾动脉。动物分组：对照组，肝切除手术后不进行入肝血流干预（Control组)；门静脉低流量+肝动脉高流量组（low-flow PV+high-flow HA组)；门静脉低流量+肝动脉低流量组（low-flow PV+low-flow HA组）；门静脉高流量+肝动脉高流量组（high-flow PV+highflow HA组)；门静脉高流量+肝动脉低流量组（highfl ow PV+low- fl ow HA组），每组大鼠7只。

1.2.5 残肝计重：肝切除术后+入肝血流改建后5 d，处死动物，取残余肝脏并称重。

1.2.4 肝功能检测：术前和术后1、3、5 d分别采集血清，采用全自动血生化仪检测肝功能。

1.2.3 肝血流量检测：麻醉进腹后暴露肝脏；将激光散斑血流成像仪探头调准待测量的肝脏部位，调整好焦距，记录大鼠的入肝血流量[3]。激光散斑血流成像利用血管中红细胞运动产生的后向动态散斑对比度值来获取血流速度信息；散斑变化速度取决于血流的速度和流量，其单位是“灌注单位”（perfusion unit，PU）。

各组术前肝组织病理无明显差异，术后血流调节后，对照组（图2A）、high-flow PV+high-flow HA组（图2D）、high-flow PV+low-flow HA组（图2E）肝组织炎性细胞浸润，肝窦结构及肝细胞损伤，肝细胞间隙间可见明显充血；low-flow PV+high-flow HA组（图2B）与low- fl ow PV+low- fl ow HA组（图2C）肝细胞间充血现象减少（其中前者充血现象仍较显著），肝窦结构及肝细胞损伤明显减轻。具体见图2。

1.2.6 组织病理学检查：肝组织置于10%甲醛中固定48 h，分别依次洗涤，乙醇逐级脱水，二甲苯浸泡，组织浸蜡包埋，切片烤片和脱蜡，苏木素染色，伊红染色，二甲苯透明和65 ℃烘箱中性树胶封片；光镜检查并采集图像。

术后第5天处死大鼠并采集残余肝脏进行称重。结果显示，Control组、low- fl ow PV+high- fl ow HA组、low-flow PV+low-flow HA组、high-flow PV+highflow HA组和high-flow PV+low-flow HA组残肝重量分别为（11.8±0.7）g、 （15.4±1.0）g、 （13.1±1.2）g、（11.8±0.6）g和（10.9±1.0）g。门静脉低流量组残肝重量显著高于对照组以及门静脉高流量组（P ＜0.05）。

大鼠肝硬化模型建立过程中，成模组和建模对照组的肝功能变化差异有统计学意义（见表2）。术后各组血清中丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬门氨酸转氨酶（AST）和总胆红素（TBIL）水平逐渐恢复。门静脉低流量组大鼠血清中ALT、AST和TBIL水平明显低于对照组（P ＜ 0.05），而ALB在各组间无明显差异，具体见表3。

1.3 统计学分析

激光散斑血流成像仪测量大鼠肝脏血流量：lowflow PV+high-flow HA组与low-flow PV+low-flow HA组大鼠入肝血流量明显减少，high- fl ow PV+highflow HA组与high-flow PV+low-flow HA组大鼠入肝血流量有不同程度的增加。单因素方差分析结果显示，术后0 d血流变化明显（P ＜ 0.001），两两比较结果示除high-flow PV+high-flow HA组与Control组比较无统计学差异外，其余各组之间比较均P ＜0.05。术后5 d，依然明显（P ＜ 0.001）,除high-flow PV+high- fl ow HA组与Control组、high- fl ow PV+lowflow HA组与Control组、high-flow PV+low-flow HA组与high-flow PV+high-flow HA组比较无统计学差异外，其余各组之间比较均P ＜ 0.05（表1）。

2 结果

2.1 大鼠肝硬化模型HE染色鉴定

成模组大鼠肝组织结构不完整，假小叶形成（图1）。

图1 肝硬化造模前后大鼠肝组织（HE，×200）

A：正常对照组；B：肝硬化模型组

2.2 大鼠肝脏血流动力学变化

采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，所有数据以均值±标准差（±s）表示。多组定量资料组间差异的比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。组间两两比较应用采用LSD法（最小显著性法），P ＜ 0.05表示差异有统计学意义。

2.3 大鼠肝功能变化

其二，家庭成员可以将自身的劳动时间分配到两种产品的生产选择中，不考虑为维持劳动力和人力资本至少不变的消费活动。

表1 各组动物入肝血流变化（PU）

组别 肝切除术前 肝切除术后 术后血流改建后0 d 术后血流改建后5 d Control组 678.0±86.1 1 351.1±98.4 1 440.7±130.4 937.7±110.1 low- fl ow PV+high- fl ow HA组 648.9±63.5 1 367.1±86.2 1 051.4±146.4 738.8±586 low- fl ow PV+low- fl ow HA组 618.7±58.9 1 312.7±90.2 829.4±147.0 605.5±36.1 high- fl ow PV+high- fl ow HA组 619.4±50.8 1 277.0±105.0 1 452.1±66.9 912.7±81.6 high- fl ow PV+low- fl ow HA组 634.7±98.3 1 345.2±79.0 1 824.0±123.8 957.3±107.7 F值 0.78 1.06 65.64 23.28 P值 0.545 0.392 ＜0.001 ＜0.001

表2 建模过程肝功能变化

组别ALT（U/L） AST（U/L） ALB（g/L） TBIL（μmol/L）0 周 8周 10周 0周 8周 10周 0周 8周 10周 0周 8周 10周对照组 38.9±2.1 37.7±2.1 35.7±7.3 116.4±6.0 113.3±8.7 115.6±7.3 30.2±1.3 29.4±1.6 30.1±2.4 0.58±0.2 0.7±0.2 0.7±0.3成模组 38.3±2.6 132.1±7.5 245.3±22.8 116.9±8.2 327.0±11.8 1 056.3±109.6 29.9±0.8 30.4±1.9 29.4±1.8 0.53±0.2 6.1±1.2 22.0±4.8 t值 0.46 -32.15 -23.11 -0.11 -38.45 -22.66 0.52 -1.11 -11.62 0.62 -11.50 -15.82 P值 0.657 ＜0.001 ＜0.001 0.913 ＜0.001 ＜0.001 0.612 0.288 0.53 0.550 ＜0.001 ＜0.001

2.4 入肝血流对大鼠肝组织病理学的影响

选取我院2017年7月～2018年7月收治的PPD患者66例，纳入标准：①产后女性；②产后有悲伤、抑郁、沮丧、烦躁等症状；③产后有抑郁症状或心理，渴望得到治疗。其年龄19～44岁，平均32.2岁，病程5～15 d，所有患者及家属均对本次研究知晓，并自愿签署知情同意书。随机分成观察组与对照组，各33例，两组患者年龄、病程等一般资料差异不明显，具有可比性。

表3 肝切除后入肝血流改建后大鼠肝功能变化

ALT（U/L） AST（U/L） ALB（g/L） TBIL（μmol/L）1 d 3 d 5 d 1 d 3 d 5 d 1 d 3 d 5 d 1 d 3 d 5 d Control组 676.9±41.7 574.9±28.0 436.1±32.7 1141±83 941±28 789±30 28.6±2.4 27.6±2.2 27.1±1.9 30.3±1.4 26.5±0.8 22.1±1.2 low- fl ow PV+high- fl ow HA组 460.9±31.7 331.0±22.0 285.6±15.8 791±27 662±33 552±24 27.7±1.1 29.0±1.6 28.1±2.6 20.4±1.5 16.1±1.0 13.5±0.6 low- fl ow PV+low- fl ow HA组 551.0±33.0 429.9±28.5 359.1±22.9 937±56 809±36 648±38 28.3±1.6 28.41.9± 29.0±1.6 22.9±1.5 22.6±0.8 17.9±1.3 high- fl ow PV+high- fl ow HA组 674.7±27.6 588.9±22.6 454.0±18.5 1156±61 937±27 803±28 29.1±2.4 27.8±1.8 28.9±2.3 29.6±1.6 27.5±0.9 23.3±0.9 high- fl ow PV+low- fl ow HA组 857.0±26.8 727.6±29.8 579.1±38.2 1438±73 1175±59 931±44 29.1±1.1 29.2±2.6 28.8±1.2 38.0±1.7 32.8±1.7 28.8±1.7 F值 147.62 236.77 116.46 107.25 172.16 133.45 0.72 0.78 1.13 138.58 230.82 164.68 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.583 0.545 0.361 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001组别

图2 各组大鼠肝组织病理改变（HE，×200）

A～E：肝切除术+血流改建5 d后肝组织，分别对应Control组、low- fl ow PV+high- fl ow HA组、low- fl ow PV+low- fl ow HA组、high- fl ow PV+high- fl ow HA组、high- fl ow PV+low- fl ow HA组；F：肝切除术+血流改建前肝组织

2.5 入肝血流对大鼠残肝重量的影响

1.2.7 肝细胞中Ki-67蛋白的检测：采用免疫组化法。取肝组织依次经甲醛固定，洗涤与脱水，乙醇逐级脱水，浸蜡包埋，切片，抗原修复，内源性过氧化酶活性阻断等处理；按1:100的稀释比例配置一抗，每张切片加入一抗4 ℃孵育，PBS冲洗3次，每次5 min；每张切片加入二抗工作液，室温，湿盒孵育10～15 min，弃去二抗，PBS冲洗3次，每次5 min；每张切片链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，置于湿盒内室温孵育10～15 min，甩掉工作液，PBS冲洗3次，每次5 min，然后依次进行DAB染液染色，苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明等步骤，最后封片并观察结果。

2.6 入肝血流对大鼠肝细胞中Ki-67蛋白表达的影响

术后第5天的大鼠肝组织中，low- fl ow PV+highlf ow HA组、low- fl ow PV+low- fl ow HA组、high- fl ow PV+high-flow HA组大鼠肝细胞中Ki-67表达阳性率显著增强（图3B、3C、3E），分别为：（23.9±3.6）%、（15.7±2.3）%、（ 12.9±2.4）%，与对照组相比差异明显[（10.1±2.1）%，P ＜ 0.05，图3A]，而high-flow PV+low- fl ow HA组Ki-67阳性表达率为（6.1±1.4）%（图3E），低于对照组（P ＜ 0.05），具体见图3。各组术前血流调控前肝细胞中Ki-67表达均弱于术后第5天的表达。

图3 各组大鼠肝细胞Ki-67蛋白表达情况（免疫组化，×200）

3 讨论

肝大部切除后，肝脏血管床横截面变小，单位时间内流经肝脏的血流量显著升高，产生门静脉高灌注状态[1-2]。门静脉高灌注会引起肝窦内切力升高，引发肝窦内皮细胞的损伤、凋亡，进一步影响肝细胞的再生，被认为是肝大部切除术后肝功能不全的主要原因[4-5]。此外，门静脉虽然富含营养因子，但是含氧量低；门静脉高灌注状态会导致肝组织氧供和摄氧障碍。Dold等[4]发现肝大部切除术后所致的门静脉高灌注状态可以导致肝组织内氧分压显著降低，并损害线粒体的功能，引起肝细胞的坏死和凋亡，影响细胞的再生以及肝功能的恢复。调整门静脉血流，降低门静脉压力，减轻对肝窦内皮细胞以及肝细胞的损害，并改善氧供，促进肝组织的再生和功能恢复[6-8]。Bucur等[9]对猪进行肝大部切除后，使用环形装置调节门静脉血流，促进了肝细胞再生，降低了肝功能不全的发生。本实验结果显示，门静脉低流量组肝细胞间充血现象减少，肝窦结构及肝细胞损伤明显减轻，大鼠血清中ALT、TBIL水平最接近正常，与门静脉高流量组相比差异显著。肝脏具有强大的再生能力，肝脏再生是肝大部切除后肝功能恢复的基础。Ki-67是细胞增殖强弱的标记指标，可标记大部分G0期以外的细胞，肝细胞Ki-67的阳性率越高，说明处于增殖周期的细胞比例越高，细胞再生速度越快[10-12]。在本实验中，门静脉低流量组大鼠术后肝组织中Ki-67表达显著增强，残余肝脏重量显著增加，尤其以门静脉低流量+肝动脉高流量组为明显。以上实验结果与上述国外的研究相似，证实了纠正门静脉高灌注状态可以减轻肝大部切除术后肝组织的损害并促进肝细胞的再生。

由于肝脏由门静脉和肝动脉双重供血，并受肝动脉缓冲机制调节[13]，因此，不能忽视肝动脉血流变化对剩余肝组织的影响。有研究发现，切除大鼠约85%的肝脏后，剩余肝脏门静脉血流量增加40%，肝动脉的血流下降，使肝组织氧摄取量下降50%，大鼠的死亡率显著上升；而对脾脏进行切除，增加肝动脉血供，则可以改善大鼠的预后[14]。国内外很少同时对肝大部切除后肝动脉以及门静脉血流及其对肝细胞再生的影响进行研究，因此，本实验对肝硬化大鼠模型进行肝大部切除，建立不同的门静脉以及肝动脉血流，再研究剩余肝组织的功能以及肝脏再生，非常有实际应用意义。结果显示，在门静脉高灌注状态得到改善的基础上，增加肝动脉血流会促进肝功能的恢复，可能原因是肝动脉血流的增加提高了氧供。然而，如果门静脉高灌注状态得不到改善，增加肝动脉的血流并不能有效改善肝功能，说明此时门静脉高灌注带来的组织损害可能超过了肝动脉氧供增加带来的改善作用。因此，适当降低门静脉的流量，反射性地使动脉血供增加；或者主动增加肝动脉的供血量，对肝细胞的再生有促进作用。以干预入肝血流为主要手段的一些术式应用于临床已经证实可以取得较好的效果，例如活体肝移植后进行脾脏切除，既减少了门静脉的血流，又同时增加了肝动脉的血供[1]；选择性减断分流术既减轻了门静脉高灌注状态，降低了脾动脉的流量，又增加了肝动脉的流量，均促进了术后肝功能的恢复[7-8]。

不幸的是，越南的大象正在缓慢灭绝之中。与1980年的500头相比，现在仅剩不到50头大象了。如今，只有拥有象群的人还保留着这种传统，还在与大象保持互动。其实，我也正在跟一位越南民族学家共同撰写一本关于这个主题的书。

或许因为容易被忽视，很多时候，简单的事情往往很难做好，但事实上，它们产生的作用却不容小觑。参观中的几处细节，引起了我们的注意。在后道车间，我们看到了一台小设备，不起眼的外形却能代替据说至少约10个工人，其关键功能的设计由吴重蔚亲手操刀；再有，针对车间人员的工作台，简单的造型，却实用且占地小，可以显著提高工作效率，其同样出自吴重蔚之手。为方便客户查阅，栢科富翔还为每个客户、每个产品建立了档案。在资料室中，我们看到了一排排整齐排列的柜子，据介绍，里面保存了公司自成立以来所有印刷品资料。胶片、打样稿、客户签字意见、过程稿等等，都可以在这里进行查阅。

基于实验结果，我们认为肝硬化大鼠行肝大部切除后，通过纠正门静脉高灌注状态，适当增加肝动脉的血供，有利于术后肝功能恢复以及肝脏的再生。本实验使用大鼠肝硬化模型，和临床上较多肝癌患者具有肝硬化背景这一特征比较相符，有较好的临床指导意义。但是本实验也存在一些不足，并未能深入研究入肝血流造成剩余肝脏组织损害的具体机制，以及门静脉和肝动脉血流改建促进肝脏再生的机制。后续应该在此实验的基础上，研究入肝血流对肝脏超微结构的影响；研究不同入肝血流状态对肝脏氧供、耗氧的影响；在分子水平，研究入肝血流对剩余肝组织肝细胞代谢和再生的影响，并将研究结果用于临床，扩大临床肝大部切除手术的适应证和安全性。

为了确保计算方法的正确性，在对实测数据进行计算前，先用文献［1］提供的示例数据进行了验算：按照式（4）～式（9），可以计算文献［1］表B.1及表B.2的结果，但无法按照式（10）～式（14）计算出文献［1］表B.3的结果。本文直接用四参数坐标转换软件［7］进行计算，获得文献［1］示例数据的平面位置精度SXY =1.0 mm，文献［1］给出的结果SXY =1.1 mm。在计算时需要注意，文献［1］采用三参数进行坐标系旋转，自由度为51；文献［7］采用四参数进行坐标系旋转，自由度为39。

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