肿瘤细胞诱导的血管新生是大多数恶性肿瘤生长和转移的前提[1]。越来越多的研究表明血管新生与多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)发生、发展、恶化及预后密切相关[2]。目前以反应停为代表的抗血管新生药物应用于难治复发性骨髓瘤的临床治疗,并取得较好疗效,提示以抗血管新生为靶点的治疗已成为治疗难治复发骨髓瘤重要着眼点。青蒿琥酯(artesunate,ART)是世界上广泛采用的抗疟药青蒿素的衍生物。本课题组前期研究表明青蒿琥酯具有明显抗骨髓瘤活性,能诱导骨髓瘤细胞凋亡、抑制骨髓瘤生长[3]。本实验继续研究青蒿琥酯在MM细胞促血管新生效应中的作用及其机制,寻找青蒿琥酯在MM治疗中的理论依据。

1 材料和方法

1．1 实验材料

青蒿琥酯由南药桂林有限公司提供,产品编号H10930195,临用前加5%NaHCO3注射液溶解。骨髓瘤RPMI-8226细胞由中科院上海细胞生物学研究所提供。蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度检测试剂盒购于上海康成生物公司;全部抗体购于美国Santa Cruz公司。

1．2 MTT实验

人骨髓瘤RPMI-8226细胞用RPMI1640培养基培养于37℃二氧化碳培养箱。取对数生长期的人骨髓瘤RPMI-8226细胞,经胰酶消化后,调细胞浓度为2×105/ml,用96孔板接种,每孔加200μl细胞悬液。分别以终浓度为0、2.5、5、10、20、40μmol/L和80μmol/L的青蒿琥酯处理为实验组;加入等体积的DMSO为阴性对照。共计8个组,每组设3个复孔。培养24、48h后,MTT比色法测定。终止反应前4h,每孔加入5g/ml的MTT 20μl继续培养4h,小心吸去孔内液体,然后加入200μl DMSO,振荡使结晶物充分溶解,选择570nm波长,测定各孔光吸收值。采用下列公式计算细胞生长抑制率：生长抑制率(%)=(1-试验孔A570/对照孔A570) ×100%,并据此,采用IC50计算软件计算青蒿琥酯对RPMI-8226细胞的半数抑制浓度(IC50)。

1．3 鸡胚绒毛尿囊膜血管生长实验

将RPMI-8226细胞放入RPMI1640培养48h后,反复冲洗5次,另用无血清1640培养液继续培养4h,收集细胞并调细胞浓度至1×106/ml,培养24h后备用。台盼兰拒染实验显示RPMI-8226细胞的活力>95%。将鸡胚培养4d后,开窗暴露近气室处的接种部位,继续孵化24h,分组进行如下处理：(1) 阴性对照组，无菌将仅含RPMI1640培养液的可吸收海绵放于鸡胚绒毛尿囊膜,海绵大小约1mm3;(2) RPMI-8226组，在孵化第6天,无菌将浸有100μl 5×106 RPMI-8226细胞悬液的海绵放于鸡胚绒毛尿囊膜;(3) 青蒿琥酯处理组，将部分(2)组鸡胚在第8天取出,给予3、6μmol/L 或12μmol/L的青蒿琥酯处理。鸡胚接种后均需无菌封口,垂直放置在温箱继续孵育直至第12天,收集各组鸡胚绒毛尿囊膜标本。部分标本留于免疫蛋白印迹进一步实验;其余标本用固定液(甲醇、丙酮等比混合液)处理,在解剖显微镜下观察并拍照,参考田氏法[4],计数接种区5mm范围内的血管数目,并按照以下公式计算：

高职院校公共基础课分层分类教学的思考…………………………………………房广梅 徐 军 张惠芳（6.100）

以表示实验数据,用SPSS 16.0统计软件包对样本均数间的差异行Dunnett’s t检验分析。

新生血管数

1．4 免疫蛋白印迹检测

青蒿琥酯以剂量依赖和时间依赖的方式抑制RPMI-8226细胞增殖。随着青蒿琥酯浓度增加或者作用时间延长,其细胞增殖抑制作用逐渐增强(图1)。药物作用24h和48h后,其IC50值分别为(36.33±2.65) μmol/L和(14.31±3.28) μmol/L。

1．5 统计学处理

(1) 8号线右线下穿施工。盾构掘进的过程中，盾构土舱压力、掘进速度、同步注浆等因素对周边土体形成扰动，受扰动的土体在工后较长时间内发生固结变形及次固结变形，导致隧道在工后较长时间发生沉降。从监测结果可知，盾构下穿已运营的隧道对其沉降影响很大，且随着运营时间的增加，不均匀沉降和变形将会进一步增加。

2 结果

2．1 青蒿琥酯对RPMI-8226细胞增殖的影响

将1．3实验中收集到的部分鸡胚绒毛尿囊膜标本通过蛋白抽提试剂盒提取总蛋白,BCA检测法测定蛋白浓度。蛋白定量后,行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,半干式转移至NC膜,切取目标条带,分别加对应一抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)(1∶800)、血管紧张素1 (angiopoietin-1,Ang-1)(1∶150)或β-actin(1∶1000)抗体,4℃孵育过夜。次日反复冲洗3次,分别加对应二抗室温孵育2h,底物化学发光ECL法显影,凝胶图像处理系统分析目标带光密度值。

  

图1 青蒿琥酯对RPMI-8226细胞的增殖抑制作用Fig 1 The proliferation inhibition effect of artesunate

 

2．2 青蒿琥酯对RPMI-8226细胞诱导血管新生的影响

 

她说自己叫韩贝，捡到了阿巴的默写本，特地来还给他。韩贝看到默写本上那么多红叉叉时，皱起了眉头：“我可不想我的新朋友是个差生。如果你明天默写得满分，我就带你上船、出岛。”

 

2．3 青蒿琥酯对鸡胚绒毛尿囊膜中VEGF和Ang-1蛋白表达的影响

 

免疫印迹检测鸡胚绒毛尿囊膜中VEGF和Ang-1蛋白表达,与单纯RPMI-8226细胞组相比,青蒿琥酯处理组鸡胚绒毛尿囊膜中VEGF含量分别下降22.2%、34.2%和52.6%(P<0.01);Ang-1蛋白表达量分别下降15.6%、24.2% 和39.6%(P<0.05)(图3)。

 

RPMI-8226细胞组呈很强的血管新生刺激能力,众多新生微血管以海绵为中心呈放射状排列。与阴性对照组(图2A)相比,RPMI-8226细胞组新生血管密度明显增大,血管分支明显增多,血管管径也增粗(图2B,箭头)。经过12μmol/L青蒿琥酯处理后,其血管新生刺激能力明显减弱,新生血管的密度和分支减少,管径也变细(图2C,箭头)。与单纯RPMI-8226细胞组相比,3、6、12μmol/L青蒿琥酯处理组新生血管数目分别减少21.9%、38.2%和76.9%(P<0.05)(图2D)。

 

3 讨论

 

青蒿素类药物是从传统中草药黄花蒿中分离得到的有效成分,用于疟疾治疗已有上千年历史,其高效低毒的效应得到全世界肯定。青蒿琥酯是青蒿素的可溶性衍生物,其在水中的溶解程度和对疟原虫的作用强于青蒿素。同时其表现出的抗肿瘤活性也越来越引起关注[5]。已经证实青蒿琥酯可以加速癌细胞DNA损伤,阻滞细胞周期,调节铁产生自由基,改变肿瘤的保护性免疫抑制,对多种实体肿瘤细胞生长具有抑制效应[5]。本课题组前期实验表明青蒿琥酯可有效抑制骨髓瘤细胞增殖,并诱导其凋亡[3]。本研究首先观察青蒿琥酯对人骨髓瘤RPMI-8226细胞增殖的影响,结果显示青蒿琥酯亦呈剂量和时间依赖方式抑制人骨髓瘤RPMI-8226细胞生长。近年来有数例青蒿琥酯抗肿瘤血管新生作用的报道。体外研究显示青蒿琥酯可减少K562白血病细胞表达VEGF,对其诱导的血管新生具有抑制作用[7]。现就青蒿琥酯对人骨髓瘤细胞体内诱导血管新生进行研究,以进一步明确青蒿琥酯抗骨髓瘤作用机制。

 

   

图2 青蒿琥酯对各组鸡胚绒毛尿囊膜血管新生的影响Fig 2 The effect of artesunate on angiogenesis of chick embryo chorioallantoic membranes in each group (n=11,A: Negative control group; B: RPMI-8226 cells group; C: 12μmol/L artesunate treatment group; D: Statistical analysis.**P<0.01 vs negative control group； #P<0.05,##P<0.01 vs RPMI-8226 cells group

 

 

   

图3 各组鸡胚绒毛尿囊膜中VEGF和Ang-1蛋白含量Fig 3 The VEGF and Ang-1 protein content of chick chorioallantoic membrane in each group (n=3,**P<0.01 vs negative control group; #P<0.05,##P<0.01 vs RPMI-8226 cell group

 

 

 

据报道青蒿素衍生物在15～180μmol/L范围内具有抑制肿瘤细胞增殖能力[8];本实验结果显示青蒿琥酯作用于RPMI-8226细胞24h和48h后,其IC50值分别为(36.33±2.65) μmol/L和(14.31±3.28) μmol/L。本研究选取3、6μmol/L和12μmol/L 3个较低浓度,观察低浓度青蒿琥酯对RPMI-8226细胞诱导的血管新生有无影响。体内鸡胚尿囊膜血管生长实验结果显示：与单纯RPMI-8226细胞组相比,经过青蒿琥酯处理后新生血管密度和分支显著下降,管径也明显变细。提示青蒿琥酯具有抑制RPMI-8226骨髓瘤细胞诱导血管新生的作用。而新生血管减少又进一步减弱RPMI-8226细胞增殖能力。结合本课题组前期发表的实验结果[3],笔者认为青蒿琥酯一方面可干扰骨髓瘤细胞分化增殖;另一方面还对骨髓瘤血管新生具有抑制作用。其作用的机制可能与调节血管新生调控因子表达有关[9]。

 

培养基:普通肉汤、普通营养琼脂、改良马丁琼脂培养基,广东环凯微生物科技有限公司生产; 甘露醇高盐琼脂培养基,青岛高科园海博生物技术有限公司生产。

 

多种细胞因子可调控血管新生,其中VEGF和Ang-1相互配合协调,在血管形成过程中起主要作用[10]。经典的促血管生长因子——VEGF专一作用于血管内皮,促进内皮细胞增殖,数量增多;Ang-1则是近年发现的另一促血管新生因子,其也对血管内皮具有专一性,可特异性结合内皮细胞表面受体,延长内皮细胞寿命,促使其出芽,与VEGF相互协调,促进血管发生和成熟。本课题组前期的临床研究也证实骨髓瘤患者体内高表达的Ang-1和VEGF水平是其骨髓微血管密度升高的重要原因[11]。为进一步明确青蒿琥酯抗血管新生的机制,本实验对体内血管新生实验中鸡胚尿囊膜进行VEGF和Ang-1蛋白含量检测,结果显示经青蒿琥酯处理后,血管生成减少同时伴有VEGF和Ang-1蛋白含量降低。提示青蒿琥酯对MM细胞诱导的血管新生抑制效应可能与VEGF和Ang-1表达降低有关。青蒿琥酯对人骨髓瘤RPMI-8226细胞VEGF和Ang-1表达的抑制效应可能是其抑制RPMI-8226细胞诱导血管新生的重要作用机制。

 

参 考 文 献

 

[1] Ramjiawan R R,Griffioen A W,Duda D G.Anti-angiogenesis for cancer revisited：Is there a role for combinations with immunotherapy?[J].Angiogenesis,2017,20(2)：185-204.

 

[2] Otjacques E,Binsfeld M,Noel A,et al.Biological aspects of angiogenesis in multiple myeloma[J].Int J Hematol,2011,94(6)：505-518.

 

[3] 王素云,杨晓阳,邓凯,等.青蒿琥酯对骨髓瘤RPMI 8226细胞增殖、凋亡及对Survivin、Caspase-3、Caspase-7的影响[J].中草药,2010,41(5)：785-789.

 

[4] 章静波.细胞生物学实用方法与技术[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1995：15.

 

[5] He R R,Zhou H J.Progress in research on the anti-tumor effect of artesunate[J].Chin J Integr Med,2008,14(4)：312-316.

 

[6] 李异兴,李曦雯,农晓琳.青蒿琥酯抗肿瘤作用机制与临床应用的研究进展[J].天然产物研究与开发,2016,28(6)：986-989.

 

[7] Li Y,Feng L,Li Y,et al.Artesunate possesses anti-leukemia properties that can be enhanced by arsenic trioxide[J].Leuk Lymphoma,2014,55(6)：1366-1372.

 

[8] Efferth T,Dunstan H,Sauerbrey A,et al.The anti-malarial artesunate is also active against cancer[J].Int J Oncol,2001,18(4)：767-773.

 

[9] He Y,Fan J,Lin H,et al.The anti-malaria agent artesunate inhibits expression of vascular endothelial growth factor and hypoxia-inducible factor-1α in human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocyte[J].Rheumatol Int,2011,31(1)：53-60.

 

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Anti-angiogenesis effect of artesunate on human multiple myeloma cells*

Shi Liang1,Chen Hao1,2△,Cui Huilin1,Zhang Haojie1,Hao Yueting1

(1.Department of Histology and Embryology,Shanxi Medical University,Taiyuan 030001； 2.Affiliated Dayi Hospital of Shanxi Medical University,Shanxi Academy of Medical Sciences,Taiyuan 030026,China)

Abstract Objective：To study the effect of artesunate on human myeloma RPMI-8226 cell-induced angiogenesis.Methods：The proliferation inhibition effect of artesunate on RPMI-8226 cells was evaluated by MTT method.The chorioallantoic membrane (CAM) vascular assay in chick embryo was used to examine the effect of artesunate on the angiogenesis in vivo induced by RPMI-8226 cells.After CAM vascular assay,the vascular endothelial growth factor (VEGF) and angiotensin-1 (Ang-1) protein content of CAMs was detected by Western blotting.Results：Artesunate inhibited the human RPMI-8226 cell proliferation in a time and dose dependent manner.IC50 of 24 and 48 hours after artesunate treatment was (36.33±2.65) μmol/L and (14.31±3.28) μmol/L,respectively.Compared with the RPMI-8226 cell group,the number of neovascularization in 3,6 and 12μmol/L artesunate treatment groups was reduced by 21.9%,38.2% and 76.9%,respectively.At the same time,the expression of VEGF protein in the CAMs was decreased by 22.2%,34.2% and 52.6%,respectively,and the expression of Ang-1 was decreased by 15.6%,24.2% and 39.6%,respectively.Conclusion：Artesunate can inhibit the human multiple myeloma RPMI-8226 cell-induced angiogenesis,which is related to the VEGF and Ang-1 down-regulation of RPMI-8226 cells after artesunate treatment.

Key words multiple myeloma; artesunate; angiogenesis; vascular endothelial growth factor; angiotensin-1

doi：10.3969/j.issn.1001-1633.2018.02.006

*山西省自然科学基金(2015021189);山西医科大学博士启动基金(03201410);山西医科大学基础医学科技培植基金(201423);山西医科大学大学生创新创业基金(20172098)

第1作者E-mail：1403352675@qq.com

△

通信作者，E-mail：57411459@qq.com

收稿日期：2017-06-15;

修回日期：2017-12-14

(编辑: 叶 文)