化脓性肝脓肿(pyogenic liver abscess，PLA)相关高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent variants of K. pneumoniae，hvKP)[1]具有以下特征：造成社区获得性肝脓肿，易导致继发菌血症及全身播散性感染；微生物培养易形成黏液型菌落，具有特定高毒力的荚膜血清型，携带多种毒力基因[2]。目前浙江、北京、武汉、上海等地区的高毒力菌株的荚膜血清型、序列型(sequence type, ST)的分布有较多报道[3]，但是江苏地区报道较少。本研究对无锡市第二人民医院分离的肝脓肿相关肺炎克雷伯菌进行高毒力荚膜血清型及菌毛、荚膜多糖、铁载体等主要毒力基因检测，并通过多位点序列分型(multilocus sequence types, MLST)技术和脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)进行菌株同源性分析。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集无锡市第二人民医院2016年1月至2017年8月PLA患者[4]的脓肿穿刺分离肺炎克雷伯菌12株，另有同时由血培养检出肺炎克雷伯菌5株。用法国生物梅里埃公司Vitek 2 Compact细菌鉴定仪进行菌种鉴定；质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922购自卫生部临检中心，沙门菌H9812为本实验室保存。

1.2 主要试剂及仪器 5332型基因扩增仪(德国Eppendorf公司)；JY600E型电泳仪(北京君意东方公司)；GelDoc 2000凝胶成像仪、CHEF XP脉冲场凝胶电泳仪(美国Bio-Rad公司)；SeaKem Gold琼脂糖(美国Lonza公司)；Ultraclean DNA提取试剂盒(美国MOBIO公司)；Xba I限制性内切酶、蛋白酶K(大连宝生物公司)；MD101 DNA marker、Green Taq Mix PCR检测试剂、TBE缓冲液(南京诺唯赞生物公司)；引物合成由南京金斯瑞生物公司完成，具体信息见表1。

第二，学校要加强对体育课程的重视，严禁老师占用体育课上专业课的现象。许多学校之所以没有形成系统化的体育教学模式，就在于学校和学校的老师们自身没有认识到体育的重要性。因此，作为校方，我认为学校有义务的要加强自身的体育责任建设，将培养具有高度体育素质的人才真正的布置和实施下去，杜绝老师占用体育课为己用的现象，加大对体育基础设施的投入，为女生们创造一个良好的体育锻炼的环境，给体育课的发展指明一条道路。

 

表1 高毒力肺炎克雷伯菌荚膜血清型及主要毒力基因引物

  

基因名称引物序列(5'→3')扩增长度(bp)退火温度(℃)K1F:GGTGCTCTTTACATCATTGC128358R:GCAATGGCCATTTGCGTTAAK2F:GACCCGATATTCATACTTGA-CAGAG64158R:CCTGAAGTAAAATCGTAAAT-AGATGGGK5F:TGGTAGTGATGCTCGCGA28059R:CCTGAACCCACCCCAATCK20F:CGGTGCTACAGTGCATCATT77458R:GTTATACGATGCTCAGTCGCK54F:CATTAGCTCAGTGGTTGGCT88159R:GCTTGACAAACACCATAGCAGK57F:CTCAGGGCTAGAAGTGTCAT103663R:CACTAACCCAGAAAGTCGACwcaGF:GGTTGGGTCAGCAATCGTA16858R:ACTATTCCGCCAACTTTTGCrmpAF:AGAGTATTGGTTGATAGCCGGA12757R:GAAATGTCAAGCCACATCCATTGmagAF:GGTGCTCTTTACATCATTGC128359R:GCAATGGCCATTTGCGTTAGureAF:GCTGACTTAAGAGAACGTTATG33758R:GATCATGGCGCTACCTCAfimHF:GCTCTGGCCGATACCACCACGG42558R:GCGTAGTAACGTGCCTGGAACGGmrkDF:TATTGGCTTAATGGCGCTGG94558R:TAATCGTACGTCAGGTTAAAGACallSF:CCGAAACATTACGCACCTTT50858R:ATCACGAAGAGCCAGGTCACcf29aF:GACTCTGATTGCACTGGCTGTG82561R:GTTATAAGTTACTGCCACGTTCugeF:GATCATCCGGTCTCCCTGTA53463R:TCTTCACGCCTTCCTTCACTAerF:GCATAGGCGGATACGAACAT55663R:CACAGGGCAATTGCTTACCTiucBF:ATGTCTAAGGCAAACATCGT94858R:TTACAGACCGACCTCCGTGAiroNBF:GGCTACTGATACTTGACTATTC99259R:CAGGATACAATAGCCCATAGkfuBCF:GAAGTGACGCTGTTTCTGGC79759R:TTTCGTGTGGCCAGTGACTC

1.3 药敏试验 采用Vitek 2 Compact细菌鉴定仪及配套GN13卡(法国生物梅里埃公司)进行药敏试验，结果判读依据美国临床和实验室标准化协会(CLSI) 2017标准。

1.7 PFGE 参照文献[7]进行。简要流程：将过夜培养细菌包埋于56 ℃ 10 g/L的SeaKem Gold琼脂糖中，经20 mg/mL蛋白酶K消化；切取2 mm宽胶块经60 U Xba I限制性内切酶37 ℃酶切4 h；采用CHEF XP脉冲场电泳仪进行电泳，条件为14 ℃、6 V/cm、夹角120°，17.5 h后判读结果，分子标准菌株为沙门菌H9812。用BioNumerics软件处理电泳结果并绘制树状图。聚类分析选择非加权配对算术平均法(UPGMA)，条带位置差异容许度选择1%，带型间的相似度用Dice系数表示。相似性分析矩阵中相似性系数>80%的菌株判为相同PFGE型。

1.5 高毒力荚膜血清型及主要毒力基因检测 采用DNA提取试剂盒提取细菌DNA，按照说明书操作。采用PCR法检测肺炎克雷伯菌高毒力荚膜血清型及主要毒力基因[6]，包括荚膜血清型基因K1、K2、K5、K20、K54和K57；荚膜多糖相关毒力基因wcaG、rmpA、magA和ureA；定植及菌毛黏附相关毒力基因fimH、mrkD、allS和cf29a；脂多糖表达相关毒力基因uge；铁载体相关毒力基因Aer、iucB、iroNB和kfuBC。采用50 μL体系：2×Mix 25 μL，上、下游引物各2 μL，模板4 μL， ddH2O 17 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，退火(具体退火温度见表1)30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 5 min。扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳观察，并将阳性产物送南京金斯瑞生物公司进行测序，测序结果在GenBank数据库中通过BLAST比对以确定基因型。

2.3 高毒力荚膜血清型及主要毒力基因检测 12株脓液样本肺炎克雷伯菌共检出3种血清型，分别为K1(6株)、K54(1株)和K57(5株)，未检出K2、K5和K20型；5株血液样本肺炎克雷伯菌检出2种血清型，分别为K1(2株)和K57(3株)。同一PLA患者血液和脓液标本中肺炎克雷伯菌的血清型一致。毒力基因检测显示：wcaG、rmpA、ureA、fimH、mrkD、uge、Aer和iroNB在12株脓液标本来源菌株阳性率均为100%；iucB、magA、allS和kfuBC基因的检出率为分别为83.3%、50%、50%和50%；未检出cf29a基因。magA、allS和kfuBC仅在K1血清型标本中检出。同一PLA患者血液和脓液标本中肺炎克雷伯菌的毒力基因检测结果一致。

2.4 MLST和PFGE结果 12株肺炎克雷伯菌分为ST23 4株(33.3%)、ST25 3株(25%)、ST412 2株(16.7%)以及ST1660、ST1049和ST11各1株(8.3%)。PFGE图谱可分为8个型别，相似度为62%～100%。同一患者分离自血液及脓液标本菌株的荚膜血清型、ST型及PFGE图谱均一致，见图1。6株K1型肺炎克雷伯菌中有3株大于80%相似度，具有一定的同源性；K57型菌株之间未见同源性，见图1。

1.4 黏液丝试验 用接种环挑取过夜培养于哥伦比亚血琼脂平板上的菌落，重复拉伸2次，菌落被拉伸时形成长度>5 mm的黏液丝，定为黏液丝试验阳性[5]。

2 结果

2.2 黏液丝试验 12株脓液标本肺炎克雷伯菌黏液丝试验阳性9株(75%)，5株血液标本菌株黏液丝试验均阳性。

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2.1 药敏结果 12株肝脓肿相关肺炎克雷伯菌药敏结果显示，对哌拉西林/他唑巴坦耐药率为91.7%，对氨曲南、头孢唑啉、头孢曲松、头孢他啶、亚胺培南、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、复方磺胺甲噁唑等抗菌药物均敏感；同一患者肝脓液及血液中分离肺炎克雷伯菌药敏结果一致。

初中的英语语法词法方面首先是词类的介绍，然后是名词的分类、名词的数及其所有格；代词方面有人称代词、物主代词和指示代词；数词包括基数词和序数词；动词有be动词、简单的情态动词和助动词的用法。动词的时态只讲一般现在时、现在进行时和一般过去时，还有简单的介词和连词。句法方面介绍了按照句子用途所分的句子种类，即陈述句、疑问句、祈使句和感叹句。而以陈述句、一般疑问句、特殊疑问句和祈使句为主，讲的都是一些最最基础的语法知识。教材所配的话题都以贴近中学生生活、人们日常生活的题材为主，乐于为学生所接受。在七年级阶段我们可以学习一些简单的句子成分，比如主语、谓语、宾语、定语、状语。

1.6 MLST分析 依据肺炎克雷伯菌MLST官网(http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/Kpneumoniae.html)7个管家基因进行PCR扩增和测序，PCR反应体系见1.5，退火温度为50 ℃。将测序结果在MLST数据库中进行比对，确定每株菌株的ST。

3 讨论

本研究中肝脓肿相关肺炎克雷伯菌荚膜血清型主要为K1和K57，K1的检出率为50%，与文献报道一致[8]。6例K1型PLA患者中5例有糖尿病史，另外1例患者血糖轻微增高，提示血糖增高是hvKP感染的危险因素之一[6]。12株PLA脓液来源肺炎克雷伯菌黏液丝试验阳性率为75%，文献报道国内肝脓肿肺炎克雷伯菌黏液丝试验阳性率为70.6%[9]，结果间具有一致性，因此黏液丝试验作为高毒力菌株的筛选试验有待进一步评价。

12株脓液标本来源菌株均检出wcaG、rmpA、ureA、fimH、mrkD、uge、Aer和iroNB基因。wcaG和rmpA可正向调控荚膜多糖的合成，使菌落表现为黏液型[10]；fimH、mrkD(1型菌毛)与细菌的粘附相关；uge可促进脂多糖的表达；ureA与尿素代谢相关。铁载体相关的毒力基因Aer、iroNB、kfuBC和iucB的检出率分别为100%、100%、50%和83.3%，细菌铁载体可竞争机体组织血液中的铁。magA、allS、kfuBC与K1型高度相关，仅K1血清型标本出现阳性，magA基因位于K1荚膜多糖体生物合成区，与抗吞噬能力相关；allS与尿素囊获能相关，kfuBC介导铁的摄取[11]。

本文菌株中以ST23为主要分型(4株)，而其中3株为K1-ST23，与国内文献报道的较多检出型一致[9]。PFGE分型显示：K1-ST23、K1-ST1660和K1-ST25型肺炎克雷伯菌各1株的相似度大于80%；ST23与ST1660相似度为90%，7个等位基因中仅tonB亚型不同；ST23与ST25相似度为80%，存在phoE及tonB等位基因的不同。3株K1-ST23之间及2株K57-ST412之间的PFGE结果相似度较低，菌株之间相差较远。由此可见，MLST同源性分析的分辨力低于PFGE。同一患者血液及脓液标本分离菌株的ST型、荚膜血清型及PFGE结果完全一致，说明多部位hvKP菌感染分离的菌株存在同源性。

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注：*，肝脓肿患者血液标本检出菌株的PFGE结果。

图1 17株肺炎克雷伯菌脉冲场凝胶电泳聚类分析

4 参考文献

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[2]孙运芳, 沈定霞. 高毒力肺炎克雷伯菌的实验室检测标志[J]. 临床检验杂志, 2016, 34(9): 677-678.

[3]Zhang Y, Zhao C, Wang Q, et al. High prevalence of hypervirulent Klebsiella pneumoniae infection in China: geographic distribution, clinical characteristics, and antimicrobial resistance[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2016, 60(10): 6115-6120.

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[5]Kumabe A, Kenzaka T. String test of hypervirulent Klebsiella pneumonia[J]. QJM, 2014, 107(12): 1053.

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[8]Wu H, Li D, Zhou H, et al. Bacteremia and other body site infection caused by hypervirulent and classic Klebsiella pneumoniae[J]. Microb Pathog, 2017, 104: 254-262.

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