子宫内膜修复异常会导致多种严重疾病乃至不孕,临床常见与内膜修复障碍相关的疾病如产后月经不调、子宫内膜异位症等,其病因和发病机制尚不明确。已知Wnt信号通路对多种器官组织[1-3]的损伤修复起重要调控作用。β-catenin是此信号通路核心分子,通路激活时,Wnt蛋白通过与受体结合,导致β-catenin 的磷酸化降解过程受抑制,在细胞质中累积并转移入核内,与转录因子TCF/LEF结合,启动靶基因的转录,从而调控细胞生长和增殖。近年来研究表明Wnt信号通路可能也在子宫内膜修复中扮演重要角色,但相关研究甚少,作用机制尚未阐明。有文献报道Wnt信号通路的激活剂氯化锂可以促进雌激素诱导的小鼠子宫内膜增生[4],单独使用氯化锂也可以促进移植入去卵巢(ovariectomy,OVX)裸鼠肾囊中的人子宫内膜上皮细胞增生,与雌激素效果类似[5],表明Wnt信号通路激活可以促进子宫内膜增生。此外有研究表明经典Wnt信号通路对子宫内膜间充质干细胞增殖分化至关重要,参与内膜的修复过程,干预Wnt信号通路将影响内膜修复进程[6]。CD146作为间质干细胞的表面标志之一,已用于分离和鉴定人子宫内膜间充质干细胞[7]。目前尚未见子宫内膜蜕膜化损伤修复中β-catenin及CD146表达情况的报道。本研究拟采用子宫内膜修复模型观察β-catenin以及CD146的时空表达,探讨Wnt信号通路与子宫内膜干细胞在内膜修复中的作用。

SIO（Smart Innovative Operations）即智能化创新运营。液空通过引进实施“SIO前瞻”项目逐步实现所有中国工厂转型。数字化运营中心DPC的成立就是该项目在中国实施的一个重要里程碑。DPC将负责所有在华企业新型数字化及数据工具和方法，及其持续的管理和改进，全面提升项目所覆盖工厂的生产运行自动化水平，以满足新型运行模式的需求。而且可通过DPC集中化远程控制工厂日常运行，更好地提升运营效率，并及时获得本地及国际专家团队支持。

1 材料和方法

1.1 实验动物

6～8周龄ICR小鼠,体质量20～30g,购自上海吴氏动物中心(合格证2007000542785许可证SCXK(沪)2007-0005)。恒温25℃,光照14h,黑暗10h,自由饮水和摄食。

1.2 主要试剂

Active β-catenin抗体 (德国默克密理博公司); CD146抗体(Abcam公司);超敏二步法免疫组织化学检测试剂盒(北京中杉生物科技公司);RNA抽提试剂(RNAiso Plus);逆转录试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent kit);实时荧光定量PCR试剂盒(SYBR Premix Ex Taq II)均购自大连宝生物公司。

1.3 子宫内膜修复模型的建立

将雌鼠与双侧输精管结扎并证实不育的雄鼠合笼,次晨检查阴栓,以见栓时记为假孕第0.5天。第3.5 天于一侧子宫角内用微量进样器注射20μl无菌花生油诱导蜕膜化,另一侧仅针刺不注油作对照。第5.5天(即注油后48h)切除双侧卵巢。分别于去卵巢后0、24、48、72、96h处死,取子宫角用4%多聚甲醛固定做免疫组织化学检测,另取部分于液氮冻存做qRT-PCR检测。每组3只。

1.4 免疫组织化学检测

采用SPSS 22.0 统计软件进行单因素方差分析,采用LSD-t检验(以P<0.05 为差异有统计学意义)进行组间两两比较,并用Origin 8.0软件作图。

1.5 β-catenin mRNA qRT-PCR检测

诱导蜕膜化去卵巢后0h,阳性染色主要分布在血管内皮,基质细胞极少阳性。24h,内膜坏死,血管破坏,阳性水平稍下降,但基质细胞阳性表达增多。48h,阳性明显增加并达高峰,主要分布于近腔侧的基质中。72h开始下降,主要分布在新形成的腺上皮周围基质及部分腺上皮中。96h仍稍下降,阳性细胞散在分布于内膜基质。未注油侧子宫中,蛋白阳性水平较低(表1，图1，见封二)。

1.6 统计学处理

子宫组织石蜡包埋,作4μm连续切片,柠檬酸缓冲液高压热修复,一抗4℃孵育过夜,PBS漂洗后滴加二抗,DAB显色,中性树胶封片,显微镜下观察。各组每只小鼠随机取3张切片,每张切片在子宫内膜随机选取5个高倍视野拍照,应用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件系统,将5个视野积分光密度值IOD和面积分别相加,计算每张切片平均积分光密度(IOD/面积)。

2 结果

2.1 active β-catenin蛋白在小鼠子宫内膜修复过程中的时空表达

qRT-PCR 检测结果显示β-catenin mRNA相对表达量与0h相比,24h无明显变化,从48h开始略升高(P<0.01),72h达最高(P<0.01),96h稍下降(P<0.05)(表1)。

2.2 CD146蛋白在小鼠子宫内膜修复过程中的时空表达

用RNAiso Plus提取各组注油侧和非注油侧子宫组织总RNA,逆转录成第一链cDNA,以GAPDH为内参,用荧光定量PCR仪(ABI PRISM 7500)进行实时荧光定量PCR扩增。引物序列为GAPDH上游5′-GGT GAAGGTCGGTGTGAACG-3′,下游5′-CTCGCTCC TGGAAGATGGTG-3′,产物233bp;β-catenin上游5′-CCACAGGATTACAAGAAGCG-3′,下游5′CACC AGAGTGAAAAGAACGG 3′,产物145bp。反应条件：94℃预变性 2min;94℃变性30s,退火延伸(GAPDH 64℃,β-catenin 60℃)30s,72℃延伸30s,35循环。每个实验重复3次。用2-△△CT法对样本基因进行相对定量分析,以各组非注油侧为参照,注油侧为待测样本,经内参GAPDH校准后得出各组注油侧β-catenin mRNA相对表达量。

St. Henri, Reserve Bin A, RWT, Magill Estate, Bin169,Bin707

  

图1 去卵巢不同时间子宫内膜active β-catenin和CD146免疫组织化学显色Fig 1 Immunohistochemical staining of active β-catenin and CD146 in the endometrium at different time points after OVXA1-E1：Active β-catenin detection of uterus treated with oil injection 0,24,48,72h and 96h after OVX; F1：Control side without oil injection.A2-E2：CD146 detection of uterus treated with oil injection 0,24,48,72h and 96h after OVX; F2：Control side without oil injection.A-F：×100,bar=200μm; A′-F′：×400,bar=50μm.c：Uterine cavity; g：Uterine gland; bv：Blood vessel

2.3 β-catenin mRNA的表达

诱导蜕膜化去卵巢后0h,注油侧子宫内膜明显增厚,出现广泛蜕膜化反应,基质细胞肥大,胞核亦增大,毛细血管增多,腺体减少,主要分布于近肌层,内膜未见明显阳性染色。24h,已发生蜕膜化的基质细胞变性凋亡,体积变小,核小而深染,部分内膜坏死并从近肌层处剥脱,蛋白主要表达在坏死内膜的周边、肌层细胞中。48h,坏死的蜕膜化组织已完全分离排出,子宫内膜开始修复并明显增厚,腺体增多,蛋白在子宫腔面、近腔侧基质及腺上皮中广泛表达并达高峰。72h,蛋白主要表达于腔上皮、腺上皮,阳性水平下降,96h亦稍下降,蛋白主要表达于腔上皮、腺上皮中,基质极少阳性。未注油侧子宫中,蛋白阳性水平较低(表1，图1，见封二)。

制度建设应该与时俱进，利于武术发展的制度才能保障武术文化生态建设得以顺利进行。体育领域的某些非物质文化遗产，正是由于缺乏“适宜”制度的呵护，日渐式微甚或绝迹[13]。现行的制度阻碍了福建武术文化生态的良性循环，没有为其提供完善的制度保障。鉴于此，需要集思广益从源头治理，在借鉴各类已有政策法规的基础上(2007年建立的全国首个文化生态保护区——闽南文化生态保护实验区积累了一定的成功经验)，建立健全福建武术非遗的各项现有制度，切实通过制度的改革与创新来促进福建武术文化生态的建设。

 

表1 去卵巢不同时间子宫内膜 active β-catenin、CD146蛋白平均光密度值(IOD/面积)和β-catenin mRNA相对表达量Tab 1 IOD/area of active β-catenin and CD146 and relative expression of β-catenin mRNA in the endometrium at different time points after OVX (n=3,

  

Time(h)IOD/AreaActiveβ⁃cateninCD146β⁃cateninmRNA00．0069±0．0017∗∗0．0622±0．0065∗∗1．17±0．09240．0342±0．00590．0420±0．0075∗∗1．23±0．17480．0450±0．0068∗∗0．0704±0．0056∗∗1．63±0．13∗∗720．0356±0．00560．0343±0．00612．16±0．18△△##960．0332±0．00530．0324±0．00481．98±0．23△△##□

**P<0.01 vs other groups; △△P<0.01 vs 0h; ##P<0.01 vs 24h; □P<0.05 vs 72h

3 讨论

最早由Finn等[8]建立的小鼠子宫模拟月经模型为研究子宫内膜修复提供了较好的实验模型,后经过其他学者的改进[9],以此为基础,本研究稍作了改良,在假孕状态下宫腔注射花生油诱导内膜蜕膜化反应后切除卵巢使蜕膜化组织脱落,模拟月经过程并研究在无雌、孕激素作用下子宫内膜的修复过程。结果显示,假孕鼠宫腔注射花生油48h后子宫内膜出现广泛的蜕膜化改变。而在去卵巢24h后,内膜由于缺乏孕激素支持出现坏死、剥脱,内膜间质很薄。去卵巢48h,坏死的内膜组织已完全剥离,同时开始增生修复,部分腔上皮长出,内膜间质明显增厚。至96h修复基本完成,表明本实验模型成功模拟了子宫内膜蜕膜化、坏死剥脱、增生修复的类月经过程。在此过程中,active β-catenin呈现不同的时空表达。active β-catenin是去磷酸化的β-catenin,是β-catenin的活性形式,不被Axin/GSK3β/APC复合体降解,可在胞质蓄积并转入胞核与TCF/LEF转录因子形成复合物,转录大量靶基因。本研究结果显示,当内膜出现蜕膜化改变时,active β-catenin阳性极弱,可能因为此时基质细胞大部分出现蜕膜化,有文献报道,子宫内膜分泌期孕酮可通过抑制Wnt信号通路从而抑制基质细胞增生并诱导其分化为蜕膜细胞[10]。去卵巢24h内膜坏死、剥脱,此时蛋白开始在坏死内膜中检测到,且邻近剥脱面的基底层内膜阳性明显,可能是由于Wnt信号通路开始激活,随后内膜开始增生修复。48h,内膜厚度明显增加,蛋白阳性较强,主要集中于子宫腔面及近腔基质中,可能与腔上皮首先修复以及近腔侧内膜基质增生有关。72h,随着内膜修复接近完成,蛋白表达开始下降,主要位于新形成的较扁平的腺上皮及周围基质细胞。96h,内膜修复基本完成,蛋白继续下降,主要分布于腔上皮和腺上皮,间质少见。综上所述,随着内膜的修复进程,active β-catenin蛋白表达出现了先升高后下降的改变,而它是Wnt信号通路的核心分子,表明Wnt信号通路可能参与了内膜的修复进程。有学者报道[11],β-catenin能调节子宫内膜上皮的分化,介导腺体形成,其持续激活将导致小鼠子宫内膜过度增生,腺体增多增大,甚至产生基质细胞瘤[12]。而条件性敲除β-catenin导致腺体减少[11]。本研究结果显示β-catenin在修复后期主要分布于腺体形成的部位,间接印证了前人的结果,预示其在腺体形成中的作用,但仍需今后进一步探讨。而β-catenin mRNA相对表达量从48h开始略升高,72h最高,96h稍下降,与蛋白表达水平变化不完全相符,可能是由于本实验检测的是活性β-catenin,随着内膜修复逐渐完成可能Wnt通路活性下降,表现为部分β-catenin 蛋白被磷酸化降解导致活性β-catenin减少,并且子宫组织β-catenin mRNA相对表达量变化的幅度不大,最高仅达2倍左右,也许并没有很大的生物学意义。在许多情况下,蛋白表达和RT-PCR的结果不一致,可能是由于存在非编码RNA调节蛋白的翻译过程,导致虽然mRNA表达增加,而蛋白表达不增加,本实验是否存在这一情况尚待进一步验证。本研究还观察到切除卵巢后,内膜仍然可以增生修复,表明子宫内膜修复可以不依赖于雌、孕激素的作用,这与前人报道相似[13]。

在组织损伤修复中,干细胞起重要作用,已证实子宫内膜也存在成体干细胞。CD146主要表达在血管内皮细胞、周细胞,能提高细胞增殖活性,促进血管增生,是骨髓间充质干细胞的表面标志[14]。CD146在胚胎时期血管发育和肿瘤血管发生中起重要作用[15]。Schwab等[16]利用CD146及血小板源性生长因子受体β(PDGF-Rβ)两种血管周围细胞标志物在子宫内膜的共表达,显示CD146、PDGF-Rβ阳性的细胞具有间充质干细胞的特性,具有显著的克隆形成能力和多向分化潜能,因此把CD146、PDGF-Rβ作为内膜间充质干细胞的表面标志。Fayazi等[17]证实CD146阳性细胞分布于人子宫内膜基质血管周围,临近子宫腺。近期有报道内膜间充质干细胞在内膜的功能层和基底层均有分布,在月经期被激活,参与内膜周期性修复过程[18],而且干细胞因子可刺激分离的人子宫内膜CD146阳性细胞增殖[19]。

本研究结果显示CD146在小鼠子宫内膜修复过程中的时空表达规律与β-catenin相似,也出现了先升高后下降的改变,修复后期内膜基质中CD146阳性细胞明显减少,可能是由于部分内膜间充质干细胞分化为间质细胞,失去干细胞表面标志所致。Barragan等[20]早前也报道内膜间充质干细胞在体外分化为内膜间充质细胞的过程中失去CD146阳性标记。综上提示Wnt信号通路可能参与了内膜的修复进程,且可能与CD146阳性的内膜间充质干细胞有关。但其机制还需进一步探讨。

杠杆是能转动的棍子或板子，也可以是合页，它转动的中心点叫作“支点”。跷跷板就是一种杠杆。我不能用胳膊抬起罗克西，但我可以用跷跷板抬起它。其他杠杆可以帮助你把东西移动得更快或更远。

参 考 文 献

[1] Gao K,Shen Z,Yuan Y,et al.Simvastatin inhibits neural cell apoptosis and promotes locomotor recovery via activation of Wnt/β-catenin signaling pathway after spinal cord injury[J].J Neurochem,2016,138(1)：139-149.

[2] Cai S X,Liu A R,Chen S,et al.Activation of Wnt/β-catenin signalling promotes mesenchymal stem cells to repair injured alveolar epithelium induced by lipopolysaccharide in mice[J].Stem Cell Res Ther,2015,6(1)：65-72.

[3] Hsiao C M,Wu Y S,Nan FH,et al.Immunomodulator ‘mushroom beta glucan’ induces Wnt/β catenin signalling and improves wound recovery in tilapia and rat skin：a histopathological study[J].Int Wound J,2016,13(6)：1116-1128.

[4] Gunin A G,Emelianov V U,mironkin I U,et al.Lithium treatment enhances estradiol-induced proliferation and hyperplasia formation in the uterus of mice[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2004,114(1)：83-91.

[5] Polotsky A J,Liyin Zhu,Santoro N,et al.Lithium chloride treatment induces epithelial cell proliferation in xenografted human endometrium[J].Hum Reprod,2009,24(8)：1960-1967.

[6] Bukowska J,Ziecik A J,Laguna J,et al.The importance of the canonical Wnt signaling pathway in the porcine endometrial stromal stem/progenitor cells：implications for regeneration[J].Stem Cells Dev,2015,24(24)：2873-2885.

[7] Schwab K,Hutchinson P,Gargett C.Identification of surface markers for prospective isolation of human endometrial stromal colony-forming cells[J].Hum Reprod,2008,23(4)：934-943.

[8] Finn C A,Pope M.Vascular and cellular changes in the decidualized endometrium of the ovariectomized mouse following cessation of hormone treatment：a possible model for menstruation[J].J Endocrinol,1984,100(3)：295-300.

[9] Brasted M,White C A,Kennedy T G,et al.Mimicking the events of menstruation in the murine uterus[J].Biol Reprod,2003,69(4)：1273-1280.

[10] Wang Yongyi,Payman H M,Eline E,et al.Progesterone inhibition of Wnt/β-catenin signaling in normal endometrium and endometrial cancer[J].Clin Cancer Res,2009,15(18)：5784-5793.

[11] Jeong J W,Lee H S,Franco H L,et al.Beta-catenin mediates glandular formation and dysregulation of beta-catenin induces hyperplasia formation in the murine uterus[J].Oncogene,2009,28(1)：31-40.

[12] Tanwar P S,Lee H J,Zhang L,et al.Constitutive activation of Beta-catenin in uterine stroma and smooth muscle leads to the development of mesenchymal tumors in mice[J].Biol Reprod,2009,81(3)：545-552.

[13] Kaitu’u-Lino T J,Morison N B,Salamonsen L A.Estrogen is not essential for full endometrial restoration after breakdown：lessons from a mousemodel[J].Endocrinology,2007,148(10)：5105-5111.

[14] Shi S,Gronthos S.Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp[J].J Bone Miner Res,2003,18(4)：696-704.

[15] So J H,Hong S K,Kim H T,et al.Gicerin/Cdl46 is involved in zebrafish cardiovascular development and tumor angiogenesis[J].Genes Cells,2010,15(11)：1099-1110.

[16] Schwab K,Gargett C.Co-expression of two perivascular cell markers isolates mesenchymal stem-like cells from human endometrium[J].Hum Reprod,2007,22(11)：2903-2911.

[17] Fayazi M,Salehnia M,Ziae S.Characteristics of human endometrial stem cells in tissue and isolated cultured cells：an immunohistochemical aspect[J].Iran Biomed J,2016,20(2)：109-116.

[18] Shan X,Chan R W,Ng E H,et al.Spatial and temporal characterization of endometrial mesenchymal stem-like cells activity during the menstrual cycle[J].Exp Cell Res,2017,350(1)：184-189.

[19] Fayazi M,Salehnia M,Ziae S.The effect of stem cell factor on proliferation of human endometrial CD146+ cells[J].Int J Reprod BioMed,2016,14(7)：437-442.

[20] Barragan F,Irwin J C,Balayan S,et al.Human endometrial fibroblasts derived from mesenchymal progenitors inherit progesterone resistance and acquire an inflammatory phenotype in the endometrial niche in endometriosis[J].Biol Reprod,2016,94(5)：118-127.