嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor-modified T cells，CAR-T)是经过基因工程修饰后的T细胞，在细胞膜上表达特异性的单链抗体片段(single-chain variable fragment，scFv)，并以此识别靶抗原，通过T细胞受体ζ链、共刺激分子等胞内区传递活化信号至细胞内，T细胞随后活化、增殖并表现出特异的细胞毒性，从而杀伤靶细胞[1]。CAR-T治疗技术在血液系统肿瘤的治疗中已取得突破[2-3]，在实体肿瘤的研究中也展现出广阔的应用前景[4]。

蛋白L(protein L)是从消化链球菌中分离出来的一种抗体结合蛋白，能与IgG、IgM、IgA、IgE和IgD等抗体的kappa轻链相结合，且不影响抗原结合位点[5]。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)的scFv是由抗体重链可变区(variable region of heavy chain，VH)和轻链可变区(variable region of light chain，VL)通过短肽连接而成，理论上VL有蛋白 L结合的位点。本研究旨在探讨基于蛋白L染色方法的流式细胞术检测CAR表达的可行性。

1 材料与方法

1.1 研究对象 血液样本取自2017年2月至8月在苏州大学附属第三医院参加“嵌合抗原受体T细胞治疗化疗抵抗的或难治性CD19阳性淋巴瘤”临床试验的2例患者，其中男1例，年龄66岁，弥漫大B细胞淋巴瘤，Ⅳ期B组；女1例，年龄45岁，弥漫大B细胞淋巴瘤，Ⅲ期B组，免疫组化染色均CD19阳性。此临床试验经过医院伦理委员会批准，患者知情同意。

1.2 主要试剂及仪器 人全血单个核细胞分离液(天津灏洋公司)，LS分离柱(德国Miltenyi公司)，RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)，CD3分选磁珠、抗人CD28单克隆抗体(anti-CD28 mAb)(德国Miltenyi公司)，T75、T225细胞培养瓶(美国Corning公司)，抗人CD3单克隆抗体(anti-CD3 mAb，美国eBioscience公司)，重组人成纤维连接蛋白(RetroNectin，日本TaKaRa公司)，anti-CD19 scFv-CD28-CD3ζ CAR、anti-CD22 scFv-CD137-CD3ζ-tEGFR CAR(上海恒润达生公司)，重组人白细胞介素-2(rhIL-2，山东泉港药业公司)，Jurkat细胞株(Clone E6-1，美国ATCC)，重组生物素化蛋白L(recombinant biotinylated protein L，美国Pierce Biotechnology公司)，藻红蛋白(PE)标记链霉亲合素(streptavidin-PE，美国Invitrogen公司)，生物素化羊抗鼠IgG, 抗体、生物素化羊抗人IgG,抗体(美国Jackson Immunoresearch公司)，CD3-APC-Cy7、同型对照IgG2a-APC-Cy7(美国BioLegend公司)，细胞活性染料(fixable viability dye，FVD,美国eBioscience公司)。非组织培养处理24孔板(美国Costar公司)，Spectra Optia血细胞分离机(美国Terumo BCT公司)，FACS Canto II流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)，MidiMACS分选器(德国Miltenyi公司)，KR2.5i离心机(法国Jouan公司)，二氧化碳培养箱(美国Thermo Fisher公司)。

1.3 磁珠分选法分离T细胞 用血细胞分离机采集患者空腹状态下的单个核细胞约5×108个，Ficoll密度梯度离心法提取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)，PBS清洗细胞2次，加入CD3分选磁珠(20 μL/107 cells)，充分混匀，4～8 ℃反应20 min，加入LS分离柱，阳性选择，分选获得CD3+细胞，计数并且检测分选纯度。

通过scFv-biotinylated protein L-streptavidin-PE-流式细胞方法检测细胞上CAR的表达，结果显示，加入蛋白L的实验组能检测到CAR-T细胞群体，未加入蛋白L的空白组难以检测到CAR-T细胞群体，见图1。

在概念网络中，可以围绕着一个中心概念进行动态生成，从而找到与它相关的概念，这使得类比推理具有较好的扩展性，具有联想的特征。由此可见，类比推理能拓展人们的思维，产生新的概念、思想和方法，有利于创新。但是，也可能随着概念的无限制的扩展，形成一些矛盾的或无关的信息，使得类比推理的前提与结论不一致或不相关。

1.5 Jurkat细胞株培养 Jurkat细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基培养传代。细胞悬浮生长，培养浓度为1×106/mL。

局部放电信号通常伴有能量变化,因此通过提取短时能量和短时平均幅度有助于判断局部放电信号。设语音波形时域信号为x(n),加窗函数ω(n)分帧处理后得到的第i帧语音信号为yi(n),则yi(n)满足:

滴度试验中分别加入蛋白L 0.01、0.125、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μg，结果显示CAR-T细胞表达率变化呈曲线形态，蛋白L结合scFv存在量效关系，饱和结合后测定达到最高值，过量加入蛋白L会影响实验结果。经过重复实验，最后确定在1×106个细胞、200 μL反应体积的染色方法中，蛋白L最适合加入量是1.0 μg，见图1。结果间接证明蛋白L能特异性结合到CAR-T细胞的scFv上。

2.1 蛋白L和scFv特异性结合的验证 为验证蛋白L能否和scFv特异性结合，选择来源于人急性T细胞白血病的Jurkat细胞株作为通用型T细胞，取对数生长期的Jurkat细胞，用临床效果最为显著的靶向CD19的CAR(anti-CD19 scFv-CD28-CD3ζ CAR)转染，加入含rhIL-2 500 IU/mL的RPMI 1640培养基，诱导培养成CAR-T细胞。

1.7 CAR-T细胞培养 将病毒转染后的细胞悬液吸出，500×g、4 ℃离心10 min。用含500 IU/mL rhIL-2的RPMI 1640培养基重悬细胞，加入新的T75细胞培养瓶中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。每天观察细胞的生长状况，适时补加含500 IU/mL rhIL-2的RPMI 1640培养基，调整细胞浓度为0.5×106/mL，适时转T225培养瓶，培养12～14 d获得CAR-T细胞。

1.8 流式细胞方法分析CAR-T细胞表型 取1×106个CAR-T细胞，加入3 mL PBS混匀，400×g离心5 min，吸净上清液，重复清洗2次，加入200 μL PBS重悬细胞。蛋白L组加入1 μg重组生物素化蛋白L(50 μg/mL)；Anti-IgG组加入2 μL生物素化羊抗鼠IgG, 抗体或生物素化羊抗人IgG,抗体。4 ℃反应45 min。重复清洗3次，加入200 μL PBS重悬细胞。加入20 μL streptavidin-PE(10 μg/mL)及20 μL CD3-APC-Cy7，4 ℃避光反应30 min。清洗1次，加入200 μL PBS重悬细胞。加入10 μL细胞活性染料(50 μL/mL)，4 ℃避光反应30 min。清洗1次，加入400 μL PBS重悬细胞，用流式细胞仪检测。FVD染色设门去除死细胞所致的非特异性染色，结果使用FlowJo 10软件分析。

对于互联网来说，其具有开放、便捷的特点。因此，教师在进行个人空间建设的过程中可以利用知行合一的特点对个人的教学反思进行发布，对于其他人可以通过浏览并对这一教学反思进行系统的评价，从而使教师能够更好地实现教学资源的有效整合，在与其他教师进行交流与沟通的过程中实现对自身的教学方法的完善，使学生能够准确地掌握教学动态。教师个人空间的建设对教学进行了变革，使课堂变成了没有时间限制，没有空间限制的学习地点，也对教师的个人理念进行了革新，教师与学生可以就课堂以外的碎片化时间进行学习，最终实现教师教学能力、学生学习能力的有效提高。

1.4 T细胞活化 用含rhIL-2 500 IU/mL、anti-CD3 mAb 50 ng/mL、anti-CD28 mAb 100 ng/mL的RPMI 1640培养基调整细胞浓度为2×106/mL，加入T75细胞培养瓶，置于37 ℃，5% CO2培养箱培养48 h。

2 结果

要坚持走开放型、创新型和高端化、信息化、绿色化发展的新路子，构建现代产业新体系，从中寻找突破口和切入点，做好产业转型升级的统筹规划，进一步明晰产业转型升级的总体思路、目标任务、方向路径、工作重点和落实机制，扬长避短发挥比较优势，加快推动产业结构由中低端向中高端迈进。推进高原特色农业现代化，促进三大产业融合发展，提高质量效益和竞争力。实施“中国制造2025”云南行动计划，有选择性地承接东部地区出口加工业转移，探索“共建园区”或“飞地经济”，实行引进产业与本地特色有优势产业的有机融合、联动发展。

当然，以上未列出的山西杰出学者尚多，仅清代就有孙嘉淦及徐润第、徐继畲父子等人。 而从三晋学术史或中国学术史的角度来看，以上所列学术团体及重要学人，皆对当时及后世的学术产生过一定的影响，其中皆有本省学者与外地名宦、寓贤交流互动的痕迹。

1.6 CAR逆转录病毒转染 预先用重组人成纤维连接蛋白(30 μg/mL)包被非组织培养处理24孔板。每孔加入2 mL CAR逆转录病毒液(anti-CD19 scFv-CD28-CD3ζCAR或anti-CD22 scFv-CD137-CD3ζ-tEGFR CAR)，32 ℃、2 000×g离心2 h，弃去上清液。每孔加入1 mL活化的T细胞(0.5×106个)，30 ℃、1 000×g离心10 min，培养板置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。吸取细胞，按上法重复转染1次。

 

注：0.00 μg表示空白组；0.01～4.00 μg表示加入不同量蛋白L的实验组。

图1 蛋白 L滴度试验流式验证结果

2.2 基于蛋白L的染色方法检测肿瘤患者的CAR-T细胞 1例患者anti-CD19 scFv-CD28-CD3ζCAR转染的T细胞中CD19-CAR-T细胞比例：蛋白L实验组71.6%、Anti-IgG对照组64.2%，见图2；anti-CD22 scFv-CD137-CD3ζ-tEGFR CAR转染的T细胞中CD22-CAR-T细胞比例：蛋白L实验组53.1%、Anti-IgG对照组46.3%，见图3。另外1例患者CD19-CAR-T细胞比例：蛋白L实验组49.3%、Anti-IgG对照组43.8%；CD22-CAR-T细胞比例：蛋白L实验组56.5%、Anti-IgG对照组64.0%。成组的实验数据比较类似。结果表明scFv-biotinylated protein L-streptavidin-PE流式细胞方法可用于肿瘤患者的CAR-T细胞的常规检测。

 

图2 蛋白L实验组/Anti-IgG对照组CD19-CAR-T的流式分析

 

图3 蛋白L实验组/Anti-IgG对照组CD22-CAR-T的流式分析

3 讨论

目前,流式细胞技术和PCR法是检测CAR-T细胞常用的手段，如用PE标记的B细胞成熟抗原(B-cell maturation antigen，BCMA)/FC融合蛋白检测BCMA-CAR-T细胞[6]；采用Alexa 488标记的CD19sIg1-4融合蛋白检测CD19-CAR-T细胞[7]，靶抗原/Fc融合蛋白检测CAR的特异性较好，但是重组融合蛋白成本、技术要求较高，且一种融合蛋白只能检测一种CAR。应用AF647标记的羊抗鼠IgG抗体检测PSCA-CAR-T细胞[7]，此法虽然可以检测鼠源性scFv，但scFv物种来源较多，而且不同的多克隆抗体导致不同的检测结果。Porter等[8]抽提患者PBMC全基因组DNA，针对anti-CD19 CAR的转基因序列设计TaqMan探针，用实时荧光定量PCR方法检测CD19-CAR-T细胞，此法可用于微量细胞检测，但无法检测细胞转染效率和其他类型CAR-T细胞。

本研究利用蛋白L能特异性结合抗体、单链抗体kappa型轻链的特性设计方案，CAR-T细胞scFv和生物素化蛋白 L饱和结合，生物素再结合荧光染料标记的链霉亲合素，最后通过流式细胞仪检测荧光强度，间接测定CAR-T细胞。实验结果表明，该方法能够检测到CD19-CAR、CD22-CAR的表达。初步表明基于蛋白L的染色方法可以检测CAR-T细胞。生物素-亲合素系统具有放大作用，蛋白L方法的检测灵敏度应该更高。本研究选用的anti-CD19 scFv-CD28-CD3ζCAR、anti-CD22 scFv-CD137-CD3ζ-tEGFR CAR的轻链都是kappa型，其中CD19-CAR的scFv为鼠源性、CD22-CAR的scFv为人源性，初步结果表明：只要scFv轻链是kappa型，无论scFv的靶向性和物种来源，基于蛋白L的流式细胞方法都有望用于CAR-T细胞的检测。

由于靶抗原仅选择了CD19、CD20，常见的CD22、CD30、CD33、CD138、PSMA、Mesothelin、EGFR、EGFRvIII、CEA、GD2、FAP、Glypican-3和HER2等CAR需要进一步验证[9-10]。此外，蛋白L只能结合特定类型的轻链：人类VκI、VκⅢ和VκⅣ型kappa轻链，鼠类VκI型kappa轻链。

综上所述，我们利用蛋白L能特异结合免疫球蛋白和单链抗体kappa型轻链的特性开发出新的流式染色方法，通过单链抗体片段-蛋白L-生物素-亲合素-荧光染料染色，经流式细胞仪测定CAR的表达。基于蛋白L的染色方法检测CAR-T细胞具有经济性与通用性功能，将在评估细胞转染效率、细胞回输量和细胞体内存活时间方面起到重要的作用。

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[3]Porter DL, Levine BL, Kalos M, et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia[J]. N Engl J Med, 2011, 365(8): 725-733. DOI: 10.1056/NEJMoa1103849.

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[5]Lakhrif Z, Pugniere M, Henriquet C, et al. A method to confer Protein L binding ability to any antibody fragment[J]. MAbs, 2016, 8(2): 379-388. DOI: 10.1080/19420862.2015.1116657.

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[8]Porter DL, Hwang WT, Frey NV, et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia[J]. Sci Transl Med, 2015, 7(303): 303ra139. DOI: 10.1126/scitranslmed.aac5415.

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