慢性胃炎是指局限于胃黏膜层的慢性炎症,是消化系统中最常见的一类疾病,发病率高并常伴有癌变。它属于中医“胃脘痛”、“腹胀”、“嘈杂”、“痞证”等范畴。大建中汤作为治疗脾阳虚证的经典方剂,疗效确切,具有较高的开发应用价值。本课题组前期的研究表明,大建中汤在治疗脾阳虚腹痛中,血栓素-2、6-酮前列腺素、P-物质、COX-2等物质均改善[1-3],这些物质与炎症关系密切。本实验改良脾阳虚胃炎动物模型,RT-PCR、ELISA分别检测单核细胞的白介素受体相关激酶4(interleukin-1 receptor-related kinase-4， IRAK-4) mRNA表达水平和血清白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α， TNF-α)含量;并观察胃黏膜的病理变化,以探讨大建中汤治疗脾阳虚胃炎可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选用健康清洁级SD大鼠60只,体质量200g±20g,雌雄各半,由重庆腾鑫生物技术有限公司提供,许可证号：〔SCXK(渝)2012—000J〕。饲养条件：清洁、通风,温度：15℃～25℃,湿度：55%～70%,混合饲料喂养。

移栽期不同，烤烟在大田生育期间所处的气候条件就不同，从而对烤烟个体发育、生育进程及其产量和质量产生明显作用[18]。移栽过早，生长前期温光不能满足烟株生长的需要，烟株生长缓慢；随着移栽期的推迟，气温、地温、光照时数逐渐升高，光合作用增强，烟株的生长速度加快，烤烟的大田生育期缩短。因此，提早或者推迟移栽，均会对烟株的生长发育产生影响。试验结果表明，3个不同移栽期在各个生育时期的农艺性状差异明显。在成熟期，不同处理间的株高及叶面积差异显著，以4月25日移栽的烟株生长发育较好。叶片发育程度的不同，导致叶面积大小的差异，从而影响烟叶的产质量。从经济性状角度看，仍然以4月25日移栽较好。

1.2 分组和造模

实验大鼠随机分为6组,分为正常对照组,模型组,枸橼酸铋钾对照组,大建中汤高、中、低剂量组,每组10只。实验大鼠模型复制参考姒氏造模方法[4]略加改进,造模各组大鼠复制脾阳虚胃炎模型,主要分为2步。

1.2.1 脾阳虚造模 将大鼠正常饲养调整3d,使之适应环境后开始造模(除正常组外)。整个造模过程分为两大阶段(均自由饮水),共3周。第1阶段为前5d,饮食失节伤脾气——单日喂饲甘蓝10g/200g,双日喂饲精炼猪脂2mL/200g;劳倦过度伤脾气——每日38℃温水中游泳至疲劳(疲劳的标准为不能坚持游泳)。第2阶段为后6～21d,除饮食失节及劳倦过度因素外,加上苦寒泻下伤脾阳,每日加灌藩泻叶水浸液2ml/200g。大鼠出现倦怠、喜聚堆、腹泻、皮毛枯槁易落,不能坚持游泳、肛周污浊、躯体扭曲等现象,说明脾阳虚造模成功。

1.2.2 脾阳虚胃炎造模 脾阳虚造模成功后,给脾阳虚大鼠灌胃40%乙醇,每周一空腹1次,每次8ml/kg、20mmol/L去氧胆酸钠灌胃,每日上午1次,每次8ml/kg;0.05%～0.1%氨水作为大鼠日常饮用水自由饮用,并记录每日饮用量;0.05%吲哚美辛灌胃,每日下午1次,每次8ml/kg;并配以饥饱失常;连续90d后(每10d测体质量1次),脾阳虚胃炎动物模型复制成功,再将模型动物随机分为脾阳虚胃炎模型组、大建中汤大、中、小治疗组和枸橼酸铋钾对照组,每组10只。

1.3 试剂、药品、仪器

单核细胞分离试剂盒(加拿大Stem Cell公司);总RNA提取试剂盒,cDNA逆转录试剂盒(美国Fermentas公司);IRAK-4引物由大连宝生物设计合成;RT-PCR试剂盒(日本TaKaRa公司);TNF-α放射免疫试剂盒(购于上海江莱生物科技有限公司);IL-6放射免疫试剂盒(购于上海研晶生化试剂有限公司);制作石蜡切片相关试剂,脱氧胆酸钠(上海日初生物科技有限公司);无水乙醇(分析纯),氨水(分析纯)。

本文研究所用原料为金堆城钼业股份有限公司矿业分公司生产非标钼精矿(钼精矿物理化学指标见表1)，瓶装氧气，去离子水。

实验数据用表示,用SPSS 17.0分析软件进行统计分析。

以计算思维为导向进行计算机基础教育建设是计算机教育发展的正确方向，随着计算机的不断发展以及信息技术在教育领域的不断应用，计算思维能力的培养依旧是教育界，特别是计算机教育领域中一个热门话题。计算机教育改革必须融入计算思维理念，要积极进行教学内容、技巧和方式的转变，培养学生计算思维能力，只有这样才能保障计算机基础教育的效果。

对IL-6、TNF-α的免疫活性进行测定,并绘制其标准曲线,采用放射免疫法测定其血清中IL-6、TNF-α含量,其操作过程严格按照试剂盒操作步骤说明进行。

1.4 给药方法

取胃组织用石蜡包埋,切片,苏木素-伊红(H-E)染色,光镜下组织形态观察。

1.5 标本采集和保存

各组实验结束后,禁食24h,麻醉大鼠股动脉采血7ml,3000r/min离心15min(离心半径15cm),分离血清,-20℃保存。同时采集静脉血7ml,EDTA抗凝,按照Stem Cell公司的RosetteSep法提取外周血单核细胞(PBMC),-80℃保存。取大鼠胃小弯黏膜,-80℃ 保存。

1.6 病理组织学检测

从造模第91天开始分别给予各组大鼠相应药物灌服30d。具体为：正常对照组,灌服生理盐水7ml·kg-1·d-1;造模型组,灌服生理盐水7ml·kg-1·d-1;大建中汤高、中、低剂量治疗组,分别灌服大建中汤0.75、1.5、3.0g·kg-1·d-1;受试药对照组,灌服枸橼酸铋钾胶囊0.0162g·kg-1·d-1。

1.7 放射免疫法测定血清

TGL16A台式高速冷冻离心机(湖南凯达科学仪器有限公司);UV-1800紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司); HH-S4双列四孔恒温水浴锅(江苏省金坛市金南仪器制造有限公司);XSP-14A显微镜(上海光学仪器一厂);ProgRes® 数码显微镜照相机(业纳上海仪器设备有限公司)等。

1.8 对大鼠IRAK-4 mRNA表达的测定

单核细胞中IRAK-4 mRNA 表达水平测定,用TRIzol试剂抽提单核细胞总RNA,并逆转录为cDNA,采用SYBR GreenⅢ荧光定量检测IRAK-4 mRNA水平。以β-actin的PCR产物为内参标准,β-actin 基因上游引物5′-TGGGGTGATGCTGGTGCT GAGT-3′,下游引物为5′-AGGTTTCTCCAGGCGGC ATGTC-3′,扩增片段长度500bp;IRAK-4基因的上游引物为5′-TGCCTACTGCGTGTTGGGATTA-3′,下游引物为5′-CACACACACCCTCCAAACTCACT-3′,扩增片段长度为360bp;根据RT-PCR原始检测结果,分析得出各个样品的相对表达量。

1.9 统计学处理

大建中汤(贵阳中医学院中药制剂中心提供);100%番泻叶水浸液(自制);枸橼酸铋钾胶囊(丽珠集团丽珠制药厂生产,批号：261623);吲哚美辛肠溶片(重庆科瑞制药有限责任公司生产,批号：111025),可加水溶解后灌胃。

2 结果

2.1 胃黏膜病理组织变化

与正常对照组比较,模型组中IRAK-4 mRNA表达明显升高,与模型组相比大建中汤高、中、低剂量组IRAK-4 mRNA表达明显降低(P<0.01),大建中汤高、中、低剂量组与枹橼酸铋钾对照组比较无差异(P>0.05)(表1,图2)。

2.测评结果精准。经过绘画投射测验分析，筛查出部分社区服刑人员存在一定程度的心理问题，共计266人次，主要表现为抑郁情绪（约占总体6%）、焦虑情绪（约占总体6%）、攻击性倾向（约占总体30%）。

夜里她一直在书房看稿子。厚厚一摞打印稿，她需要在睡觉以前看完。天气闷热，大雨倾盆，念蓉起身，去阳台关好窗子。楚墨还没有回来，两个小时以前她给楚墨打电话，楚墨说他正在与朋友吃饭。电话里声音嘈杂，隔着电话念蓉也能闻到浓重的酒精气味。念蓉问他：“要不要我过去帮你把车开回来？”楚墨大着舌头说：“我不开车，我飞回去。”

  

图1 健脾温胃散对大鼠胃组织病理学的影响(H-E,×200)Fig 1 Effects of Dajanzhong decoction on stomach tissue pathology in rats (H-E,×200)A: Normal control group; B: Model group; C: Test drug control group;D: Dajianzhong high-dose group; E: Dajianzhong medium dose group; F: Dajianzhong small dose group

2.3 大鼠TNF-α、IL-6含量的变化

与正常对照组相比,模型组TNF-α、IL-6含量明显升高(P<0.01);与模型组相比大建中汤高、中剂量组TNF-α、IL-6含量明显降低(P<0.01);大建中汤高、中剂量组与受试药对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

 

表1 各组大鼠TNF-α、IL-6含量变化Tab 1 Changes in TNF-α， IL-6 and IRAK-4 mRNA content in each group

  

GroupTNF⁃α(ng/ml)IL⁃6(ng/ml)IRAK⁃4mRNA(μgRNA)Normalcontrolgroup0．67±0．1417．45±3．261．053±0．460Modelgroup1．61±0．16##37．34±5．83##2．735±0．082##Testdrugcontrolgroup0．75±0．12△△18．65±3．86△△1．073±0．073△△Dajianzhonghigh⁃dosegroup0．71±0．11△△19．23±3．72△△1．071±0．070△△Dajianzhongmedium⁃dosegroup0．88±0．15△△20．67±4．46△△1．091±0．069△△Dajianzhonglow⁃dosegroup1．55±0．18#36．86±5．55#1．093±0．065△△

#P<0.05,##P<0.01 vs control; △△P<0.01 vs model

2.4 大鼠IRAK-4 mRNA表达的变化

光镜观察结果表明：正常对照组胃黏膜腺未见萎缩,黏膜上皮规则、整齐,固有层可见散在淋巴细胞;模型组大鼠胃黏膜腺萎缩,呈慢性炎症表现,固有层可见灶性浸润的淋巴细胞,有形成的淋巴滤泡,胃黏膜基层变厚;枸橼酸铋钾组可见胃炎大鼠黏膜腺体轻度萎缩,浆细胞、淋巴细胞呈散在的弥漫性浸润,有扩张的小血管伴纤维增生,黏膜下层轻度增厚;大建中汤高剂量组大鼠胃黏膜有浆细胞、淋巴细胞呈散在浸润;大建中汤中剂量组大鼠胃黏膜固有层可见淋巴细胞灶性浸润,偶见扩张的小血管;大建中汤低剂量组在鼠黏膜组织呈慢性炎症,黏膜固有层可见浆细胞、淋巴细胞和少量中性粒细胞浸润,黏膜下层变厚(图1)。

3 讨论

中医经典方剂大建中汤以其在治疗脾阳虚胃肠疾病方面独特的疗效,被历代医家推崇。传统中医理论认为大建中汤具有温中补虚,降逆止痛、扶正祛邪的功效。而现代研究表明其具有抗炎、抗感染、抗肿瘤、驱寒镇痛的功效。大建中汤治疗胃炎有效机制可能与抑制幽门螺旋杆菌、保护胃黏膜、抗炎,影响胃黏膜内分泌细胞,胃肠激素的分泌,改善胃黏膜血流量等作用有关[5-6]。本课题组前期研究证实大建中汤治疗脾阳虚腹痛有效,同时能调节炎性因子的含量,表明大建中汤可能对炎症有治疗作用。

  

图2 大建中汤对大鼠胃组织 IRAK-4 mRNA 表达的影响Fig 2 Effects of Dajanzhong decoction on IRAK-4 mRNA expression in stomach tissue of rats1: Normal control group; 2: Model group;3: Test drug control group; 4: Dajianzhong high-dose group;5: Dajianzhong medium dose group; 6: Dajianzhong small dose group

本研究通过饮食失调、劳倦过度、苦寒泻下等措施,再先后应用40%乙醇和20mmol/L去氧胆酸钠灌胃大鼠,大鼠自由饮用0.1%氨水,之后用0.05%吲哚美辛灌胃,并配以饥饱失常,最终成功制造脾阳虚胃炎模型。本实验也显示,模型组大鼠胃黏膜腺萎缩,呈慢性炎症表现,固有层可见灶性浸润的淋巴细胞,有形成的淋巴滤泡,胃黏膜基层变厚;而大建中汤治疗后大鼠胃黏膜腺体轻度萎缩,黏膜下层轻度增厚,浆细胞、淋巴细胞呈散在浸润。这说明了该方剂治疗胃炎有效。

TNF-α在致炎过程中起重要作用,与炎症活动性呈正相关[7]。IL-6作为前炎症细胞因子,在炎症反应过程中起着重要的作用,是敏感反映机体炎症和组织损伤严重程度的重要指标[8]。IL-6、TNF-α等细胞因子作为重要的炎症介质参与机体的炎症反应[9]。生理状态下,人体液中TNF-α和 IL-6水平较低,但在病理状态下,TNF-α和IL-6分泌量增加以及引起的各种炎症因子的瀑布式释放可导致炎症反应,引起组织细胞损伤。

厨电龙头企业业绩的一片飘红充分表明，厨电市场增长潜力依然巨大，当前的市场遇冷态势，仅仅是行业生命周期的正常反应，但是，这块巨大的蛋糕已然不是人人有份。从业企业想要分得一杯羹，就必须积极求新突破。事实上，厨电龙头企业们业绩能够保持增长，正是因为它们已经在积极行动。专业厨电企业开始积极扩充品类，如，老板控股金帝，强势抢滩集成灶市场；华帝股份购买了中山市华帝环境科技有限公司部分股权，入局空净领域；综合型企业则积极整合全球化优势资源，如，海尔发布大厨电战略，五大品牌协同，形成了品牌集群优势以及用户差异化服务优势。

最新研究表明[10],白介素-1受体相关激酶 (IRAK)家族参与炎症反应和机体先天性免疫反应过程,在炎症信号转导通路中起着重要作用。目前研究表明,IRAK-1、IRAK-2、IRAK-4、IRAK-M是IRAK家族中的 4个成员。Rekhter等[11]研究也显示,在HEK293细胞中过表达激酶失活型的IRAK-4与野生型相比,不能激活NF-κB,阻断了IL-1和IL-8的产生。其中,IRAK-4是IRAK家族中最重要的一种激酶,它能激活核因子-κB(NF-κB),活化的NF-κB进入细胞核,引起促炎细胞因子基因的转录和表达,从而使各种炎性细胞因子表达升高[12]。因此,IRAK-4在炎症信号通路和免疫反应过程中的作用较家族其他激酶更为关键。

本实验结果表明,大建中汤能够降低脾阳虚胃炎模型组大鼠血清中IL-6、TNF-α以及血液单核细胞中IRAK-4 mRNA的水平,提示大建中汤治疗胃炎脾阳虚证的机制可能与降低IL-6、TNF-α、IRAK-4的水平有关。据此,大建中汤治疗脾阳虚胃炎有较大的发展前景,应继续加强对该方治疗炎症的机制研究,并进行深层次的开发利用,以为临床提供科学依据。

参 考 文 献

[1] 武静.大建中汤对脾阳虚腹痛大鼠CaMKⅡmRNA的影响[J].江西中医药,2015,(8)：23-25.

[2] 王慧,武静,陈继婷.脾阳虚大鼠下丘脑星形胶质细胞GFAP和小胶质细胞OX42的表达及大建中汤的干预作用[J].时珍国医国药,2013,24(2)：304-305.

[3] 王俊霞,陈继婷.大建中汤对脾阳虚疼痛大鼠模型血中NO、β-EP影响的实验研究[J].辽宁中医药大学学报,2008,10(12)：170.

[4] 魏盛,朱德豪,张克升,等.仁青常觉治疗MNNG致大鼠慢性萎缩性胃炎的实验研究[J].中药新药与临床药理,2015,26(1)：54-57.

[5] 沈桢巍,雷撼,高鹏飞.日本汉方大建中汤在消化道外科领域的基础与临床研究进展[J].世界中西医结合杂志,2011,6(3)：261-264.

[6] 赵昌,王卫星.大建中汤治疗胃溃疡的临床疗效观察[J].中医临床研究,2014,6(5)：108-109.

[7] 李卫,刘佳,白家媛,等.α肿瘤坏死因子的研究进展[J].动物医学进展,2010,31(12)：108-110.

[8] 李婷,朱向东,杨意,翟艳会.痛泻要方对溃疡性结肠炎大鼠下丘脑中IL-6,IL-6R表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2017,23(11)：103-108.

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[10] 李帆,芮耀诚.IRAK4在白介素-1受体/TOII样受体(IL-1R/TLRs)介导的炎症信号通路中的关键作用[J].药学实践杂志,2011,29(1)：1-3.

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[12] Kim K J,Yoon K Y,Yoon H S,et al.Brazilein suppresses inflammation through inactivation of IRAK4-NF-κB pathway in LPS-induced Raw264.7 macrophage cells[J].Int J Mol Sci,2015,16(11)：27589-27598.