口腔鳞状细胞癌是中国目前发病率和致死率较高的头颈部恶性肿瘤之一，浸润性强，易发生黏膜下扩散和早期血行转移，预后较差，严重影响患者的呼吸、咀嚼、吞咽等正常生理功能以及患者的生命健康[1]。有研究显示，口腔鳞状细胞癌的发生、发展涉及多方面的因素，包括吸烟、饮酒、遗传、环境、微生物感染等因素[2]。目前，对于口腔鳞状细胞癌，临床上主要采取以外科手术为基础，联合放疗、化疗、基因治疗、靶向治疗等的综合序列治疗方案，虽然大大提高了早期口腔鳞状细胞癌患者的5年生存率，但是对于晚期口腔鳞状细胞癌患者或复发转移患者的预后仍然较差[3]，因此，寻找新的治疗方向和干预靶点具有十分重要的临床意义。肿瘤与机体免疫系统的关系一直是医学界长期研究的重点课题，肿瘤免疫治疗、分子靶向治疗、免疫检查点疗法等逐渐应用于临床，并取得良好的治疗效果[4]。但是，有研究显示，免疫治疗的临床疗效受限于肿瘤免疫抑制性微环境，肿瘤免疫耐受是肿瘤细胞逃逸机体免疫系统监控的主要机制之一，除了由于肿瘤细胞自身缺乏免疫原性，还与肿瘤细胞分泌多种细胞因子造成肿瘤微环境改变有关[5]。树突状细胞（dendritic cell，DC）是目前已知的功能最强的抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC），在调节肿瘤细胞免疫耐受过程中发挥着关键作用[6]。肿瘤微环境中存在的多种细胞因子可诱导DC向致耐受性DC分化，而血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）几乎存在于所有的肿瘤组织内，有研究显示，VEGF与DC分化密切相关[7]，但是具体的作用机制目前尚不清楚。本研究将鳞状细胞癌SCC-4细胞株与小鼠骨髓前体细胞共培养，观察VEGF对DC分化的影响，从而为口腔鳞状细胞癌免疫治疗的研究提供新的思路和临床依据，现报道如下。

由图4可知，龙牙楤木皂苷的提取得率与纤维素酶添加量呈现正相关，随着酶添加量的增加，皂苷提取得率快速增加，当酶添加量占龙牙楤木粉末质量的1.5%时，皂苷提取得率达到最大值，3.84%，这是由于酶添加量增加，促进了酶与细胞壁的接触，加速破壁作用，从而加快皂苷类化合物的溶出。当酶添加量超过1.5%后，皂苷得率不再增加，其原因可能是由于底物完全被酶分子所饱和，继续增加的酶分子失去了与底物结合的机会，造成酶解反应速度不再变化[19]。

1 材料与方法

1.1 受试细胞

人鳞状细胞癌SCC-4细胞购自American Type Culture Collection公司。

1.2 受试动物

6～8周龄无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级别的C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

河道的形态一般是由河流冲击而成，也有一些河道是天然形成，但河流冲击而成的成分较大，所以造就出曲折蜿蜒的河道。河流的流转与冲击是河流的基本属性，在这基本属性的作用下河道内呈现复杂多样的水流特征，或急、或缓、或循环，而不同的水流特征在不同的环境下相遇又会产生像旋涡或是跌水这样较为复杂的流态。复杂的水流流态使得水中的各种物质不断的流动、交换，处于水体上层的物质如落叶、鸟类粪便、人类活动产生的垃圾会被“交换”到水体下层成为水中生物分解、利用的对象，之后化作河流系统的“养料”。

1.3 主要试剂

1.5.4 ELISA法将SCC-4细胞以1×106/孔接种至6孔板中，分别培养24、48、72 h后收集上清，2500 r/min离心20 min，离心半径为8 cm。采用双抗体夹心ELISA法检测VEGF含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。按要求依次稀释标准品和样品，分别加入酶标包被板中的各检测孔中，每孔加入100 μl；设空白孔，每孔加入50 μl生物素化抗体工作液，室温下孵育120 min，弃去液体，洗涤3次，每孔加入100 μl酶结合工作液，室温下孵育60 min。弃去液体，洗涤3次，每孔加入100 μl显色液，37℃避光显色15 min。每孔加入100 μl终止显色液，15 min内检测波长为450 nm处的光密度值（optical density，OD），计算平均值。每个实验重复3次，取平均值。细胞培养上清中IL-12的检测方法同上所述。

将近一个世纪后，意识形态与科学间的鸿沟不仅没有缩减，反而不断扩大。青年马克思认为，意识形态依旧被烙上虚假的印记。“意识在任何时候都只能是被意识到了的存在，而人们的存在就是他们的实际生活过程。如果在全部意识形态中人们和他们的关系就像在照相机中一样是倒现着的，那么这种现象也是从人们生活的历史过程中产生的，正如物像在眼网膜上的倒影是直接从人们生活的物理过程中产生的一样。”［3］换言之，虚假、颠倒的意识形态与理性、真实的科学是对立的。

1.4 主要仪器

FACS Vantage SE型流式细胞仪购自美国BD公司，550型iMaker酶标仪购自美国Bio-Rad公司，DI-CJ-2ND超净工作台购自北京东联哈尔仪器制造有限公司，HERcell 150i型CO2细胞培养箱和NanoDrop ND-1000紫外分光光度计均购自美国Thermo Scientific公司，Eppendorf 5427 R台式高速冷冻离心机和各种型号的移液器均购自德国Eppndorf公司，CX41倒置光学显微镜购自日本OLYMPUS公司，FA系列电子分析天平购自上海光学仪器厂。

1.5 实验方法

《模拟电子技术》课程历年来大多数的学生觉得学习难度大，一些概念与原理比较难懂，为了提高该门课程的教学效果，在教学过程中积极探索了基于“雨课堂+互联网+PowerPoint”的在线混合式教学改革方法，不仅有利于了解学生的课前预习情况，也可以提高课堂的教学效果，大大改善了以往课堂教学沉闷的现象，还便于学生课后的复习，这种混合式的教学方法给予学生课前、课中、课后每个环节都有新的不同的体会与感受，并且充分的利用了智能手机的优势，让它更好地服务教学的方法，获得了广大学生的好评。

从图1可以看出，消费者登录共享型生活服务平台后，通过平台定位服务查找所在社区的商家信息，清晰看到商家的距离和配送时间，在选择需要的产品且确定订单后，平台将消费者的需求发送给商家，商家接单后为消费者准备产品。与此同时，配送员通过平台进行抢单，抢单成功后赶往商家，拿到产品之后在显示时间之内（一般不超过1小时）快速将产品配送至消费者手中。在此过程中，消费者可以随时在平台查看订单，了解订单进展情况。之后消费者可以根据商品质量和服务体验在平台上对商家和配送员进行评价，完成信息反馈。在此过程中平台、社区商家、社区消费者及配送员价值都在互动中得到了提升。以下几种互动情境的分析如下：

MLR法检测结果显示，未成熟DC能够轻度刺激T细胞增殖，且随着未成熟DC与T细胞比例的增加，未成熟DC刺激T细胞增殖的活性逐渐加强。在相同比例下，4组未成熟DC刺激T细胞增殖的活性比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；其中，T细胞对照组和抗VEGF组未成熟DC刺激T细胞的增殖活性均高于VEGF组和共培养组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；且T细胞对照组刺激T细胞的增殖能力高于抗VEGF组，差异有统计学意义（P＜0.05）；VEGF组和共培养组刺激T细胞增殖能力比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

FCM检测结果显示，4组未成熟DC表面IDO和PD-L1的表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。与T细胞对照组比较，VEGF组、共培养组和抗VEGF组中未成熟DC表面IDO和PD-L1的表达水平均有所升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；而共培养组未成熟DC表面IDO和PD-L1的表达水平最高。抗VEGF组未成熟DC表面IDO和PD-L1的表达水平均低于VEGF组和共培养组，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表3）

高糖DMEM细胞培养基、RPMI1640细胞培养基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清、链霉素-青霉素双抗均购自美国GIBCO公司，CFSE购自美国Sigma公司，rmGM-CSF、rmIL-6、rmIL-4和mVEGF均购自德国Miltenyi公司，兔抗鼠VEGF多克隆抗体、MIH5单克隆抗体均购自美国Abcam公司，CD11c-APC、CD80-FITC、CD86-PE、CD40-FITC、主要组织相容性复合体Ⅱ（major histocompatibility complexⅡ，MHCⅡ）-PE、吲哚胺-2，3-双加氧酶（indoleamine-2，3-dioxygenase，IDO）-eFluor、程序性死亡受体配体1（programmed cell death 1 ligand1，PDCD1LG1，也称PD-L1）-PE和固定破膜试剂盒均购自美国eBioscience公司，IDO1抑制剂-1-甲基色氨酸（1-methyl-tryptophan，1-MT）购自美国Selleck公司，VEGF-A（mouse）ELISA试剂盒和IL-12P70（mouse）试剂盒均购自台湾Abnova公司。

1.5.5 形态学观察在细胞培养过程中，采用倒置光学显微镜观察细胞的生长状况以及细胞形态学变化。

1.5.1 细胞培养将人鳞状细胞癌SCC-4细胞置于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的高糖DMEM细胞培养基中进行培养，将细胞置于37℃、5%CO2细胞培养箱中进行培养。24～48 h更换培养液，48 h传代1次。

1.5.6 流式细胞术采用流式细胞术（flow cytometry，FCM）收集未成熟DC，采用预冷的PBS洗涤3次后，2500 r/min离心20 min，离心半径为8 cm，弃除上清液；加入500 μl的Binding Buffer重悬细胞，调整未成熟DC细胞至细胞浓度约为1×105/ml；取每管100 μl，加入2 μl的荧光标记抗体，包括DC表面特异性分子CD11c、CD80、CD86、CD40、MHCⅡ以及IDO、PD-L1抗体，室温下避光孵育15～20 min；2500 r/min离心20 min，离心半径为8 cm；弃除上清液；加入500 μl的Binding Buffer重悬细胞；上机检测。实验重复3次，取平均值。

1.5.7 同种异体混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction，MLR）分离小鼠脾脏T细胞，调整细胞浓度为5×106/ml。实验一：T细胞对照组（未成熟DC+T细胞）、VEGF组（未成熟DC+T细胞+20 ng/ml VEGF因子）、肿瘤上清培养组（未成熟DC+T细胞+SCC-4细胞上清）、抗VEGF组（未成熟DC+T细胞+SCC-4细胞上清+50 ng/ml VEGF抗体）；实验二：空白对照组（RPMI1640细胞培养基）、阴性对照组（T细胞）、T细胞对照组（未成熟DC+T细胞）、抗IDO组（未成熟DC+T细胞+1 mmol/L 1-MT）、抗PD-L1组（未成熟DC+T细胞+1 mg/ml MIH5抗体）、抗IDO+PD-L1组（未成熟DC+T细胞+1 mmol/L 1-MT+1 mg/ml MIH5抗体）。将各组未成熟DC与T细胞（5×105/孔）分别按1∶5、1∶10、1∶20、1∶50的比例单层加入至96孔板中，加入RPMI1640细胞培养基（10%FBS、30 ng/ml rmGM-CSF、10 ng/ml rmIL-4、1000 U/ml IL-2、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素），72 h后，加入20 μl噻 唑 蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT），置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育4 h后，弃除上清液，每孔加入200 μl的二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），置于振动器上振动5 min，置于显微镜下观察无紫色结晶物。将96孔板放置于450酶标仪上，检测波长为450 nm处的OD值，计算平均值。每个实验重复3次，取平均值。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用随机区组设计的方差分析和单因素方差分析，多组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SCC- 4细胞培养上清中的VEGF水平

MLR法检测结果显示，未成熟DC通过高表达IDO和PD-L1，在相同比例下，各组T细胞增殖活性比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；抗IDO组、抗PD-L1组和抗IDO+PD-L1组T细胞的增殖活性均高于T细胞对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；其中，抗IDO+PD-L1组T细胞的增殖活性最高。而抗IDO组和抗PD-L1组T细胞的增殖活性比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（表4）

2.2 体外诱导DC的形态特征和表型特征分析

于400倍倒置光学显微镜下观察DC的形态特征，T细胞对照组小鼠骨髓细胞在rmGM-CSF和rmIL-4的诱导下，呈集落状分布，体积增大，细胞表面有少量毛刺状突起，为典型的DC形态，但是VEGF组和共培养组细胞集落形成数量及悬浮DC数目均较对照组明显减少。提示口腔鳞状细胞癌微环境及VEGF因子可有效地抑制DC的分化。

与空白对照组比较，VEGF组、共培养组和抗VEGF组DC表面特异性分子CD11c、CD80、CD86、CD40、MHCⅡ的表达水平及细胞培养上清中IL-12的表达水平均有所降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；但是，共培养组和抗VEGF组DC表面特异性分子的表达水平却均稍高于VEGF组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；而抗VEGF组和共培养组DC表面的CD11c、CD80、CD86、CD40、MHCⅡ的表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

表1 各组未成熟DC表面标志分子以及培养上清中IL-12表达水平的比较（±s）

注：a与空白对照组比较，P＜0.05；b与VEGF组比较，P＜0.05

组别空白对照组VEGF组共培养组抗VEGF组F值P值CD11c（%）61.35±3.23 40.79±1.85a 49.21±2.02a b 50.76±1.76a b 135.489 0.000 CD80（%）53.62±0.94 43.19±1.28a 48.81±1.29a b 49.97±1.23a b 126.459 0.000 CD86（%）45.54±0.87 30.89±0.91a 38.74±0.83a b 39.15±1.02a b 434.192 0.000 CD40（%）65.91±2.84 53.17±3.08a 61.52±2.28a b 62.04±2.08a b 42.517 0.000 MHCⅡ（%）29.49±0.75 18.44±0.69a 22.83±0.70a b 22.61±0.83a b 376.548 0.000 IL-12（pg/ml）36.52±0.58 27.72±0.38a 30.33±0.48a b 29.94±0.51a b 588.705 0.000

2.3 各组DC对同种异源 T细胞增殖活性的影响

1.5.2 制备小鼠骨髓细胞将小鼠颈椎脱臼处死，浸泡于75%乙醇溶液中10 min；在无菌条件下，取出下肢骨，采用RPMI1640冲洗骨髓腔，制成细胞悬液；用200目滤网过滤后，2500 r/min离心5 min，离心半径为8 cm，弃除上清液；加入红细胞裂解液，裂解细胞，静置2 min，2500 r/min离心5 min，离心半径为8 cm，弃除上清液；采用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）冲洗3次后，收集骨髓细胞备用。

表2 不同组别未成熟DC诱导后同种异源 T细胞增殖情况的比较（±s）

注：a与T细胞对照组比较，P＜0.05；b与VEGF组比较，P＜0.05；c与共培养组比较，P＜0.05

组别T细胞对照组VEGF组共培养组抗VEGF组F值P值DC∶T细胞1∶5 9.35±0.21 6.48±0.21a 6.39±0.19a 7.19±0.19a b c 491.432 0.000 1∶10 6.15±0.17 3.31±0.18a 3.29±0.17a 4.03±0.14a b c 656.381 0.000 1∶20 2.83±0.19 1.49±0.19a 1.51±0.20a 1.69±0.21a b c 104.337 0.000 1∶50 1.15±0.16 0.41±0.16a 0.39±0.17a 0.53±0.14a b c 51.458 0.000

2.4 VEGF诱导未成熟DC表达IDO和PD-L1

1.5.3 肿瘤微环境中培养DC采用RPMI1640细胞培养基（含10%FBS，30 ng/ml rmGM-CSF，10 ng/ml rmIL-4，100 U/ml青霉素，100 μg/ml链霉素）重悬小鼠骨髓细胞，调整细胞浓度为1×106/ml。将小鼠骨髓细胞单层加入12孔板中，实验分为空白对照组（骨髓细胞）、VEGF组（骨髓细胞+20 ng/ml VEGF因子）、共培养组（骨髓细胞+SCC-4细胞）、抗VEGF组（骨髓细胞+SCC-4细胞+50 ng/ml VEGF抗体）。培养5 d后，收集悬浮及半悬浮细胞获得未成熟DC。

表3 口腔鳞状细胞癌微环境中VEGF诱导未成熟DC表达IDO和PD-L1（%，±s）

注：a与T细胞对照组比较，P＜0.05

组别T细胞对照组VEGF组共培养组抗VEGF组F值P值IDO 63.44±5.57 81.42±7.02a 84.37±5.53a 76.81±6.97a 21.750 0.000 PD-L1 49.22±5.51 62.06±7.02a 64.38±6.28a 59.42±6.53a 14.209 0.000

2.5 未成熟DC通过高表达IDO和PD-L1对 T细胞增殖活性的影响

ELISA检测结果显示，24、48、72 h时SCC-4细胞培养上清中VEGF的相对表达量分别为（181.54±52.67）pg/ml、（329.46± 73.23）pg/ml、（648.74±62.17）pg/ml，3组比较，差异有统计学意义（F=164.250，P＜0.01）。随着培养时间的延长，VEGF的相对表达量明显增加，培养72 h后，SCC-4细胞上清中VEGF的相对表达量高于24、48 h时SCC-4细胞上清中VEGF相对表达量，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表4 不同组别未成熟DC诱导后 T细胞增殖活性的比较（±s）

注：a与T细胞对照组比较，P＜0.05；b与VEGF组比较，P＜0.05；c与共培养组比较，P＜0.05

组别T细胞对照组抗IDO组抗PD-L1组抗IDO+PD-L1组F值P值DC∶T细胞1∶5 5.98±0.34 7.52±0.46a 7.39±0.31a 8.46±0.52a b c 60.331 0.000 1∶10 2.64±0.19 3.87±0.26a 4.01±0.23a 4.53±0.21a b c 127.679 0.000 1∶20 1.42±0.14 1.87±0.11a 1.86±0.16a 2.49±0.08a b c 121.532 0.000 1∶50 0.31±0.04 0.54±0.04a 0.50±0.07a 0.83±0.06a b c 157.827 0.000

3 讨论

与其他大多数恶性肿瘤一样，口腔鳞状细胞癌的发生涉及多种因素、多个阶段的调控，而肿瘤微环境为肿瘤的生长提供了有利条件，但是其中的非肿瘤成分，也参与调控肿瘤的发展和转归，包括肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophage，TAM）、髓样来源抑制细胞、调节性T细胞、致耐受性DC等[8-9]。肿瘤免疫耐受是肿瘤细胞逃逸机体免疫系统监控的主要机制之一，除与肿瘤细胞自身缺乏免疫原性有关外，也与肿瘤微环境中存在的影响免疫状态的各种细胞因子有关[5]。

DC是目前发现的免疫调节功能最强大的APC，通过有效地识别、处理、呈递外来抗原，使机体发挥正常的免疫监视功能[10]。正常情况下，未成熟DC能够识别吞噬抗原，继而分化为成熟的DC，刺激抗原特异性T细胞发生免疫反应[11]。但在肿瘤微环境中，虽然存在大量的浸润DC，但是肿瘤细胞依然能够发生免疫逃逸，这可能与肿瘤微环境中存在的免疫抑制分子有关，如VEGF、IL-2等[12]。本研究将口腔鳞癌细胞株SCC-4作为刺激细胞，将小鼠髓源性DC作为反应细胞，共培养后发现，口腔鳞状细胞癌中VEGF能够抑制DC分化，同时抑制T细胞增殖，提示口腔鳞状细胞癌中VEGF诱导的未成熟DC可能属于一类致耐受性DC。

未成熟DC在诱导T细胞外周免疫耐受的过程中发挥了重要的作用，但是在肿瘤微环境中诱导未成熟DC产生致耐受性的作用机制尚不明确。本研究首先采用ELISA法证实了SCC-4细胞分泌VEGF的能力，提示可利用SCC-4细胞体外模拟口腔鳞状细胞癌高表达VEGF的微环境，进一步探讨VEGF对未成熟DC的影响。结果显示，VEGF组、共培养组和抗VEGF组DC表面CD11c、CD80、CD86、CD40、MHCⅡ的表达水平均低于空白对照组。DC在体内分为成熟状态和未成熟状态，未成熟DC摄取抗原后，在炎性因子刺激下，将抗原物质降解为抗原肽，经过一系列的修饰加工后，与MHCⅡ分子结合成为稳定的MHC-抗原肽复合物，从而被T细胞特异性识别[13]。由于T细胞对抗原的识别具有MHC限制，因此，MHC分子的表达水平可反映抗原呈递能力。未成熟DC摄入抗原后，逐渐分化成为成熟DC，细胞表面的CD80、CD86、CD40、MHCⅡ共刺激分子的阳性表达率升高，CD80、CD86、CD40与相应配体结合后可激活细胞表面黏附分子的表达，并诱导IL-12等多种细胞因子的分泌，延长DC寿命[14]。CD-11c属于小鼠DC表面的标志分子，其表达水平的降低说明肿瘤微环境中VEGF可抑制骨髓前体细胞向DC分化；而CD80、CD86、CD40、MHCⅡ表达水平的降低提示DC仍处于未成熟状态，抗原呈递功能受到抑制。

IDO和PD-L1是目前研究较为广泛的致耐受性分子，主要表达于APC表面，并且与肿瘤的发展密切相关，通过多种调控机制抑制效应T细胞的功能，促使调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）生成，进而导致免疫耐受。有研究显示，PD-L1可能通过与T细胞表面的CD80结合，抑制晚期T细胞的免疫监视功能[15]。上述研究结果已经证实口腔癌中的DC多为未成熟细胞，且肿瘤微环境中的VEGF可明显抑制DC分化，因此推测VEGF诱导致耐受性DC可能的作用机制为促使未成熟DC高表达IDO和PD-L1分子。Marti等[16]经研究认为VEGF可促使成熟DC高表达IDO，进而抑制T细胞的免疫反应。本研究采用FCM证实IDO和PD-L1在未成熟DC表面表达水平较高，拮抗VEGF的表达后，IDO和PD-L1的表达水平下调，说明口腔鳞状细胞癌微环境中VEGF可促使未成熟DC表达IDO和PD-L1，从而致诱导耐受性DC的生成。

615 Quality of life of inpatients with lung cancer and related influencing factors

鸨鸟肃肃地扇着翅膀，停落在桑树丛。 王家的事没了没完，稻梁全不能种植。 父母拿什么来吃？遥远的苍天呀！何时才能安定？[3]113-114

综上所述，口腔鳞状细胞癌微环境中大量的VEGF分子通过刺激IDO和PD-L1的表达，可抑制未成熟DC向成熟DC分化，从而诱导致耐受性DC的形成，并进一步抑制T细胞的增殖，干扰机体对肿瘤细胞的免疫监控，产生免疫耐受，促进口腔鳞状细胞癌的发展。

参考文献

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