结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，多发生于乙状结肠与直肠交界处[1]。临床治疗结肠癌主要以手术切除为主，放化疗结合为辅。腹腔镜手术是近几年出现的治疗结直肠癌的新技术，可以有效提高手术效率，但腹腔镜术后复发转移仍是导致结肠癌患者治疗失败和死亡的重要原因，严重威胁着人类的生命健康和安全[2]。相关研究表明，癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CAE）与结肠癌患者的临床特征密切相关，是评估患者预后及判断疗效的常用生物标志物[3]。Kou等[4]研究发现，多种微小RNA（microRNA，miRNA）在结肠癌组织中存在差异表达，参与结肠癌的发生、发展。但CAE和miRNA-335-5p能否作为有效的生物标志物应用于结肠癌的临床治疗及复发转移监测目前尚不清楚。本研究通过检测结肠癌患者血清中miRNA-335-5p、CEA的表达水平，探讨其与结肠癌腹腔镜术后复发转移的关系，旨在为将miRNA-335-5p、CEA应用于临床监测结肠癌腹腔镜术后复发转移提供一定的理论依据。

通过一定人事制度改革，采用灵活的师资用人模式，吸引企业专家、校外学生创业典型、大学生创业大赛得奖选手等参与到大学生创新创业教育教师团队中。一方面鼓励专业课教师参加创业指导培训，承担相应课程；另一方面，作为创业导师的重要补充，可以邀请一些具有创业经验的企业精英或者政府创业中心的专业人员来指导创业实践。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年10月至2015年1月辽河油田总医院收治的行腹腔镜根治手术的结肠癌患者为结肠癌组。纳入标准：①均经术后病理学检查确诊为结肠癌且均为首次确诊；②结肠单部位病变，无远处转移；③术前未接受放化疗；④临床及随访资料完整。排除标准：①非首次确诊的结肠癌患者；②有结肠多部位病变及肠息肉、结肠炎等疾病者；③合并其他恶性肿瘤者；④有自身免疫性疾病者。根据纳入和排除标准，结肠癌组共纳入患者96例。另外，选取同期于本院行体检的健康体检者30例为对照组。其中结肠癌组男49例，女47例；平均年龄（59.87±8.52）岁。对照组男16例，女14例；平均年龄（60.17±9.10）岁。两组的年龄、性别比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 仪器与试剂

Trizol试剂购自日本Takara公司，MystiCq®microRNA qPCR Assay Primer购自美国Sigma公司，AceQ qPCR SYBR®Green Mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司，Anti-Carcino Embryonic Antigen CEA购自英国Abcam公司，酶联免疫吸附（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）CEA试剂盒购自郑州博赛生物技术研究所，实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）引物由上海生工生物公司合成；qRT-PCR仪、MODEL550型酶标仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 血清标本采集分别于手术当日和体检当日采集结肠癌患者和健康对照者的空腹静脉血5 ml，采用抗凝管保存，离心后收集上清，于-20℃保存待测。

1.3.3 ELISA法检测血清CEA蛋白表达水平采用ELISA法检测结肠癌组和对照组的血清CEA蛋白表达水平，具体操作严格按照ELISA试剂盒说明进行。

1.3.2 qRT-PCR法检测miRNA-335- 5 p水平采用qRT-PCR检测血清miRNA-335-5p水平。Trizol法提取血清总RNA，采用反转录试剂盒以RNA为模板进行反转录得cDNA。采用定量PCR仪（Bio-Rad）对miRNA-335-5p进行扩增（表1）。反应体系：10µmol/L引物各 0.4µl，SYBR®Green Mix 5µl，50 ng/µl cDNA 1µl，ddH2O 3.2µl，共10µl。反应条件：95℃ 90 s；95℃30 s，62℃30 s，72℃20 s，共40个循环。以U6为内参基因，采用相对定量法，用 2-ΔΔCt计算 miRNA-335-5p的表达水平。

表1 qRT-PCR的引物序列

基因miRNA-335-5p正向引物反向引物U6正向引物反向引物引物序列5′-ACGCTCAGTTTAATGCTAATCGTGA-3′5′-ATTCCATGTTGTCCACTGTCTGTG-3′5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′

根据临床护理方式不同将160例研究对象分为参照组、综合组两组。参照组80例预防接种儿童中男、女比例为48:32,患者年龄在1岁~6岁间,年龄均值为(3.21±0.65)岁,接种麻风、乙肝、百白破、甲肝疫苗儿童例数分别为18、21、22、19;综合组80例预防接种儿童中男、女比例为49:31,患者年龄在1岁~6岁间,年龄均值为(3.29±0.54)岁,接种麻风、乙肝、百白破、甲肝疫苗儿童例数分别为17、21、23、19。对比参照组、综合组两组预防接种儿童的基本资料可知无显著差异,P>0.05,有临床可比性。

结肠癌具有高复发率、高病死率等特点，其发生与少纤维、多脂肪的饮食习惯密切相关[5]。随着人口老龄化，饮食结构及饮食习惯的改变，中国结肠癌的发病率和病死率均逐年上升。近年来，结肠癌的诊断和治疗方法已取得很大进步，但结肠癌患者的病死率仍然很高，其中术后复发转移是影响结肠癌患者预后的主要因素。因此，寻找有效生物指标以监测结肠癌术后复发转移成为临床上亟需解决的问题。

血清miRNA-335-5p表达与结肠癌患者的AJCC分期、组织分化程度有关（χ2=12.71、8.90，P＜0.05）；血清CEA表达与结肠癌患者的AJCC分期、组织分化程度有关（χ2=16.64、21.73，P＜0.05）；血清miRNA-335-5p、CEA表达均与结肠癌患者的性别、年龄、肿瘤直径、阳性淋巴结数目无关（P＞0.05）。（表3）

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0统-计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验；采用Spearman秩检验分析结肠癌患者血清中miRNA-335-5p与CEA表达的相关性；采用COX回归模型分析影响结肠癌患者腹腔镜术后复发转移的独立危险因素。采用GraphPad Prism分析miRNA-335-5p、CEA不同表达水平结肠癌患者的术后复发转移率，Log-rank法比较miRNA-335-5p、CEA不同表达水平结肠癌患者的术后转移复发率。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清miRNA-335- 5 p、CEA表达情况的比较

由于各个因素对猕猴桃酒感官品质的影响程度不同，权重向量设置为外观（0.1）、色泽（0.1）、香气（0.3）、滋味（0.5），得到权重集为 A={a1，a2，a3……an}（0.1，0.1，0.3，0.5）。

miRNA-335-5p低表达结肠癌患者的术后2年复发转移率为35.06%，高于miRNA-335-5p高表达患者的5.26%，差异有统计学意义（χ2=5.818，P＜0.05）；CEA高表达结肠癌患者的术后2年复发转移率为36.62%，明显高于CEA低表达患者的8.00%，差异有统计学意义（χ2=6.977，P＜0.01）。（图1、图2）

表2 对照组和结肠癌组血清miRNA-335- 5 p、CEA表达水平的比较（±s）

组别对照组（n=30）结肠癌组（n=96）t值P值miRNA-335-5p/U6 2.39±0.61 0.79±0.16 23.425 0.000 CEA（ng/ml）3.89±0.71 6.79±1.16 12.936 0.000

2.2 血清miRNA-335- 5 p、CEA表达与结肠癌患者临床特征的关系

1.3.5 随访腹腔镜术后1个月，采用门诊复查的方式对所有结肠癌患者进行为期2年的随访，随访日期截至2017年1月31日。随访期间，每6个月进行1次肠镜、腹部CT或B超、胸部X射线检查，以评估患者是否出现复发转移。随访均以不影响患者生活及治疗为前提。

96例结肠癌患者中，77例患者的血清miRNA-335-5p呈低表达，低表达率为80.2%（77/96）；71例患者的血清CEA呈高表达，高表达率为74.0%（71/96）。结肠癌组患者的血清miRNA-335-5p表达水平明显低于对照组，血清CEA表达水平明显高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表2）

表3 不同临床特征结肠癌患者血清miRNA-335- 5 p、CEA的表达情况（ n=96）

临床特征性别例数miRNA-335-5p高表达 低表达CEA高表达 低表达男女49 47 8 11 41 36 37 34 12 13年龄（岁）＜60≥60肿瘤直径（cm）＜5≥5 AJCC分期Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ组织分化程度低分化中高分化阳性淋巴结数目＜4≥4 37 59 7 12 30 47 27 44 10 15 43 53 1132 45 29 42 14 11 55 41 8 4 1 51 26 32 39 23 2 39 57 5 2 1 7 37 40 19 52 20 5 57 39 13 6 44 33 39 32 18 7

2.3 结肠癌患者血清中miRNA-335- 5 p、CEA表达的相关性分析

Spearman秩检验分析结果显示：结肠癌患者血清中miRNA-335-5p与CEA的表达呈负相关（r=-0.602，P＜0.05）。

2.4 不同血清miRNA-335- 5 p、CEA表达水平结肠癌患者腹腔镜术后复发转移率的比较

在慢代谢组22例中，有8例换用替格瑞洛，其中有1例再发心绞痛并再次靶血管重建；在14例继续口服氯吡格雷的患者中，7例再发心绞痛，其中4例再次靶血管重建，另有2例再发急性心梗。3种代谢型患者心血管缺血事件发生情况见表4。

图1 miRNA-335- 5 p低表达（ n=77）和高表达（ n=19）结肠癌患者的术后 2年复发转移率

图2 CEA低表达（ n=25）和高表达（ n=71）结肠癌患者的术后2年复发转移率

2.5 结肠癌患者腹腔镜术后复发转移的影响因素分析

单因素分析结果显示：AJCC分期、组织分化程度、miRNA-335-5p表达、CEA表达与结肠癌患者腹腔镜术后复发转移有关（P＜0.01）。多因素分析结果显示：AJCC分期、组织分化程度、miRNA-335-5p表达、CEA表达是影响结肠癌患者术后复发转移的独立危险因素（P＜0.01）。（表4）

表4 结肠癌患者腹腔镜术后复发转移的影响因素分析（ n=96）

注：CEA表达（0=低表达，1=高表达）；miRNA-335-5p表达（0=高表达，1=低表达）；AJCC分期（0=Ⅰ～Ⅱ，1=Ⅲ～Ⅳ）；组织分化（0=低分化，1=中高分化）

因素CEA表达miRNA-335-5p表达AJCC分期组织分化单因素分析HR 2.986 3.384 3.249 2.311 95%CI 1.12～7.95 1.41～8.12 1.23～8.60 1.11～4.79 P值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01多因素分析HR 2.415 2.543 2.131 1.759 95%CI 1.10～5.28 1.13～5.72 1.10～4.12 1.20～2.57 P值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

3 讨论

1.3.4 评判标准正常情况下，CEA浓度为0～5 ng/ml，因此本研究以CEA≤5 ng/ml为低表达，CEA＞5 ng/ml为高表达。以miRNA-335-5p/U6=1为标准，miRNA-335-5p/U6＜1判定为miRNA-335-5p低表达；≥1判定为miRNA-335-5p高表达。

miRNA含有18～25个核苷酸，是真核生物细胞内一类高度保守的内源性单链非编码RNA，能与靶基因mRNA 3′-非编码区特异性结合，调节基因转录和表达，在细胞增殖、分化及凋亡等过程中发挥重要作用[6]。许多研究已证实，miRNA具有抑癌或致癌功能，可作为生物标志物或结肠癌的治疗靶点应用于临床治疗。Tanaka等[7]研究发现，miRNA-125b-1、miRNA-378a可以预测疫苗治疗结直肠癌的效果。Masuda等[8]经过大量统计分析发现，miRNA-18a、miRNA-19b、miRNA-29a、miRNA-17-3p、miRNA-133a等miRNA在结肠癌患者血清中表达上调；miRNA-375、miRNA-93、miRNA-181-b、miRNA-24、miRNA-320a等miRNA在结肠癌患者血清中表达下调。

miRNA-335-5p是哺乳动物常见的miRNA之一，存在于多种细胞和组织中。相关研究表明，miRNA-335-5p在肾细胞癌[9]、肺癌[10]、胃癌[11]等多种恶性肿瘤中表达下调，抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移。Sun等[12]研究发现，miRNA-335-5p在结肠癌组织中低表达，具有抑制肿瘤侵袭和转移的作用。本研究结果显示，结肠癌组患者的血清miRNA-335-5p表达水平较对照组明显降低，与Sun等[12]研究结果一致。提示miRNA-335-5p在结肠癌中可能作为抑癌基因发挥作用。本研究中，血清miRNA-335-5p表达与结肠癌患者的AJCC分期、组织分化程度有关，但与结肠癌患者的性别、年龄、肿瘤直径、阳性淋巴结数目无关，提示miRNA-335-5p参与结肠癌的病理分化。本研究对影响结肠癌患者腹腔镜术后复发转移的相关因素进行分析，结果发现：miRNA-335-5p低表达患者的2年复发转移率高于miRNA-335-5p高表达患者（P＜0.05），是影响结肠癌患者腹腔镜术后复发转移的独立危险因素之一。提示miRNA-335-5p低表达与结肠癌患者腹腔镜术后复发转移有关，推测miRNA-335-5p可作为诊断结肠癌及监测患者术后复发转移的重要靶点。

CEA是被广泛认可的肿瘤标志物之一，在胃癌[13]、结肠癌[14]等恶性肿瘤中高表达，已应用于常规检查，是多种消化道恶性肿瘤术前诊断及术后复发转移监测的生物标志物。Polat等[15]研究发现，结肠癌患者血清CEA浓度显著高于对照组，与患者的分化程度、临床分期和肿瘤转移情况有关。本研究发现，CEA在结肠癌患者血清中高表达，AJCC分期为Ⅲ～Ⅳ期，组织分化程度为中高分化的结肠癌患者血清中CEA表达水平较高。提示CEA表达与结肠癌患者的AJCC分期和组织分化程度密切相关，可能参与了肿瘤组织分化过程，与Polat等[15]报道一致。Sugarbaker等[16]研究发现，CEA可以作为监测放射治疗结直肠癌疗效的生物标志物。本研究发现，CEA高表达患者的术后2年复发转移率明显高于CEA低表达患者，是影响结肠癌患者腹腔镜术后复发转移的独立危险因素之一。提示CEA高表达与结肠癌患者腹腔镜术后复发转移有关，推测CEA可作为诊断结肠癌及监测患者术后复发转移的有效生物标志物。

综上所述，结肠癌患者血清中miRNA-335-5p呈低表达，CEA呈高表达，两者与结肠癌患者的AJCC分期、组织分化程度及术后2年复发转移率有关。结肠癌患者血清中miRNA-335-5p与CEA的表达呈负相关，推测两者可能通过某种机制共同参与调控结肠癌的发生、发展，有待后续进一步研究中进行探究证实。

A组采取耳穴埋豆法治疗，主穴选择盆腔、腹、子宫、皮质子、脾，消毒耳廓，并采用探棒找出穴位的敏感点，采用5 mm×5 mm胶布将行籽贴压于对应的穴位，并采取食指、拇指循耳前后按压，直至局部杆菌胀、麻、酸或是发热感为宜，两只耳朵交替贴穴，每穴按压时间为1 min，1天3次，1个疗程5天，连续治疗3个月。B组采取自拟中药汤剂治疗，主要成分有赤芍、柴胡、大血藤、延胡索、丹参、蒲公英15 g，枳壳、败酱草20 g。将上述方剂煎水200 ml服用，一天1剂。C组采取A+B组的治疗方案。连续治疗3个月，在月经期间暂停用药。

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