耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumonia，CRKP)是一种可引起广泛感染的革兰阴性杆菌，由该菌感染造成的病死率高达50%[1]。细菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药可由多种机制共同作用[2]，而CRKP的主要机制是产碳青霉烯酶和高产ESBL或AmpC酶或者合并膜孔蛋白缺失。细菌的耐药机制因地域不同而有差异，为明确我院CRKP耐药机制，本研究采用PCR方法检测常见碳青霉烯酶耐药基因，并用多位点序列分型(multiple locus sequence typing，MLST)方法进行菌株的同源性分析。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集2015-2017年佳木斯大学附属第一医院临床分离非重复CRKP 31株，其中28株为痰液样本，3株为血液样本。采用Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪鉴定到种。纸片扩散法补充美罗培南、厄他培南的药敏结果，挑选出对亚胺培南、美罗培南、厄他培南任意一种抗菌药物非敏感的肺炎克雷伯菌作为实验菌株。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。

1.2 主要试剂及仪器 Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪及配套GN鉴定卡及GN13药敏板卡(法国生物梅里埃公司)；美罗培南、厄他培南(英国Oxoid公司)；PCR Master Mix(美国普洛麦格生物公司)；100 bp DNA marker(New England生物公司)；PCR扩增仪及电泳仪(美国Bio-Rad公司)；紫外凝胶成像仪(上海领成生物科技公司)。

1.3 药敏试验 采用Vitek 2 Compact全自动微生物分析仪及配套药敏板卡进行常规药敏实验；K-B纸片扩散法复核亚胺培南并补充美罗培南和厄他培南药敏结果。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922。药敏结果根据临床和实验室标准化协会(CLSI) 2017标准判断。

1.4 PCR扩增耐药基因 煮沸法提取细菌DNA。PCR方法扩增常见耐药基因，参照文献[3-9]合成碳青霉烯酶及其他β内酰胺酶相关基因，引物由上海生工生物公司合成，见表1。反应体系为25 μL，包括Go Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，退火温度(见表1)30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳并用紫外凝胶成像系统观察结果，阳性产物送哈尔滨博仕生物公司双向测序，测序结果经BLAST并确定基因型。

2.3 MLST分型结果 31株肺炎克雷伯菌分为4型，其中ST76 28株，ST323和ST896型各1株，另外发现1株新的ST分型并上传至上述网站，确定为ST2964型。

2.2 碳青霉烯酶基因检测结果 31株CRKP均有碳青霉烯相关基因检出，其中28株(90.3%)单独携带blaKPC-2基因，2株(6.5%)单独携带blaIMP-4，而同时携带blaKPC-2和blaNDM-5基因 1株(3.2%)。ESBL相关基因中26株(83.9%)同时携带检出blaCTX-M-15、blaSHV和blaTEM基因；1株单独携带blaSHV基因；2株同时携带blaSHV和blaCTX-M-15；1株同时携带blaSHV和blaTEM基因；1株blaCTX-M-9可疑阳性基因经BLAST比对为blaCTX-M-177型，该菌株同时携带blaSHV和blaTEM。共同携带KPC-2、SHV、TEM和CTX-M-15型基因25株(80.6%)；同时携带KPC-2、SHV和CTX-M-15型基因菌株2株。检出同时携带SHV、TEM、CTX-M-15和IMP-4，KPC-2、NDM-5、SHV、TEM和CTX-M-177，SHV、TEM和IMP-4，KPC-2和SHV型基因菌株各1株。见表2、图1。

2.1 药敏结果 所有菌株对头孢唑林、头孢他定、头孢曲松、头孢吡肟、氨曲南、厄他培南的耐药率达100%；多数菌株对哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、美罗培南高度耐药，耐药率均达到90%以上；对阿米卡星、左氧氟沙星的耐药率较低，小于10%。部分药敏结果见表2。

 

表1 相关耐药基因PCR引物

  

基因名称序列(5'→3')产物长度(bp)退火温度(℃)参考文献blaKPCF:TGTCACTGTATCGCCGTC101058[3]blaKPCR:CTCAGTGCTCTACAGAAAACCblaIMP-4F:ACCGCAGCAGAGTCTTTGCC58755[4]blaIMP-4R:ACAACCAGTTTTGCCTTACCblaIMP-8F:GTTTTATGTGTATGCTTCC67850[4]blaIMP8R:AGCCTGTTCCCATGTACblaVIM-1F:AGTGGTGAGTATCCGACAG26153[4]blaVIM-1R:ATGAAAGTGCGTGGAGACblaVIM-2F:ATGTTCAAACTTTTGAGTAAG80152[4]blaVIM-2R:CTACTCAACGACTGAGCGblaNDM-1F:TCGCCCCATATTTTTGCTACAG101254[5]blaNDM-1R:CGATCCTTCCAACTCGTCGCblaOXA23likeF:GATCGGATTGGAGAACCAGA50150[6]blaOXA23likeR:ATTTCTGACCGCATTTCCATblaOXA24likeF:GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA24652[6]blaOXA24likeR:AGTTGAGCGAAAAGGGGATTblaOXA51likeF:TAATGCTTTGATCGGCCTTG35350[6]blaOXA51likeR:TGGATTGCACTTCATCTTGGblaOXA58likeF:AAGTATTGGGGCTTGTGCTG59957[6]blaOXA58likeR:CCCCTCTGCGCTCTACATACblaOXA48likeF:TTGGTGGCATCGATTATCGG74452[6]blaOXA48likeR:GAGCACTTCTTTTGTGATGGCblaDHAMF:AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT40560[7]blaDHAMR:CCGTACGCATACTGGCTTTGCblaACCMF:AACAGCCTCAGCAGCCGGTTA34658[7]blaACCMR:TTCGCCGCAATCATCCCTAGCblaCTX-M-1F:GGTTTAAAAAATCACTGCGTC83348[8]blaCTX-M-1R:TTGGTGACGATTTTAGCCGCblaCTX-M-9F:ATGGTGACAAAGAGAGTGCA86350[8]blaCTX-M-9R:CCCTTCGGCGATGATTCTCblaSHVF:CTTTACTCGCCTTTATCGGC103155[9]blaSHVR:TTACCGACCGGCATCTTTCCblaTEMF:GTGCGCGGAACCCCTATT91955[9]blaTEMR:TTACCAATGCTTAATCAGT-GAGGC

2 结果

（4）破坏性经营风险。学校需在相关经营管理协议中明确国有资产保值增值责任，设定相应考核指标，控制经营管理方的破坏性经营风险。

1.5 MLST分型 对31株肺炎克雷伯菌进行MLST分型，根据网站http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/primers_used.html提供的引物及反应条件扩增rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB及tonB 7个管家基因，测序结果提交至http://bigsdb.pasteur.fr确定ST分型。PCR反应体系同1.4。

病人服药过程中会出现便秘、恶心、呕吐、失眠等不良反应。部分升白细胞药物会对脏器造成一定损害，如服用复方皂矾丸时，需注意监测肝功能变化[15]。部分病人担心药物不良反应对身体造成危害，不愿服药，还有部分病人无法耐受不良反应，服药依从性较低。病人2：“是药三分毒，即使是中成药(对身体)也有影响，所以能不吃就不吃。”病人7：“我一吃这个升白细胞药就想吐，晚上睡不着觉，你给我退了吧。”病人6：“我吃药时间久，复查血(常规)后，医生又把药量增加了，我觉得这个药效果不好，不想吃了”。

 

表2 CRKP的药敏结果、携带耐药基因及ST分型情况

  

菌株编号抗菌药物TZPAKLEVIMPMEM耐药基因型别STKP1RSSRIKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP2RSSRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP3RSSRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP4RSSRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP5RSSRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP6ISSRRKPC-2、SHV323KP7RSSRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP8RSRRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP9RSSRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP10RSSRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP11RSRRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP12RSSRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP13RSSRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP14RSSRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP15RSSRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP16RSSRRKPC-2、SHV、CTX-M-1576KP17RSSRRKPC-2、SHV、CTX-M-1576KP18RSSRRKPC-2、NDM-5、SHV、TEM、CTX-M-17776KP19RSSRISHV、TEM、IMP-4896KP20RSRRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP21RSSRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP22RSSRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP23RSSRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP24RSSRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP25RSSRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP26RSSRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP27RSSRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP28RSSRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP29RSSIRSHV、TEM、CTX-M-15、IMP-42964KP30ISSRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576KP31RSSRRKPC-2、SHV、TEM、CTX-M-1576

注：TZP，哌拉西林/他唑巴坦；AK，阿米卡星；LEV，左氧氟沙星；IMP，亚胺培南；MEM，美罗培南；R，耐药；S，敏感。

 

注：M，100 bp DNA ladder；1-2，blaIMP-4基因；3-5，blaKPC-2基因；6，blaNDM-5基因；7，blaCTX-M-15基因；8，blaCTX-M-15基因；9-10，blaSHV基因；11，blaTEM基因。

图1 部分CRKP阳性基因的PCR电泳

3 讨论

KPC阳性肺炎克雷伯菌的MLST分型在国外主要为ST258型，而中国大多为ST11。本研究中我院28株CRKP菌株为ST76，提示ST76型为我院的主要流行克隆型。ST258可能是由ST11和ST442通过重组产生[11]，而我院流行的ST76型是否由重组产生有待于进一步研究。ST76型肺炎克雷伯菌曾造成2014年上海某院新生儿科暴发流行[12]，而后2015年中国台湾有1例报道[13]。本文检出1株携带KPC-2和SHV型基因的ST323菌株和1株IMP-4、SHV和TEM型基因阳性的ST896型菌株，与报道的检出blaVIM-1的ST323肺炎克雷伯菌的产酶情况并不一致[14]，可能因为耐药基因存在的位置不同。另外，本文首次检出ST2964型肺炎克雷伯菌，其gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB对应的等位基因检索值为16、18、45、189、78、22和35。

本研究显示，blaKPC-2的检出率高达93.5%，KPC型基因阳性的CRKP中均联产ESBL，至少同时携带2种超广谱β内酰胺酶耐药基因，特别是TEM、SHV、CTX-M-15型基因，这与Netikul等[1]报道的一致。提示我院CRKP的主要耐药机制可能是KPC-2型酶联产CTX-M-15、SHV、TEM型酶。产生碳青霉烯酶的菌株往往导致头孢类、碳青霉烯类药物耐药。研究表明不是所有碳青霉烯酶基因阳性的菌株都对碳青霉烯类抗菌药物耐药[10]。本研究中2株IMP-4型基因阳性菌株，分别对亚胺培南和美罗培南中介，其机制有待于进一步研究。本研究检出1株同时携带KPC-2和NDM-5型基因的肺炎克雷伯菌，其耐药性是否通过可移动的元件，如质粒、转座子进行转移有待于深入研究。此外，VIM、IMP-8、OXA-23、OXA-24、OXA-48、OXA-51、OXA-58、DHA、ACC型基因均未检到。本研究选择直接检测CRKP菌株碳青霉烯酶耐药基因携带情况，而未与其表型筛选实验进行对比分析。如能将表型实验与PCR结果综合分析将减少假阳性结果的出现。

综上，我院CRKP菌株耐药性严重，联产KPC-2、TEM、SHV和CTX-M-15型酶为其主要耐药机制，并存在ST76型的克隆流行，是否存在外膜蛋白的缺失等其他耐药机制有待进一步研究。

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