副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是重要的食源性致病菌之一，也是我国南部沿海地区第一大急性腹泻致病菌[1]，具有高度遗传多样性[2]。VP大流行株最初是指1996年2月在印度加尔各答市引起群体暴发性食物中毒事件的新型O3:K6血清型菌株[3]，此菌株随后迅速在多个沿海国家及地区的人群中发生广泛传播[4]，并导致多起大规模暴发事件，成为VP致病的主要亚种。随着O3:K6大流行株的广泛传播，多种血清变异株在世界各地不断出现[4]，其和O3:K6大流行株在遗传组成上高度一致，属于同一克隆，即“大流行克隆”。大流行株的出现彻底打破其他克隆菌株散发及小规模局部流行的传播特点，具有跨洲际传播、跨人群感染的特征。现对大流行株自发生至今20余年演变过程中的感染及基因分型研究现状进行综述。

1 大流行株的感染及分布特征

近年来，大流行株引起的食物中毒事件以及人群暴露规模呈明显上升趋势。多个国家的VP感染中，由大流行株引起的超过50%[5]，甚至80%[6]。2007-2012年间，我国南部沿海地区多达56%的临床分离株具有大流行特点[1]。2009年7月至2013年6月，随机收集我国东南沿海地区6 951例急性腹泻患者的粪便标本，通过检测我们发现VP的感染率高达8.1%，其中大流行株占69.1%[7]。大流行株还具有血清型高度变异的特征，截至2016年，世界范围内已发现至少49种不同血清型临床大流行菌株，广泛分布在22个沿海国家和地区[8]。大流行株的血清型变异速度如此迅速且分布广泛，表明其具有超强的环境适应性。

值得一提的是，对中小型商业银行来说，资金实力不够雄厚，客户的信任度较低，受存贷款流失、存贷款利差减小的打击较大。且与大型商业银行相比中小型商业银行在提供服务、开发中间业务方面可能存在人才缺少、经验不足、系统开发能力弱、信息滞后等多项不足。中小型商业银行在利率市场化过程中盈利能力将会面临更严峻的挑战。

大流行株并非只在人群中传播与致病。近年来，环境大流行株(依附于海洋生物、海水和海洋沉积物等)持续增多。由于环境大流行株同样携带毒力基因，具有致病性，会对人类健康构成直接、近距离的威胁[9]。目前在位于东南亚、欧洲及中、南美洲的9个国家的环境标本中均检测到大流行株的分布，至少包括9种血清型[8]。我国东南沿海省份(江苏、上海、浙江和广东等)也均有环境大流行株的报道[10]。

值得关注的是，虽然一些研究提供的证据强烈提示环境与临床致病株之间存在着流行病学关联[11]，但是环境菌株致人类感染的具体传播动力学依然不明确。且从分子流行病学及遗传学角度上分析，临床与环境来源大流行株之间存在怎样的微进化关系,基因组结构或蛋白质组表达谱是否存在差异，所涉及的传播及致病机制是否一致，这些问题应该是科研工作者进一步深入挖掘的方向。

2 大流行株基因分型研究

1.4.4 统计分析 使用DPS(v7.05版)软件对数据进行处理，采用邓肯氏新复极差法对数据进行统计分析，评价不同试验处理对叶菜田杂草的防除效果。

2.1 传统分型研究 为构建完整的VP种群结构，2014年我们研究团队收集世界范围内不同来源的菌株，初步尝试利用多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)方法观察自然状态下VP的克隆分布及菌株聚类关系[12]。结果显示，VP是一个包含多达19个克隆群(clonal complex, CC)及大量关系较远的单体(singletons)的微生物种。大流行株在遗传组成上多属于CC3。但MLST将大量大流行株分成序列型3(ST3)，导致无法进一步区分不同来源ST3型菌株的分子差异，即便其表型特征不一致(如耐药、血清型等)[7, 10]。且不少研究中很多非大流行株也被分为ST3型[7]，这对大流行株的鉴定造成一定的干扰。此外，我国学者的一项研究中发现3株(菌株编号P202、P15和P43)具有大流行特征的菌株[13]，MLST分型结果却显示为3个与CC3完全无关的序列型(ST283、ST301和ST302)(见pubMLST数据库：https://pubmlst.org/vparahaemolyticus/)，如此混乱和矛盾的局面需要具有更高分辨力的分子分型技术解决。

脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis, PFGE)已运用于VP感染暴发调查中[14]，但其实验操作复杂、耗时长，实验数据只能用于比对相似性，不能用于解释菌株之间的克隆性。多位点可变数目串联重复序列分析(multiple locus variable-number tandem repeat analysis, MLVA)也被用于大流行株的微进化研究中[2]，但是该方法的重复性受位点本身的特点和检测方法使用的片段长度影响较大，实验室间结果可比性差，不容易实现标准化和网络化应用，应用受限。

2.2 全基因组测序(whole genome sequencing,WGS) 全基因组测序分析能够发现基因组中少至一个核苷酸的差异，分辨率无可比拟，是研究致病菌微进化关系及遗传多态性的最理想策略。继2003年世界上完成第一株VP大流行株RIMD2210633的全基因组序列的测定后[15]，大流行株的全基因组学研究逐步得到开展。近年来，利用全基因组学分析手段对大流行株暴发溯源[16]、血清变型转变机制[17]、实验室间大流行株遗传关系比对及与其他克隆株之间的遗传进化距离[18]等研究不断出现。我国学者于2015年1月对收集自世界范围内的157株VP(包括35株大流行株)进行全基因组序列比较分析，发现世界上存在由地理隔离造成的不同特征的VP海洋基因库[19]。同年3月，Loyola等[20]对比分析8株临床大流行株的全基因组序列，证明不同生态环境下大流行株存在较高的遗传变异度。这些研究大大加深对大流行株的遗传多样性及微进化关联的认知。

以上研究和结论充分说明在辨别关系较近的大流行株的遗传差异或溯源研究中，传统的分型方法提供的信息存在明显不足，甚至可能出现矛盾或误导性的结论。所以，迫切需要一种通用的、标准化的、分辨率高、重复性好、快速高通量的技术手段作为新的分型方法，弥补上述方法的缺点，充分挖掘不同背景下大流行克隆的微进化关系。

2017年初，Gonzalez-Escalona等[21]成功建立VP核心基因组多位点序列分型分析方案(core genome MLST scheme,cgMLST)，依托于标准化的pubMLST共享公共数据库(http://pubmlst.org/vparahaemolyticus)，实现不同实验室间VP全基因组序列的快速比对和聚类分析，为最终揭示不同来源菌株的起源、传播及进化关系提供新的研究路径。随着测序成本的大幅下降，该试验方案及数据库的使用势必成为继传统MLST分析方案后的一个重要的暴发调查工具，研究结果将有助于揭示大流行株的传播动力学及致病机制。

数字全息显微技术(Digital Holographic Microscopy, DHM)将数字全息技术和显微技术结合，可以观测尺寸在微米甚至纳米量级的微结构样本的三维信息.该技术具有全场、三维、无侵入的特点，非常适用于活体生物样品的动态显微观察，在生命科学和医学领域的应用日益增加.联邦理工学院通过DHM定量检测小鼠皮质神经元在应激过程中的动态过程[1-4].

3 耐多药大流行株的威胁

近年来，随着农业养殖及人类抗感染过程中的抗菌药物的广泛使用，耐多药VP菌株多见报道，尤其是对氨苄西林、青霉素和链霉素等药物的耐药株不断增加[22]。多种耐药基因[SHV, tet(B), strA, qnrA, gryA, qnrB, sulI, suⅢ]在VP菌体中被检测到[23]，且已有研究报道人群感染耐多药大流行株[24]。最新研究表明，我国杭州地区临床大流行株对常见抗菌药物表现为敏感，但耐药率已在上升[25]。这些证据提示，随着大流行株耐药性的增强，对人类健康造成的威胁也在不断增加。所以，无论在养殖业还是临床上，都需要合理选用抗菌药物，降低耐多药或多重耐药菌出现与传播的风险，利用诸如有益菌株或噬菌体疗法等手段代替抗菌药物治疗是有效控制抗菌药物滥用及耐多药菌出现的方法[22]。

4 结语

VP大流行株的出现、感染与传播已成为一个新的全球性的公共卫生问题，环境大流行株的出现是VP感染预防的新挑战。全基因组测序技术是重新认识大流行菌株的起源、播散及变异变迁历程的理想方法。大流行株耐药性的增加及耐多药菌的出现，给临床抗感染治疗带来困难，应引起研究人员的关注。

5 参考文献

[1]Li Y, Xie X, Shi X, et al. Vibrio parahaemolyticus, Southern coastal region of China, 2007-2012[J]. Emerg Infect Dis, 2014,20(4):685-688.DOI:10.3201/eid2004.130744.

[2]L Deke CHM, Gonzalez-Escalona N, Fischer M, et al. Examination of clinical and environmental Vibrio parahaemolyticus isolates by multi-locus sequence typing (MLST) and multiple-locus variable-number tandem-repeat analysis (MLVA)[J]. Front Microbiol, 2015,6.DOI:10.3389/fmicb.2015.00564.

[3]Okuda J, Ishibashi M, Hayakawa E, et al. Emergence of a unique O3:K6 clone of Vibrio parahaemolyticus in Calcutta, India, and isolation of strains from the same clonal group from Southeast Asian travelers arriving in Japan[J]. J Clin Microbiol, 1997, 35(12): 3150-3155.

[4]Nair G B, Ramamurthy T, Bhattacharya S K, et al. Global dissemination of Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 and its serovariants.[J]. Clin Microbiol Rev, 2007,20(1):39-48.DOI:10.1128/CMR.00025-06.

[5]Pazhani G P, Bhowmik S K, Ghosh S, et al. Trends in the epidemiology of pandemic and non-pandemic strains of Vibrio parahaemolyticus isolated from diarrheal patients in Kolkata, India[J]. Plos Neglect Trop D, 2014,8(5):e2815.DOI:10.1371/journal.pntd.0002815.

[6]de Jesús Hern Ndez-Díaz L, Leon-Sicairos N, Velazquez-Roman J, et al. A pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 clone causing most associated diarrhea cases in the Pacific Northwest coast of Mexico[J]. Front Microbiol, 2015,6:221.DOI:10.3389/fmicb.2015.00221.

[7]Chen Y, Chen X, Yu F, et al. Serology, virulence, antimicrobial susceptibility and molecular characteristics of clinical Vibrio parahaemolyticus strains circulating in southeastern China from 2009 to 2013[J]. Clin Microbiol Infec, 2016,22(3):258-259.DOI:10.1016/j.cmi.2015.11.003.

[8]Han C, Tang H, Ren C, et al. Sero-prevalence and genetic diversity of pandemic V. parahaemolyticus strains occurring at a global scale[J]. Front Microbiol, 2016,7:567.DOI:10.3389/fmicb.2016.00567.

[9]Li J, Xue F, Yang Z, et al. Vibrio parahaemolyticus strains of pandemic serotypes identified from clinical and environmental samples from Jiangsu, China[J]. Front Microbiol, 2016,7:787.DOI:10.3389/fmicb.2016.00787.

[10]Han D, Yu F, Tang H, et al. Spreading of pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 and its serovariants: a re-analysis of strains isolated from multiple studies[J]. Front Cell Infect Mi, 2017,7:188.DOI:10.3389/fcimb.2017.00188.

[11]Cabanillas-Beltran H, LLausas-Magana E, Romero R, et al. Outbreak of gastroenteritis caused by the pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 in Mexico[J]. FEMS Microbiol Lett, 2006,265(1):76-80.DOI:10.1111/j.1574-6968.2006.00475.x.

[12]Han D, Tang H, Lu J, et al. Population structure of clinical Vibrio parahaemolyticus from 17 coastal countries, determined through multilocus sequence analysis[J]. PLoS One, 2014,9(9):e107371.DOI:10.1371/journal.pone.0107371.

[13]Chen W, Xie Y, Xu J, et al. Molecular typing of Vibrio parahaemolyticus isolates from the middle-east coastline of China[J]. Int J Food Microbiol, 2012,153(3):402-412.DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2011.12.001.

[14]Wong HC, Lu KT, Pan TM, et al. Subspecies typing of Vibrio parahaemolyticus by pulsed-field gel electrophoresis[J]. J Clin Microbiol, 1996,34(6):1535-1539.

[15]Makino K, Oshima K, Kurokawa K, et al. Genome sequence of Vibrio parahaemolyticus: a pathogenic mechanism distinct from that of V cholerae[J]. Lancet, 2003,361(9359):743-749.DOI:10.1016/S0140-6736(03)12659-1.

[16]Haendiges J, Rock M, Myers RA, et al. Pandemic Vibrio parahaemolyticus, Maryland, USA, 2012[J]. Emerg Infect Dis, 2014,20(4):718-720.DOI:10.3201/eid2004.130818.

[17]Chen Y, Stine OC, Badger JH, et al. Comparative genomic analysis of Vibrio parahaemolyticus: serotype conversion and virulence[J]. BMC Genomics, 2011,12:294.DOI:10.1186/1471-2164-12-294.

[18]Guerrero A, Rraga-Partida ML, Mez GG, et al. Genetic analysis of Vibrio parahaemolyticus O3:K6 strains that have been isolated in Mexico since 1998[J]. Plos One, 2017, 12(1): e0169722. doi:10.1371/journal.pone.0169722.

[19]Cui Y, Yang X, Didelot X, et al. Epidemic clones, oceanic gene pools, and Eco-LD in the free living marine pathogen Vibrio parahaemolyticus[J]. Mol Biol Evol, 2015.DOI:10.1093/molbev/msv009.

[20]Loyola DE, Navarro C, Uribe P, et al. Genome diversification within a clonal population of pandemic Vibrio parahaemolyticus seems to depend on the life circumstances of each individual bacteria[J]. BMC Genomics, 2015,16:176.DOI:10.1186/s12864-015-1385-8.

[21]Gonzalez-Escalona N, Jolley KA, Reed E, et al. Defining a core genome multilocus sequence Typing Scheme for the Global Epidemiology of Vibrio parahaemolyticus[J]. J Clin Microbiol, 2017,55(6):1682-1697.DOI:10.1128/JCM.00227-17.

[22]Elmahdi S, DaSilva LV, Parveen S. Antibiotic resistance of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus in various countries: a review[J]. Food Microbiol, 2016,57:128-134.DOI:10.1016/j.fm.2016.02.008.

[23]Li H, Tang R, Lou Y, et al. A comprehensive epidemiological research for clinical Vibrio parahaemolyticus in Shanghai[J]. Front. Microbiol， 2017,8:1043. DOI:10.3389/fmicb.2017.01043.

[24]Jun JW, Shin TH, Kim JH, et al. Bacteriophage therapy of a Vibrio parahaemolyticus infection caused by a multiple-antibiotic-resistant O3:K6 pandemic Clinical strain[J]. J Infect Dis, 2014,210(1):72-78.DOI:10.1093/infdis/jiu059.

[25]谭焕腾, 陈晓, 蒋俊丽, 等. 2013-2015年杭州地区急性腹泻患者来源副溶血弧菌毒力基因及耐药性调查[J]. 中国微生态学杂志, 2017，29(2):151-154. DOI:10.13381/j.cnki.cjm.201702007.