基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)应用于微生物鉴定已有10余年的历史。MALDI-TOF MS的微生物鉴定基于待测菌蛋白质指纹与数据库的匹配度，主要分为上机前(参数设置、仪器维护与校准、菌株与试剂的准备)、上机中(谱图采集及比对)及结果判读3个步骤，每个环节的异常均会影响鉴定结果[1]。因此，严格的室内质量控制对MALDI-TOF MS微生物鉴定至关重要。然而，目前国内外相关的研究报道仅为鉴定应用指南，并未对质量控制进行详细指导说明[2-3]。本实验室根据多年应用经验，总结、建立了一套MALDI-TOF MS微生物鉴定室内质量控制体系，内容覆盖硬件、软件及人工操作各个环节，使鉴定结果异常时可迅速溯源并及时处理。

1 上机前质量控制

上机前准备工作包括仪器的参数设置、待测菌的前处理和试剂准备等。其质量控制则依靠标准品校准及标准菌株平行检测实现，且需建立完整的文件体系，记录每次实验的操作者、时间、仪器状态及质量控制相关结果等。

1.1 MALDI-TOF MS仪器参数设置及维护

（2）配备护航拖轮“云港十六”（在航线熟悉以及确保天气良好的情况下可以不配备），其职责主要是担任引航及护航任务。遇到恶劣气候，如雾天可在半潜驳近旁鸣雾号，随时观测半潜驳的吃水及灯标情况；在天气正常情况下，又可作为主拖轮的助拖，以增加拖航速度；在海域情况较复杂区域，如养殖区渔船、渔网多等情况，提前探清航行前方的碍航设施，提醒主拖轮避让；遇异常情况时，积极参与抢险。

首先，国有企业应明确财务管理领导责任，分别设置“总会计师”和“财务总监”岗位。其中，总会计师在企业负责人的领导下，专职负责组织企业内部的财务管理和会计核算监督工作。即财务管理实行总会计师负责制，总会计师是财务管理活动的总指挥。但是，财务总监属于客观的第三者，不参与企业经营管理工作，不对企业实施财务监督。通过财务监督，有助于及时查错防弊，确保会计核算的真实性，防止国有资金流失，保障国有资本保值增值。会计部门的业务主要包括经济业务核算、会计报表编制、会计分析、会计控制。会计业务反映的是过去已经发生的业务，而财务管理面向的是即将发生的事项。

1.5.2 改良直涂法 于直涂法滴加基质前，先覆盖1 μL 70%甲酸辅助破壁，以提高蛋白质析出效率。此方法适合细胞壁较厚的细菌和酵母样真菌。

1.1.2 硬件维护 (1)设备保养：使用过程中一些操作会影响仪器状态和使用寿命，因此仪器需由厂家进行季度保养和维护，由实验室自行进行周保养。内容包括离子源清洗、密封圈的擦拭等。(2)激光器维护：目前多数质谱采用N2激光器，寿命约为6×107次，使用时要尽可能减少激光发射次数，以延长激光器的使用寿命；每日使用完毕后关闭激光器，防止突然断电对激光器造成损坏。(3)真空系统维护：尽可能减少进出靶次数和时间；不使用时，靶位应处于“in”状态，以免造成靶损坏和真空环境破坏，影响下一次使用；靶板干燥后再进靶，否则会影响系统的真空状态并使抽真空时间延长；减少仪器重启次数；断电前应先关闭仪器，使仪器的真空状态缓慢下降后再关闭电源，以免对仪器造成损坏。(4)靶板的洗涤及保养：使用后的靶板应尽快清洗，防止样品吸附过久难以去除及污染实验室环境。洗涤方法：首先，用70%乙醇浸泡5 min(覆盖靶点即可，减少与靶板背面磁铁粘合处的接触)，流动的自来水冲洗，用无尘布擦拭。然后，覆盖80%的三氟乙酸水溶液，并用无尘布擦拭。最后，用去离子水冲洗靶板，再用无尘布擦干。于空气中干燥15 min，置于塑料盒中保存。

1.6 质量控制菌株的应用 MALDI-TOF MS鉴定过程大多数步骤的操作合格与否无直接判断标准。利用质量控制菌株(下文简称质控菌株)进行平行前处理及上机检测，可用以评定人员操作是否规范、仪器设置和状态是否最佳、所用试剂是否符合要求以及靶板是否清洁，从而反映鉴定结果的可信度。选择国际认可的标准菌株，需覆盖金黄色葡萄球菌(如ATCC 29213)、屎肠球菌(如ATCC 19434)、大肠埃希菌(如ATCC 25922)、铜绿假单胞菌(如ATCC 27853)、肺炎克雷伯菌(如ATCC 27736)及白假丝酵母菌(如ATCC 90028)。最高峰信号强度>1 000、分辨率(两峰间距与两峰平均宽度之比m/Δm)介于800～120之间、信噪比(S/N)>2 000，且细菌质控菌株鉴定分值≥2.000、酵母样真菌≥1.700视为合格。若进行分枝杆菌、丝状真菌等特殊病原体的检测，则应分别使用分枝杆菌、丝状真菌的标准菌株进行平行前处理及检测，以实现质量控制。

1.2.1 校准品 使用细菌检测标准品(bacterial test standard，BTS)进行校准。其主要成分为大肠埃希菌DH5α提取物、RNAse和肌红蛋白，含有8个参比蛋白，分别为RL29[M+2H]2+、RS32[M+H]+、RS34[M+H]+、RS33meth[M+H]+、RL29[M+H]+、RS19[M+H]+、RNAse A[M+H]+和肌红蛋白[M+H]+，其平均相对分子质量分别为3 637.8、5 096.8、5 381.4、6 255.4、7 274.5、10 300.1、13 683.2和16 952.3，覆盖的相对分子质量范围为3 600～17 000。

1.用于治疗缺铁性贫血的常用药物硫酸亚铁片，常被制成包衣片，是为了________________________________。

1.2.3 可能出现的问题 如果较长时间没有校准仪器，m/z偏差过大，不能自动分配校准峰，应依次对各个峰进行手动指认。若个别峰信号不好或误差值较大，可放弃该峰。校准列表里的8个峰，至少有4个与BTS产生的峰相符，峰强度至少为200提示校准合格。

1.3 待测菌株的准备 微生物质谱鉴定检测的是核糖体蛋白、热休克蛋白等细胞内高丰度蛋白。各种微生物生长速率、生长条件和营养要求不尽相同，因此可根据临床症状或涂片结果对微生物种类进行初步判断并选择合适的培养时间、培养温度和培养基[5]。

1.5.1 直涂法 用一次性无菌枪头或接种环挑取适量菌涂抹在靶点上形成均匀的薄菌膜(见图2)，覆盖基质1 μL，待室温下形成共结晶并干燥后，直接上机检测。此方法仅适用于细胞壁薄、较易裂解的革兰阴性菌和部分革兰阳性菌。

1.3.2 菌株准备的注意事项 (1)不同的pH会影响菌株的生长速率，但质谱检测的是m/z值为2 000～20 000的蛋白质，主要是高丰度的核糖体蛋白，pH值的变化对其影响不大[10]。(2)进行质谱检测的细菌必须为纯菌落，混合菌落会造成鉴定分值降低甚至鉴定失败。(3)细菌的生长阶段会对鉴定结果造成影响，对数生长期的菌落鉴定效果较好，此期微生物酶系活跃，代谢旺盛，细胞群体的形态和生理特性最一致。(4)尽可能选择非选择性培养基上的菌株进行质谱检测，培养基中的染料等成分会对鉴定造成不利影响。Lüthje等[11]证实显色培养基上生长菌株的鉴定分值低于非选择性培养基，其差异具有统计学意义。

1.4 基质的准备

1.4.1 基质的作用 基质是离子化过程的能量传递载体，可以吸收大量激光从而减小激光对样本直接照射造成的破坏[12]。使样本分子与基质形成均匀结晶，能增强样本对激光的吸收能力。好的基质要求对激光有很强的吸收，能与被测物共溶于合适的溶剂体系，在真空状态稳定存在，能促进被测物离子化，同时不存在分子间作用。

1.2.2 校准方法 分内标法和外标法。内标法为样本与标准品覆盖于同一靶点，其校准精确度高[4]，但操作繁琐，且样本的鉴定易受标准品干扰。因此，通常采用样本与标准品点在不同靶点的外标法进行校准。其质量精确度虽低(≤350 ppm)，但BTS与样品蛋白质无相互干扰。按照仪器说明书制备体外诊断BTS(in vitro diagnostic bacterial test standard，IVD BTS)，配制过程中避免溶液起泡。取IVD BTS溶液1 μL点在空白靶位上，晾干后覆盖1 μL基质，再次晾干，上机检测。使用线性正离子模式进行测定和校准。设置激光照射次数为40次，单个靶点不同位置叠加6次，得到激光照射次数为240次的谱图，将谱图进行平滑处理，进行自动寻峰和分配。检查校准峰值的自动分配是否正常，若所有峰值(RL29、RS32、RS34、RS33、RL29、RS19、RNAse A、肌红蛋白)都已分配，最大偏差(Err)均不超过±300 ppm，且误差有正有负，表示校准成功。若误差值较大，应重复校准直至满足要求。

1.4.2 基质的成分 常用的MALDI-TOF MS基质有α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, α-CHCA)、2，5-二羟基苯甲酸、3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸等。微生物鉴定采用最适用于肽和小分子蛋白质检测的α-CHCA。溶剂为乙腈、水、三氟乙酸体积比为20∶19∶1的混合液，加入过量α-CHCA粉末，充分混匀，配制成过饱和溶液。配制好的基质液可室温保存1周，涡旋混匀2 min或超声震荡30 s后再离心使用。

1.4.3 基质液质量的简单判断 (1)若配制好的基质液放置一段时间后，沉淀增多，且经混匀不溶，则需重新配制。(2)靶点覆盖基质后，若在短时间内形成均匀淡黄色结晶，可初步判断为基质质量良好；若覆盖基质后，长时间未形成明显结晶，可能基质质量有问题。(3)观察质谱仪镜头下的样本状态，若为均匀分布的明亮粗颗粒(见图1A)，提示结晶状态良好；若颗粒暗沉、分布不均或过于致密，则结晶状态不良(见图1B)。

 

注：A，基质状态良好；B，基质状态不良。

图1 质谱仪镜头下的样本状态

在大部分的数据库教材编排中，数据库的理论知识和实践操作是分开的，这种章节安排既有好处又有值得商榷之处。好处在于对于接受能力较强的本科层次学生，他们可能需要参加对数据库理论要求较高的计算机二级考试，牢固掌握理论知识点是必然的要求。但是对于高职层次的学生而言，他们不需要参加数据库等级考试，只要求“懂理论会实践”。高职学生的思考能力和理解能力欠缺，容易产生畏难情绪，过多和较深的理论会使他们渐渐失去耐心，等待到真正开始上机建库建表时，学生早就已经被前面的大篇幅理论磨的去了兴致。

高职院校旅游专业人才培养目标的实现，离不开较强的专业师资力量。教师们具备了较强的创新精神，具有精神的专业知识和能力，对旅游行业的发展有深刻把握，才能培养出满足旅游行业发展的人才。我国的旅游教育尚处于初期发展阶段，很多高职旅游专业是从以前的工商管理、经济管理以及外语等其他专业的基础上发展而成的，这造成一些调岗到旅游专业的教师对旅游专业相关理论知识认知不够深刻。

1.3.1 培养条件的选择 (1)普通细菌使用哥伦比亚血平板(或巧克力平板)置于35 ℃普通培养箱温育18～24 h，怀疑流感嗜血杆菌感染时同时接种巧克力平板置于35 ℃ 5% CO2培养箱温育。(2)厌氧菌使用CDC厌氧培养基置于厌氧袋或厌氧罐35 ℃温育72 h效果最佳。(3)真菌使用沙保弱培养基置于25 ℃培养箱培养[6]，生长缓慢的真菌根据其生长特征需要培养3～7 d，甚至1个月。丝状真菌最好选用液体沙保弱培养基，震荡培养，长出疏松菌丝时进行质谱鉴定[7]。研究发现，丝状真菌培养120 h效果最好[8]。本实验室发现部分丝状真菌可选择生长初期鉴定，如曲霉、链格孢霉、瓶霉等。(4)分枝杆菌则应接种含有血清、卵黄、马铃薯等成分的L-J培养基置于35 ℃普通培养箱温育。不同分枝杆菌生长速率迥异，快生长分枝杆菌需培养3～5 d，慢生长分枝杆菌则需2周以上[9]。

1.1.1 参数设置 仪器的参数在安装过程中均已设定，一般情况下无需更改，只需在每次使用前观察参数设置是否正常即可。若出现异常，可联系厂家或根据仪器说明书进行修改。MALDI-TOF MS用于微生物鉴定的仪器参数常默认如下。(1)线性模式：适合生物大分子(蛋白质、核酸、多聚物)，分辨率和质量准确度低于反射模式，测定结果为平均相对分子质量。(2)正电荷模式：加质子峰，加合碱金属峰(加Na+峰；加K+峰)，减e-峰。负电荷模式：加e-峰，加Cl-峰。(3)扫描范围和检测增益的设置：质荷比(m/z)扫描范围设为2 000～20 000，若检测信号较弱，可适当提高检测器增益。(4)离子源参数设置：加速电压20 kV，提取电压16.7 kV，聚焦电压6.5 kV，激光频率60 Hz，提取延迟时间120 ns。初始能量不均会导致谱峰变宽、分辨率降低，而延迟提取产生的聚焦效果可有效补偿初始能量不均。

 

注：上排4个标本涂抹均匀;下排左1标本涂抹过厚,余下3个标本为涂抹不均。

图2 直涂法

1.5.3 甲酸-乙腈提取法 挑取中等大小菌落3～5个于1.5 mL的eppendorf管中，加入去离子水300 μL充分混匀，加入900 μL无水乙醇混匀，静置10 min灭活微生物。12 000×g离心2 min，弃上清，再次离心2 min，弃上清，开盖挥发掉残余的乙醇和水(约3 min)。加入50 μL 70%甲酸，充分混匀，室温放置裂解3 min，加入50 μL乙腈，混匀，12 000×g离心2 min，取上清1 μL点靶，室温干燥，覆盖1 μL基质，干燥后检测。此方法准确性高且保证生物安全性，但耗时较长，一般用于改良直涂法鉴定分值不高的黏液型菌落、干燥型菌落及大部分革兰阳性菌等[12]。

1.5 菌株的前处理 菌株前处理的标准化对于MALDI-TOF MS鉴定结果的可信度及重现性至关重要。质谱菌株前处理方法多种多样，根据菌株特性相对地选择合适的前处理方法可以提升鉴定性能。目前常用菌株前处理方法主要有以下方法。

综上所述:中西医结合对甲状腺功能亢进症患者进行治疗能够明显改善甲状腺功能,且临床疗效良好,安全性高,不良反应发生率低,值得广泛推广。

1.5.4 研磨-超声裂解提取法 若使用甲酸-乙腈提取法效果仍然欠佳，可在甲酸处理后，加入适量微型玻璃珠研磨，并进行超声震荡，之后加入乙腈混匀离心后点靶，此方法称为研磨-超声裂解提取法。该方法所需菌量较多、耗时长、操作较其他方法繁琐，但对于丝状真菌、分枝杆菌等常规方法难以破壁的微生物，可大大提高蛋白质的提取效率[12]。

菌株的前处理过程需注意以下事项：(1)必须在样本干燥后30 min内添加基质；(2)蛋白质提取液、甲酸、基质的添加应注意不能溢出样本孔，更不能与其他孔样本融合，此类现象发生时应重新选择其他靶点进行鉴定或换用其他靶板；(3)连续滴加基质或70%甲酸于已覆盖样本的靶点时，枪头不可接触靶板，否则应更换枪头。

多孔壁面槽道湍流中的流动阻力和传热···············张一凡 刘财喜 董宇红 (3,378)

1.2 MALDI-TOF MS仪器的校准 MALDI-TOF MS的校准是准确鉴定的基础。仪器的反复操作、试剂的更换、电压或环境的变化均有可能造成系统偏差，因此每批检测前均需进行校准，以保证准确性。

2 上机中的质量控制

2.1 自动采集系统 自动采集适用于大批量临床标本的检测，可自动生成鉴定报告。采集前需要设定BTS靶点、质控菌株靶点和标本靶点的位置。仪器会自动进行校准和质控菌株靶点的检测。对于鉴定分值<1.7(红色)的靶点，仪器会自动进行重新采集。其缺点为：(1)鉴定分值<1.7(红色)靶点的重复采集耗时且浪费激光能量。因此，自动采集过程中，仪器未能成功鉴定的靶点应手动停止，并进行下一位点的采集，以节约时间和激光能量。(2)对于分布不均匀的靶点，自动采集系统无法自行调整至适宜位置或信号强度进行检测，故无效鉴定率高。

该项目利用Simulink仿真环境对锅炉汽包水位控制系统进行建模，然后分别利用工程整定法和均匀设计法对其进行了参数整定。结果表明，与传统的工程整定法相比，利用均匀设计方法得到的参数组合比工程整定法更加理想，超调量、调节时间和误差均有所降低，系统控制性能得到了明显的改善。

2.2 手动采集 手动采集节省时间、节约光源能量且可以强制采集，适用于不规则点靶或自动采集的补漏。其要点如下：(1)选择适当的激光强度，优势峰的激光强度最佳范围是1 000～10 000。若激光强度过高，信号较强的峰过饱和,会导致峰的m/z值发生偏移，影响鉴定结果；若激光强度过低，特征峰信号弱，信噪比降低，也会影响检测结果。(2)多位点采集并叠加：受靶板本身、涂抹方式及试剂表面张力影响，蛋白质共结晶体的分布并不均匀，因此，在峰采集过程中要选择多个位点以减小误差。对于特征峰信号较弱的微生物，峰的叠加可以增强特征峰的信号，提高S/N，有助于得到鉴定结果。

2.3 谱图质量判断 质谱图优劣判断的指标主要包括峰的数目、S/N、分辨率、基线光滑度、信号强度。良好质谱图的特征：(1)主次峰分明、峰分布错落有致，分辨率(m/Δm)达800～1 200，峰呈细长形；(2)基线平滑、S/N(主峰S/N大于2 000)；(3)主峰信号强度适当(1 000～10 000)；(4)峰数目较多。

3 比对结果判读

3.1 结果判读基本原则 Bruker公司的Microflex及 Autoflex鉴定结果采用3(lg1000)分制：2.300～3.000提示菌种鉴定结果高度可信；2.000～2.299提示鉴定至菌种水平；1.700～1.999提示鉴定至菌属水平；<1.7提示鉴定结果不可靠[13]。然而，在临床应用中，并非所有结果都必须遵循此标准。实验室可根据不同细菌特性和实验室自身情况制订个性化的可置信水平[14]。如，Bettina等[15]提出对于细菌而言，1.8的鉴定分值被认为可接受；Idelevich等[16]提出，对于酵母菌，鉴定分值≥1.5且排名前二位的结果相同，其鉴定结果可接受。

3.2 不典型比对结果的分析

3.2.1 鉴定分值>2.000的结果有多个时 (1)若为同一属，原因可能为：同一属菌株亲缘较近，质谱无法区分，可报告至属水平并采用其他方法进行鉴别[17]；菌株不纯，需分纯后重新鉴定。(2)若为不同属，原因可能为：共生状态，挑取不纯，分纯后再鉴定；若菌落为单菌落，则使用更高级的前处理法重新鉴定或选择其他鉴定手段；靶板未清洗干净，上次残留样本干扰鉴定，可清洗靶板或选择新的靶板重新鉴定。

3.2.2 所有鉴定分值均<2.000时 (1)若谱图质量好，且排名前5为同一菌属(如图3)，则可能是菌库中缺乏该种，可报告属水平，然后采用其他方法进行种水平鉴定。(2)若谱图质量好，但排名前5的结果是不同菌属(如图4)，原因可能是：菌株不纯，需分纯后重新鉴定；数据库中无相应菌种的谱图，需采用其他方法如16S rRNA基因测序进行鉴定。(3)若谱图质量差(如图5)，原因可能是：菌株前处理不当，采用其他前处理方法，若结果仍不可用，则采取其他方法鉴定；菌株培养时间过长或过短，重新接种或继续培养；样本量不足，重新鉴定或重新接种后鉴定；针对黏液型菌落，应挑取中心深部菌体，避免混入过多黏蛋白，或更换前处理方法。

 

注：某一鉴定结果分值小于2.000，但谱图质量好，且排名前5为同一菌属。

图3 不典型比对结果举例1

 

注：某一样本鉴定结果的分值均小于2.000，排名前5的结果为不同菌属，但谱图质量好。

图4 不典型比对结果举例2

4 结语

MALDI-TOF MS在微生物鉴定方面的应用价值已得到国内外认可。由于该平台相对较为开放，其操作的标准化及质量控制对于准确鉴定至关重要。本文介绍的MALDI-TOF MS微生物鉴定室内质量控制体系总结见图6，其实用性及操作性较强，具有一定推广价值。然而，由于临床分离株种类越来越多样，现有的商业化质谱数据库可能无法满足某些罕见微生物的鉴定，需通过自建库加以完善。因此，自建库的质量控制将成为下一步研究方向。

 

注：某一样本鉴定结果的分值均小于2.000，且谱图质量差，排名前5的结果为不同菌属。

图5 不典型比对结果举例3

 

注：*，由厂家完成。

图6 MALDI-TOF MS微生物鉴定的室内质量控制体系示意图

5 参考文献

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