磁感应热疗技术是近年来发展的一种新型加温治疗恶性肿瘤的方法，具有利用金属磁性物质感应交变磁场而升温的物理特性，将其作为热介质引入肿瘤组织，在外加交变磁场的作用下升温并将热量传递给周围的肿瘤组织，在不损伤正常细胞的情况下杀死肿瘤细胞[1]。前期已有研究筛选了微米和纳米等多种介质[2]，确立了介质与蛋白质结合的技术，研制了交变磁场发生设备，并且通过脑胶质瘤、肝癌、乳腺癌等细胞和动物实验，证明了其安全性和有效性，并已经将磁感应热疗技术推向了临床试验[3-5]。恶性淋巴瘤是一组原发于淋巴结或其他淋巴组织的恶性肿瘤，是严重威胁人类健康和生命的恶性肿瘤之一。利妥昔单抗联合环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和波尼松（CHOP）化疗方案能明显改善患者预后，但治疗后仍可复发，且缓解持续时间缩短，并出现部分耐药的难治性患者，而其确切的耐药机制至今尚未阐明[6-7]。若利用高效升温的金属磁性材料，耦联利妥昔单抗与淋巴瘤细胞的特异性靶点结合，在交变磁场的作用下，使磁性介质感应升温实现靶向热疗，达到精确定位病灶，杀灭肿瘤细胞，协同增敏药物的目的，很可能成为治疗恶性淋巴瘤的新方法。本研究结合磁感应热疗和利妥昔单抗治疗两种手段，研究磁感应热疗联合利妥昔单抗作用于人淋巴瘤Daudi细胞的细胞毒性及其协同作用，并初步探讨其作用机制，旨在为磁感应热疗应用于恶性淋巴瘤治疗提供可行性参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

利妥昔单抗注射液（10 mg/ml）购自上海罗氏制药有限公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Hyclone公司；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒和细胞DNA含量（细胞周期）即时检测试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限公司。磁感应热疗仪购自深圳市双平电源设备有限公司；Flutemp Control FOT-301光纤测温装置购自西安和其光电科技有限公司；多功能读数仪-酶标仪购自美国Thermo Scientific公司；BD FACSCalibur型流式细胞分析仪购自美国BD公司。

1.2 细胞来源及培养

人淋巴瘤Daudi细胞株由北京协和细胞库提供。细胞在含有10%FBS、青霉素（100 U/ml）、链霉素（100 mg/L）的RPMI-1640培养基中悬浮生长，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。收集对数生长期的Daudi细胞用于实验。

1.3 生物相容性实验

1.3.1 空心球及浸提液的准备分别称取适量的空心不锈钢球粉末放于15 ml离心管中，用超纯水清洗3次，然后用分析级无水乙醇配制而成的75%乙醇溶液清洗3次后，将离心管置于超净台中，紫外线照射杀菌消毒30 min，然后用75%乙醇溶液浸泡过夜，第2天去除浸泡空心不锈钢球的乙醇，用无菌的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）清洗3次。清洗后的空心不锈钢球一部分备用，另一部分加入相应比例的含10%FBS的RPMI-1640培养基，使其浓度达到25、50、75、100 mg/m（l分别设为4个实验组），以不含空心不锈钢球粉末的含10%FBS的RPMI-1640培养基为对照，分别用封口膜封口，将离心管置于37℃恒温培养箱中浸提24 h。

1.3.2 细胞相容性检测取对数生长期Daudi细胞悬液，将细胞悬液浓度调整至5×104/ml，以每孔200 μl接种于96孔板中，将96孔板置入恒温培养箱中，在37℃、5%CO2环境中培养24 h。离心弃去96孔板中旧的培养基，4个实验组的细胞每孔加入200 μl相对应浓度的浸提液，而对照组细胞每孔加入200 μl新鲜的RPMI-1640培养基，置入恒温培养箱中，在37℃、5%CO2环境中分别培养24、48、72 h。采用CCK-8法检测细胞增殖抑制率，在96孔板的每孔中分别加入20 μl CCK-8工作液，在37℃、5%CO2浓度的培养箱中避光孵育2 h，在波长450 nm下使用酶标仪检测待测样品的光密度值（OD值），计算不同浓度空心不锈钢球浸提液对细胞相对增殖率的影响。细胞相对增殖率=（实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%。细胞毒性分级：0级，细胞相对增殖率≥100%，实验材料无细胞毒性；1级，细胞相对增殖率为75%～99%，实验材料无细胞毒性；2级，细胞相对增殖率为50%～74%，实验材料有轻度细胞毒性；3级，细胞相对增殖率为25%～49%，实验材料有中度细胞毒性；4级，细胞相对增殖率为1%～24%，实验材料有中度细胞毒性；5级，细胞相对增殖率为0%，实验材料有重度细胞毒性。

1.4 磁性介质升温性能的检测

采用流式细胞仪检测Daudi细胞的凋亡率，结果显示：磁感应组和利妥昔单抗组的Daudi细胞总凋亡率均明显高于正常组，差异均有统计学意义（P＜0.01）；联合组的Daudi细胞总凋亡率较磁感应组、利妥昔单抗组和正常组均明显增高，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（图4、表1）

1.5 不同浓度利妥昔单抗注射液抑制Daudi细胞的生长情况

本实验设实验组和对照组，实验组共5组，分别为培养基中加有12.5、25、50、100、200 μg/ml利妥昔单抗注射液，对照组为培养基中未加利妥昔单抗注射液（0 μg/ml），每一个浓度组设置5个复孔。取对数生长期的Daudi细胞，调整细胞浓度至1.9×104/ml，接种 于 96孔 板中，每孔 100 μl，在37℃、5%CO2的培养箱中避光培养24 h后，换含有上述利妥昔单抗注射液的药物培养基避光培养。培养24 h后，采用CCK-8法测定各组的OD值，计算各组Daudi细胞的增殖抑制率。细胞增殖抑制率=（对照组平均OD值-实验组平均OD值）/对照组平均OD值×100%。

（49）伏願神明如在，盻蠻來臨。鑒此際之精虔，削多生之罪對。（《北極真武佑聖真君禮文》，《中华道藏》30/587）

1.6 磁感应热疗联合利妥昔单抗对Daudi细胞增殖的影响

采用CCK-8法检测Daudi细胞的增殖抑制率，结果显示：以正常组细胞的增殖抑制率作为对照，设定为0，磁感应组细胞的增殖抑制率为（82.51±1.36）%，利妥昔单抗组细胞的增殖抑制率为（12.80±0.73）%，联合组细胞的增殖抑制率为（85.19±1.84）%；磁感应组、利妥昔单抗组、联合组细胞的增殖抑制率均明显高于正常组，差异均有统计学意义（P＜0.01），联合组细胞增殖抑制率高于磁感应组和利妥昔单抗组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

取对数生长期的Daudi细胞悬液接种于25 ml培养瓶中，按上述“1.6”中方法将Daudi细胞分为对照组、磁感应组、利妥昔单抗组、磁感应与利妥昔单抗联合组（联合组），培养24 h后收集细胞，按照Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒以及细胞周期即时检测试剂盒说明书处理后，采用流式细胞术检测各组Daudi细胞的凋亡情况以及各细胞周期所占比例。

1.7 流式细胞术检测Daudi细胞凋亡及细胞周期

（3）更好地设计研发计划的组成，成立欧洲创新理事会，加大对创新活动的支持，用新机构、新机制有效支持计划对各类创新行为的投入。

1.8 统计学分析

在300 kHz、40 Gs的交变磁场下，45、60、75 mg的空心不锈钢球经过30 min升温后，温度分别可达到40、43、47℃，并且随着空心不锈钢球质量的增加，温度也相应的升高。研究表明，43℃时是人体能够耐受且能对肿瘤组织产生热杀伤作用的温度[8]，因此本实验选取60 mg空心不锈钢球作为本实验的磁性介质。（图2）

2 结果

2.1 生物相容性检测

Daudi细胞分别与 0、25、50、75、100 mg/ml浓度的空心不锈钢球培养基浸提液共孵育24、48、72 h，CCK-8法检测细胞增殖率，结果显示：随着浸提液浓度的增加以及共孵育时间的延长，Daudi细胞的相对增殖率多会随之下降，但是均在75%以上，各组磁性介质均表现为0级或1级细胞毒性。（图1）

图1 不同共孵育时间、不同浓度空心不锈钢球浸提液处理后Daudi细胞的相对增殖率

2.2 磁性介质升温性能的检测

采用SPSS 20.0统计-软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，相容性以及细胞增殖率实验图表使用GraphPad Prism软件分析作图。以P＜0.05为差异有统计学意义。

图2 不同质量空心不锈钢球的升温曲线

2.3 不同浓度利妥昔单抗对Daudi细胞增殖的抑制情况

采用CCK-8法测定Daudi细胞的增殖抑制率，结果显示：随着利妥昔单抗浓度的增加，Daudi细胞的增殖抑制率随之增加。当药物浓度为100 μg/ml时，增殖抑制率增加缓慢，达到效应平台，因此，选取100 μg/ml作为本实验的工作浓度。（图3）

图3 不同浓度利妥昔单抗对Daudi细胞的增殖抑制情况

2.4 磁感应热疗联合利妥昔单抗对Daudi细胞增殖的抑制情况

取对数生长期的Daudi细胞，调整细胞浓度至1.8×104/ml。将Daudi细胞分为4组：正常组，只含等量溶媒；磁感应组，加入磁性介质；利妥昔单抗组，加入利妥昔单抗使药物浓度为100 μg/ml；磁感应与利妥昔单抗联合组（联合组），加入磁性介质和利妥昔单抗，利妥昔单抗药物浓度为100 μg/ml，每组设5个复孔。磁场参数为300 kHz、40 Gs，在磁场放置30 min后，再放回37℃、5%CO2培养箱中孵育24 h。采用CCK-8法测定各组细胞的增殖抑制率。

2.5 磁感应热疗联合利妥昔单抗对Daudi细胞凋亡的影响

用电子天平精密称量45、60、75 mg空心不锈钢球，并分别置于25 ml EP培养瓶中，加入5 ml含10%FBS的RPMI-1640培养基，在瓶盖处打小孔，插入测量温度的测温光纤，测温光纤的头部探测器插入空心不锈钢球的中心位置，将培养瓶置于300 kHz、40 Gs的交变磁场下，用测温软件记录培养基温度随加热时间的变化，并做升温曲线图。

图4 不同组别Daudi细胞的凋亡情况

注：左下方象限所示为正常Daudi细胞，左上方象限所示为细胞碎片，右上方象限所示为早期凋亡的细胞，右下方象限所示为晚期凋亡以及坏死的细胞

表1 不同组别、不同状态Daudi细胞所占比例的比较（%，±s）

注：a与正常组比较，P＜0.01；b与联合组比较，P＜0.01

组别正常组磁感应组利妥昔单抗组联合组83.05±4.57 58.36±1.91a 79.56±1.70 46.09±1.96a 12.87±3.66 5.40±1.92a 4.81±0.65a 3.79±1.34a 6.00±0.85 36.25±0.18a b 15.63±1.55a b 50.12±0.72a活细胞 细胞碎片 总凋亡细胞

2.6 磁感应热疗联合利妥昔单抗对Daudi细胞周期的影响

流式细胞仪分析结果显示：与正常组比较，磁感应组S期Daudi细胞所占比例增加，G0/G1期细胞所占比例减少，差异均有统计学意义（P＜0.01）；利妥昔单抗组G0/G1期、S期及G2/M期细胞所占比例与正常组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；而联合组S期细胞与正常组相比所占比例增多，G0/G1和G2/M期细胞所占比例减少的趋势和磁感应组一致，但程度更大。（表2）

表2 不同组别Daudi细胞中各期细胞所占比例的比较（%，±s）

注：*与正常组比较，P＜0.01

组别正常组磁感应组利妥昔单抗组联合组38.1±1.4 25.9±2.3*38.4±0.5 19.5±1.0*36.5±1.4 52.1±2.1*33.7±1.5 67.6±1.6*25.4±2.7 22.0±0.6 27.9±2.1 12.9±2.1*G0/G1期S期G2/M期

3 讨论

嘉庆每日早起洗漱之后，别的事放在—边，恭敬端坐，阅读先朝《实录》—卷，除巡狩斋戒外，天天如此，寒暑不间。

热疗已经被广泛应用于肿瘤治疗领域，正常组织由于具有良好的血运，在40～42℃时不会受到损伤，而肿瘤组织的血管排列杂乱，散热不良，肿瘤组织局部温度达到43～45℃时肿瘤细胞便会受到损伤，短时间内死亡。本研究结果表明，利妥昔单抗注射液在体外对Daudi细胞表现出较弱的增殖抑制作用，单独磁感应热疗对Daudi细胞表现出较明显的增殖抑制作用，磁感应热疗与利妥昔单抗注射液联合应用能够增强对Daudi细胞增殖的抑制作用。本研究中流式细胞术检测结果表明，单独磁感应热疗及单纯应用利妥昔单抗注射液均可以诱导Daudi细胞凋亡，进而抑制肿瘤细胞生长；而磁感应热疗与利妥昔单抗联合应用时Daudi细胞的总凋亡率明显高于磁感应热疗和利妥昔单抗注射液单独应用，表明磁感应热疗能够协同利妥昔单抗注射液促进Daudi细胞凋亡。多项研究表明，高热能使细胞膜的流动性和通透性增强，便于化疗药物进入肿瘤细胞，增强了肿瘤细胞对化疗药物的敏感度。此外，高热还能刺激机体的免疫系统，在提高机体免疫能力的同时起到抑制肿瘤扩散的效果[9]。Wang等[10]研究发现，磁感应热疗不仅能够抑制局部肿瘤生长，还能够对未处理侧的肿瘤产生生长抑制作用，实验表明磁感应热疗能够刺激含肉瘤的大鼠产生较强烈的内源性免疫反应，从而有效提高机体抗肿瘤作用。

随着生物医学技术的发展，恶性淋巴瘤患者的长期生存率有所提高，但仍有约三分之一的患者产生耐药、复发、转移的现象，成为恶性淋巴瘤患者死亡的主要原因，因此寻找新的治疗方式具有重要意义。本研究采用体外细胞实验的方式进行实验研究，属于理论性基础实验，能够为临床提供依据。本研究首先对磁感应热疗磁性介质进行了生物相容性实验以及升温性能检测，证明了空心不锈钢球具有良好的发热效率以及细胞相容性，磁感应热疗磁性介质应用于淋巴瘤治疗在细胞水平是可行的。

利妥昔单抗的作用机制至今未被完全阐明，其针对CD20抗原表达阳性的恶性B淋巴细胞的杀伤效应包括补体依赖的细胞毒性（complement dependent cytotoxicity，CDC）、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）和诱导B淋巴瘤细胞凋亡的作用[11]。本实验利用CCK-8法检测Daudi细胞增殖抑制率的结果可以看出，随着利妥昔单抗浓度的增加，细胞增殖抑制率也随之增加，当利妥昔单抗浓度为100 μg/ml时，细胞的增殖抑制率增加缓慢，达到效应平台。根据目前利妥昔单抗联合化疗治疗弥漫型大B细胞淋巴瘤的临床观察，常规化疗（如烷化剂、抗肿瘤激素类药物、蒽环类药物、抗肿瘤动植物成分药物、嘌呤类似物）联合干扰素或单克隆抗体（如利妥昔单抗），常可获得较高的临床缓解率，但其后仍然有部分患者复发，且缓解持续时间缩短，并出现耐药，而其确切的耐药机制至今尚未阐明，故恶性淋巴瘤需要新的治疗方案进一步改善临床疗效。

细胞周期是经历G1期、S期、G2期、M期4个阶段并形成新的DNA及细胞分裂增殖的过程。肿瘤治疗可以通过干扰肿瘤细胞的细胞周期，阻断细胞周期中DNA合成及细胞分裂，进而引起细胞凋亡。处理因素不同，不同的细胞株凋亡有其特异的细胞周期变化。细胞分裂周期中处于S期的细胞和肿瘤中心部位的那些因缺血缺氧、营养状态差的细胞常常成为化疗后复发的根源，而这些细胞对高热敏感；高热还能对肿瘤细胞的DNA、RNA和蛋白质的合成产生抑制作用，因此高热能够抑制肿瘤细胞的增殖和转移。本实验对细胞周期的检测结果显示，磁感应组的S期细胞增多，G0/G1期细胞减少，表明磁感应热疗能够改变Daudi细胞的细胞周期，使Daudi细胞的细胞周期阻滞于S期，阻止了细胞的进一步分裂；利妥昔单抗组各细胞周期细胞所占比例与正常组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），说明利妥昔单抗注射液对Daudi细胞周期的改变不明显；而联合组细胞周期的改变与磁感应组基本一致，并且S期细胞所占比例更高。磁感应热疗对S期细胞的干预或许是引起Daudi细胞凋亡的机制之一。

那么，是不是没有症状的息肉就可以不用治疗呢？有的息肉生长缓慢，没有明显的症状，也不会癌变，可以定期肠镜检查，不一定要切除，例如，增生性息肉的癌变率就很低。还有一些息肉，特别是腺瘤性息肉，应尽早治疗，进行肠镜下摘除，防止癌变。

综上所述，磁感应热疗与利妥昔单抗注射液联合应用，可增强对淋巴瘤细胞株Daudi的增殖抑制作用并促使细胞凋亡，联合应用时的效果与单独使用利妥昔单抗的效果有明显差异，表明磁感应热疗与利妥昔单抗注射液有协同增敏的效果，为淋巴瘤的治疗提供了新的思路。诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞可能是磁感应热疗抑制肿瘤生长的机制之一，其他的作用机制尚需进一步深入探讨。

蓝宝石因其通透的深蓝色而得到“天国之石”的美称，早在古埃及、古希腊和古罗马，蓝宝石就被用来装饰清真寺、教堂和寺院，并作为宗教仪式的贡品。高贵纯净的蓝色光芒也让蓝宝石被尊崇为圣职者佩戴的不二选择。

但她何以这样的像她呢？这个容态，还保留十四岁时候的余影，难道就是她自己吗？她为什么不会到上海来呢？是她！天下有这样容貌完全相同的人吗？不知她认出了我没有……我应该问问她了。

参考文献

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