食管癌（esophageal carcinoma，EC）属于十分常见的消化系统恶性肿瘤之一，多发生于食管上皮，发病隐匿，患者早期无典型的临床症状，因此，80%以上的EC患者确诊时已经进展至晚期阶段，从而严重影响了患者的预后[1]。目前，关于食管鳞癌的发病机制尚不明确，且患者的早期症状不典型，从而为临床诊断和治疗带来较大的困难[2]。与其他恶性肿瘤发生、发展的病理过程一样，EC的进展也是一个涉及多因素、多基因突变的复杂过程。有研究显示，EC组织分子水平的改变早于临床表现的出现，因此，早期诊断和干预对逆转食管鳞状上皮低级别上皮内瘤变、降低EC的发病率十分重要[3]。其中，抑癌基因甲基化属于表观遗传学的范畴，与肿瘤的发生、发展密切相关，是近几年的研究热点[4]。PCDH8基因属于非聚集性原钙黏蛋白（protocadherin，PCDH）基因家族的成员之一，在很多肿瘤组织中的表达水平较低，且启动子发生甲基化，被认为是一种候补抑癌基因[5]。目前，关于PCDH8基因在EC组织中的表达情况尚无确切的研究，因此，本研究通过分析EC患者PCDH8基因启动子甲基化的异常表达情况，为EC的早期诊断和治疗提供新的靶点，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013年11月至2017年10月西安交通大学第二附属医院和陕西省人民医院病理科保存的74例EC患者的EC组织标本及其相应的癌旁（距肿瘤组织边缘≥5 cm）正常组织标本。全部患者均有完整的临床资料，均经内镜和病理组织学检查确诊，且术前均未行化疗及放疗；排除合并慢性肾病、肾功能不全等疾病的患者。74例EC患者中，男41例，女33例；年龄为33～77岁，平均年龄为（54.42±7.36）岁；TNM分期：Ⅰ期19例，Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期27例；世界卫生组织（World Health Organization，WHO）组织学分级：Ⅰ级16例，Ⅱ级25例，Ⅲ级33例。

1.2 仪器与试剂

Allegra TM64R型台式高速冷冻离心机购自德国Beckman公司，OLYMPUS CX41倒置光学显微镜购自日本奥林巴斯公司，DJ-3005电子分析天平购自日本SHINKO公司，DK-SD恒温水浴摇床购自上海医用恒温设备厂，Mastercycler ep realplex全自动荧光定量PCR仪购自德国Eppendorf公司，HWA-50D恒温水浴锅购自韩国Autonics公司，UV-8000紫外分光光度计购自上海精密仪器仪表公司。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，免疫组化试剂盒、浓缩型DAB试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，DNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒、荧光定量PCR试剂盒均购自日本Takara公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供，抗PCDH8单克隆抗体购自日本Santa Cruz Biotechnology公司。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组织化学染色法按照试剂盒说明书的实验步骤进行操作。①按照病理编号调出西安交通大学第二附属医院和陕西省人民医院病理科存档的石蜡包埋组织切片，脱蜡水化后，切片，置于载玻片上，烘干48 h后待用；②抗原热修复；③灭活内源性过氧化物酶；④封闭；⑤加入一抗孵育；⑥加入二抗孵育；⑦滴加二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）试剂显色；⑧苏木精复染；⑨将染色后的病理切片置于400倍视镜下观察，PCDH8位于细胞膜上，随机选择10个视野，观察细胞的阳性表达情况。

溯江而下，江面的水产养殖，一度成为生态公害。珍珠、渔业这些新兴产业给村民带来财富的同时，也付出着昂贵的生态代价。

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验和Fisher确切概率法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

MSP检测结果显示，EC组织中PCDH8基因启动子甲基化率为87.8%（65/74），明显高于癌旁正常组织的 16.2%（12/74），差异有统计学意义（χ2=76.044，P＜0.01）。

PCDH8蛋白的高表达与EC患者的年龄、性别、肿瘤直径、TNM分期、WHO组织学分级和淋巴结转移情况均无关（P＞0.05）。（表1）

PCDH8基因启动子的甲基化率与EC患者的年龄、性别、肿瘤直径、WHO组织学分级、淋巴结转移均无关（P＞0.05），但是PCDH8基因启动子的甲基化率与EC患者的TNM分期有关（P＜0.05）。（表2）

想要促进成都市会展旅游行业的发展，首先就要加大对成都市整体形象的营销宣传力度。政府要联合会展行业有关部门和旅游行业有关部门积极参与城市整体形象的宣传，并给予人员、资金等方面的支持。城市的整体宣传和会展旅游的行业宣传是密不可分的，只有在城市的整体宣传中体现城市会展旅游行业的先进性，在会展旅游行业的宣传中体现城市的新风貌，才能实现相辅相成、互相促进的良性局面，让游客对成都市产生较好的整体印象。

1.4 结果判定标准

1.4.2 MSP结果判断甲基化阳性：甲基化引物扩增阳性，非甲基化引物扩增阳性/阴性；非甲基化阳性：甲基化引物扩增阴性，非甲基化引物扩增阳性。

1.4.1 免疫组化结果判定PCDH8蛋白阳性表达于细胞膜，染色呈棕黄色。①根据阳性细胞所占比例评分：阳性细所占比例为0，计0分；阳性细所占比例≤25%，计1分；阳性细所占比例为26%～50%，计2分；阳性细所占比例为51%～75%，计3分；阳性细所占比例＞75%，计4分。②根据细胞染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。根据染色指数（labeling index，LI）判定结果。LI=阳性细胞所占比例评分×细胞染色强度评分。将总分数分为1～4级：0～1分为 1级，2～4分为2级，5～8分为 3级，9～12分为 4级。1级和2级为PCDH8蛋白低表达，2级和3级为PCDH8蛋白高表达。

信息化时代背景下，建筑工程设计管理中信息化管理方式的运用和信息化管理水平的提升依赖于性能可靠的管理平台。因此，在向建筑工程设计管理提供所需的管理平台时，应考虑BIM的应用。具体表现为：运用BIM对建筑工程设计进行管理时，可通过对计算机网络和信息技术的科学使用，搭建工程设计管理平台，并在该平台的支持下，对建筑工程设计数据进行安全控制，使最终得到的工程设计方案具有良好的适用性，满足现代建筑工程设计方面的科学管理要求。

1.5 统计学方法

1.3.2 组织DNA提取将组织切片脱蜡水化后，置于EP管中；加入150 μl的丙酮酸脱氢酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK）缓冲液和10 μl的蛋白酶K振荡混匀，置于56℃恒温水浴锅中15 min，80℃恒温水浴锅中15 min；采用盐析法提取DNA。

2 结果

2.1 EC组织和癌旁组织中PCDH 8蛋白的表达情况

癌旁组织中可见大量细胞的细胞膜被染成黄色，而EC组织中基本未见阳性染色（图1）。EC组织中的PCDH8蛋白的高表达率为28.4%（21/74），明显低于癌旁正常组织的64.9%（48/74），差异有统计学意义（χ2=19.793，P＜0.01）。

图1 癌旁组织和EC组织中PCDH 8蛋白的表达情况（免疫组织化学染色，×400）

2.2 EC组织和癌旁组织中PCDH 8基因启动子的甲基化状态

首先，寻找现场光源。即便在弱光环境下依然会有些许高光区域，利用画面之中的最亮部分进行对焦。其次，寻找对比度高的边界进行对焦。当下不少数码相机依然使用对比检测方式进行对焦，所以在对焦时寻找对比度高的边界，可以发挥相机的优势。最后，利用相机的中心对焦点进行对焦。一般相机的中心对焦点都是对焦能力最强的地方，关闭自动选择对焦物体模式，而采用中心点的单点对焦模式，先对焦再构图，可以加大对焦的成功率。

2.3 PCDH 8蛋白表达情况与EC患者临床特征的关系

1.3.3 DNA重亚硫酸氢盐修饰及纯化按照试剂盒说明书的实验步骤进行操作。取2 μl DNA加入去离子水稀释至18 μl，加入2 μl 3 mol/L的氢氧化钠溶液，混匀，37℃孵育15 min；加入4.8 mol/L的重亚硫酸钠 278 μl和100 mmol/L 的对苯二酚2 μl，56℃孵育4 h，将标本除盐后加入3 mol/L的氢氧化钠溶液22 μl，37℃孵育 15 min。最后，将所得DNA经醋酸钠和乙醇沉淀后，加入20 μl的TE溶液溶解。

2.4 PCDH 8基因启动子甲基化率与EC患者临床特征的关系

1.3.4 甲基化特异性PCR 采用甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific polymerase chain reaction，MSP）检测PCDH8基因启动子的甲基化状态。将 21 μl的反应体系（Taq Mix10 μl+cDNA模板 2 μl+上下游引物各 1 μl+RNase-fress水 7 μl）按程序扩增：95℃3 min预变性；95℃30 s变性，60℃30 s退火，72℃5 min延伸，循环40次。引物序列如下，β-actin，334 bp，上游引物：5'-TGGCGATGGCAGTGTCTTAG-3'；下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；甲基化 PCDH8，156 bp，上游引物：5'-CTTATAAAGGTAAAGGCGGC-3'；下游引物：5'-AAA TCAGGCTCATTACGAAC-3'；非甲基化PCDH8，156 bp，上游引物：5'-GGTTAGAAAGGTAAAGGTGG-3'；下游引物：5'-AAAATCACACTCTTTACAAA-3'。

表1 不同临床特征EC患者EC组织中PCDH 8蛋白的表达情况（ n=74）

临床特征年龄（岁）＜55≥55性别例数PCDH蛋白[n（%）]高表达 低表达 χ2值0.012 P值0.911 38 36 11（28.9）10（27.8）27（71.1）26（72.2）0.1090.742男女41 33 11（26.8）10（30.3）30（73.2）23（69.7）肿瘤直径（cm）＜2 2～4＞4 TNM分期34 29 11 10（29.4）7（24.1）4（36.4）24（70.6）22（75.9）7（63.6）0.6200.734 0.0610.970ⅠⅡⅢ～ⅣWHO组织学分级19 28 27 5（26.3）8（28.6）8（29.6）14（73.7）20（71.4）19（70.4）0.1520.927ⅠⅡⅢ16 25 33 4（25.0）7（28.0）10（30.3）12（75.0）18（72.0）23（69.7）淋巴结转移0.2290.632有无32 42 10（31.2）11（26.2）22（68.8）31（73.8）

表2 不同临床特征EC患者EC组织中PCDH 8基因的甲基化情况（ n=74）

注：*表示采用Fisher确切概率法

临床特征年龄（岁）＜55≥55性别例数 甲基化[n（%）]非甲基化[n（%）]χ2值0.007 P值0.931 38 36 34（89.5）31（86.1）4（10.5）5（13.9）0.0001.000男女41 33 36（87.8）29（87.9）5（12.2）4（12.1）肿瘤直径（cm）＜2 2～4＞4 TNM分期0.133*34 29 11 27（79.4）27（93.1）11（100.0）7（20.6）2（6.9）0（0）10.4990.005ⅠⅡⅢ～ⅣWHO组织学分级19 28 27 13（68.4）25（89.3）27（100.0）6（31.6）3（10.7）0（0）0.174*ⅠⅡⅢ16 25 33 12（75.0）22（88.0）31（93.9）4（25.0）3（12.0）2（6.1）淋巴结转移0.0790.778有无32 42 29（90.6）36（85.7）3（9.4）6（14.3）

3 讨论

食管癌是临床上较为常见的、病死率较高的消化系统恶性肿瘤之一，发病人群的年龄范围较大，以鳞状细胞癌为主，近年来，在中国，其发病率呈逐年上升趋势[6]。由于EC发病早期缺乏典型的临床表现，而且有研究显示其分子水平的改变，包括癌基因的激活、抑癌基因的失活、信号转导通路的调控等早于临床表现，因此，早期诊断和干预对于逆转食管鳞状上皮低级别上皮内瘤变、降低EC的发病率、改善EC患者的预后具有十分重要的临床价值[7-8]。近几年，表观遗传学与肿瘤发生机制之间的关系研究一直是热点，它与遗传学改变不同的是，核苷酸序列未发生变化，而是通过DNA甲基化、染色体重构和组蛋白去乙酰化等调控基因的表达，参与机体的病理、生理过程[9-10]。其中，DNA甲基化在肿瘤的调控过程中发挥着重要的作用，通过抑制抑癌基因的表达，促使肿瘤细胞增殖、侵袭等。因此，抑癌基因的甲基化为肿瘤的治疗提供了新的潜在靶点[11-12]。

PCDH家族是目前神经系统领域研究较为深入的细胞黏附分子家族，但是其与肿瘤的相关性研究尚少[13]。PCDH8属于非聚集性PCDHδ2基因家族的成员之一，它除了具有神经系统的特异性细胞黏附功能外，与胃癌、鼻咽癌、膀胱癌等肿瘤的发生也密切相关[14-15]。但是，目前关于PCDH8基因与EC关系的研究较少，而本研究主要探讨了PCDH8蛋白表达和基因启动子区域甲基化水平与EC患者临床特征的关系，为EC发病机制以及治疗方法的研究提供了新的方向。本研究结果显示，EC组织中PCDH8蛋白的高表达率明显低于癌旁正常组织（P＜0.01），但是未发现与患者年龄、性别、肿瘤直径、TNM分期、WHO组织学分级以及淋巴结转移有关。通过分子学水平研究发现，EC组织中PCDH8基因启动子甲基化率明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义（P＜0.01），且与EC患者的TNM分期有关（P＜0.05）。

提示PCDH8基因启动子区域甲基化可能发生在EC的整个疾病进展阶段，是EC发生、发展的一个重要危险因素和预测指标。本研究由于纳入的样本量偏少或者病理组织保存时间过长，未发现PCDH8蛋白与EC患者临床特征的关系以及PCDH8基因甲基化与淋巴结转移的关系，需要进一步探讨。

综上所述，PCDH8蛋白和基因在EC组织中的表达情况，可能与基因启动子区域甲基化有关，可作为EC诊断和治疗的新靶点。

在研究过程中还发现，通过不同的秸秆覆盖，度光辐射的吸收转化以及热量传导同样会产生一定的影响。在进行秸秆覆盖之后，可以有效的防治太阳的直接辐射，同时也减少了土壤中热量向大气中散发的现象。因此，通过秸秆覆盖技术可以更好的将土壤温度控制在一个较为缓和的变化范围之内，减少由于地面温度的急剧变化而对作物产生伤害，为作物的生长提供更加有力的条件。

参考文献

[1]Testa U, Castelli G, Pelosi E. Esophageal cancer: genomic and molecular characterization, stem cell compartment and clonal evolution[J]. Medicines (Basel), 2017, 4(3): 67.

[2]Takahiro T, Junki M, Kazuki S, et al. Risk factors for esophageal fistμla associated with chemoradiotherapy for locally advanced unresectable esophageal cancer: a supplementary analysis of JCOG0303[J]. Medicine, 2016, 95 (20): e3699.

[3]Kuwano H,Nishimura Y,Oyama T,et al.Guidelines for diagnosis and treatment of carcinoma of the esophagus april 2012 edited by the japan esophageal society[J].Esophagus,2015,12(1):1-30.

[4]Zong Z,Pang H,Yu R,et al.PCDH8 inhibits glioma cell proliferation by negatively regμlating the AKT/GSK3β/βcatenin signaling pathway[J].Oncol Lett,2017,14(3):3357-3362.

[5]石宇良,曾泉,龙表利,等.PCDH8基因表达对鼻咽癌细胞生物学效应的影响[J].第三军医大学学报,2013,35(14):1455-1458.

[6]Liang H,Fan JH,Qiao YL,et al.Epidemiology,etiology,and prevention of esophageal squamous cell carcinoma in China[J].Cancer Biol Med,2017,14(1):33-41.

[7]Marzese DM,Hoon DS.Emerging technologies for studying DNA methylation for the molecμlar diagnosis of cancer[J].Expert Rev Mol Diagn,2015,15(5):647-664.

[8]Mikeska T,Craig JM.DNA methylation biomarkers:cancer and beyond[J].Genes(Basel),2014,5(3):821-864.

[9]Yannick D,Pierre C,Cho WC,et al.DNA methylation and cancer diagnosis[J].Int J Mol Sci,2013,14(7):15029-15058.

[10]Zhao MT,Rivera RM,Prather RS.Locus-specific DNA methylation reprogramming during early porcine embryogenesis[J].Biol Reprod,2013,88(2):48.

[11]Nagata H,Kozaki KI,Muramatsu T,et al.Genome-wide screening of DNA methylation associated with lymph node metastasis in esophageal squamous cell carcinoma[J].Oncotarget,2017,8(23):37740-37750.

[12]Li L,Choi JY,Lee KM,et al.DNA methylation in peripheral blood:a potential biomarker for cancer molecμlar epidemiology[J].J Epidemiol,2012,22(5):384-394.

[13]Zhang C,Peng Y,Yang F,et al.PCDH8 is frequently inactivated by promoter hypermethylation in liver cancer:diagnostic and clinical significance[J].J Cancer,2016,7(4):446-452.

[14]Lin YL,Wang YL,Ma JG,et al.Clinical significance of protocadherin 8(PCDH8)promoter methylation in nonmuscle invasive bladder cancer[J].J Exp Clin Cancer Res,2014,33(1):68.

[15]Zhang P, Wang H, Wang J, et al. Association between protocadherin 8 promoter hypermethylation and the pathological status of prostate cancer[J]. Oncol Lett, 2017, 14(2): 1657-1664.