表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis，SE)是一种可引起机会性感染的常见革兰阳性球菌，可附着于中心静脉导管、导尿管、人工心瓣膜、人工关节和隐形眼镜等医疗器械表面而形成生物膜[1]。随着生物膜相关感染率和病死率不断升高[2]，体外构建良好的生物膜模型，研究其形成机制和治疗手段已成为热点。虽然细菌生物膜的构建方法种类繁多，但不同液体培养基对SE生物膜的形成能力的影响尚缺乏系统的对比研究。本研究通过体外构建SE生物膜模型，探讨胰蛋白胨大豆肉汤(tryptose soya broth，TSB)、LB肉汤和M-H肉汤3种培养基对生物膜形成和相关基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 表皮葡萄球菌生物膜成膜能力阳性标准菌株RP62A和生物膜成膜能力阴性标准菌株ATCC 12228由上海交通大学瞿涤教授惠赠。菌种保存于-80 ℃，接种于羊血琼脂平板后置37 ℃过夜培养，传2代后使用。

1.2 主要试剂及仪器 结晶紫染液(天津化学试剂一厂)；TSB、LB和M-H肉汤(北京索莱宝科技公司)；E.Z.N.A. Total RNA Kit II RNA提取试剂盒、TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR逆转录试剂盒和qPCR SuperMix UDG荧光染料(北京全式金生物公司)；多功能酶联仪(美国Bio-Tek公司)；96孔/6孔细胞培养板、15 mL/50 mL离心管(美国Corning/Costar公司)；可拍照光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.3 SE生物膜的构建及检测 96孔板法：挑取SE单个菌落于LB肉汤中，置于37 ℃恒温摇床200 r/min过夜培养，5 000×g 8 min，取沉淀，用无菌生理盐水重悬，再次离心，重复3次，取沉淀。用待测肉汤培养基配制细菌悬液至3.0 麦氏浊度单位，然后用肉汤按1∶100稀释，分别向96孔细胞培养板各孔中加入100 μL，置37 ℃静置温育24 h；弃菌液，用生理盐水轻洗3次后，每孔加入100 μL 0.5 mg/mL结晶紫溶液，室温静置15 min，用生理盐水轻洗至不褪色，吸干，每孔加入无水乙醇溶液100 μL，室温静置20 min，用酶联仪检测570 nm处的吸光度(A570 nm)即为生物膜的量[3]。每株菌株做3孔。玻片法：向6孔板中分别加入2 mL待测肉汤和40 μL 3.0麦氏浊度单位菌悬液，每孔再分别加入一片盖玻片，置37 ℃温育24 h，漂洗盖玻片，进行结晶紫染色后用显微镜观察生物膜总量[3]。重复3次。

1.4 RNA的提取及逆转录 SE分别用LB、M-H和TSB肉汤200 r/min 37 ℃培养16 h，采用E.Z.N.A. Total RNA Kit II试剂盒提取RNA。利用NanoDrop2000检测RNA纯度和浓度，采用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR试剂盒进行逆转录，所有操作均按照试剂盒说明书进行。

2.2 不同培养基中SE生物膜相关基因的表达 与LB培养基培养RP62A后icaA基因表达量(1±0.001)和icaR基因表达量(1±0.001)相比，M-H培养基可一定程度上促进RP62A icaA基因的表达(2.70±0.56)(t=5.122，P<0.05)而抑制icaR基因的表达(0.67±0.12)(t=3.231，P<0.05)；而TSB培养基可显著促进RP62A icaA基因的表达(56.48±9.94)(t=9.667，P<0.01)并抑制icaR基因的表达(0.003±0.001)(t=13.283, P<0.01)。见图2。

芪参益气滴丸用法：冻干重组脑利钠肽治疗三天后使用，每袋装0.5 g，餐后半小时服用，一次1袋，一日3次[2]。

 

表1 S.epidermidis粘附相关基因引物

  

基因名称引物序列(5'→3')产物大小(bp)icaAF:AACAAGTTGAAGGCATCTCC190R:GATGCTTGTTTGATTCCCTicaRF:CCATTGACGGACTTTACCAG220R:CAAAGCGATGTCGTAGGA16SrRNAF:TCGTGTCGTGATATGTTGGGT-TA260R:GGTTTCGCTGCCCTTTGTATT-GT

生物膜对不同的生长环境刺激较敏感，不同培养基的成分各异，对生物膜形成的影响亦不尽相同。本研究结果发现，TSB能显著促进SE生物膜的形成，促进粘附相关基因icaA的表达，同时显著抑制icaA的负调控基因icaR的表达。

2 结果

2.1 不同培养基SE生物膜的形成 TSB、LB和M-H 3种培养基均不能诱导ATCC 12228生物膜的形成。与LB(0.149±0.047)相比，M-H(0.323±0.003)能一定程度上促进RP62A生物膜的形成(t=6.399，P<0.01)；与LB和M-H相比，TSB(2.954±0.287)能显著促进RP62A生物膜的形成(TSB vs LB，t=16.706，P<0.01；TSB vs M-H，t=15.877，P<0.01)。96孔板结合结晶紫染色发现，TSB可明显促进RP62A生物膜的形成。见图1。通过盖玻片构建SE生物膜结合显微镜观察发现，TSB培养基中形成密集的生物膜，而M-H培养基中的生物膜较稀疏，LB培养基中几乎未见明显的生物膜形成，见图1。

 

注：A，96孔板结晶紫染色检测生物膜的形成；B，6孔板盖玻片结晶紫染色法检测SE生物膜形成。

图1 TSB、LB和MH培养基对SE生物膜形成的影响

1.5 实时荧光定量PCR 反应体系为20 μL：模板2 μL，上、下游引物各0.4 μL，SuperMix UDG 10 μL和无酶双蒸水7.2 μL。采用两步法进行qPCR扩增：50 ℃ 2 min；94 ℃ 10 min；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。相对表达量用2-△△Ct(其中Ct为循环阈值，△Ct=目的基因Ct值-内参基因Ct值，△△Ct=实验组目的基因△Ct值-对照组目的基因△Ct值)表示，并根据熔解曲线判断引物的特异性。所用引物均由上海生工公司合成，详见表1[4]。实验重复3次取均值。

 

注：*，与LB培养基比较，P<0.05。

图2 TSB、LB和M-H培养基对icaA和icaR基因的影响

3 讨论

1.6 统计学分析 采用Graphpad Prism 7.0软件进行数据分析。正态分布资料以±s表示，两独立样本之间的差异采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

计算形态、遗传和地理3个距离系数矩阵间的相关性发现，缺齿蓑藓的形态变异有一定的遗传背景(r = 0.159, n = 106, P < 0.2)，地理因素对形态分化(r = 0.309, n = 106, P < 0.01)和遗传分化(r = 0.251, n = 106, P < 0.01)均产生了极显著影响。

SE生物膜的形成涉及诸多精细的调控过程，培养基中的不同成分或环境中的外来小分子可直接影响其生物膜的形成或结构。LB培养基中蛋白胨和酵母膏粉主要用于提供氮源和氨基酸，葡萄糖主要用于提供碳源而氯化钠用于维持渗透压；M-H肉汤中牛肉粉和酸水解酪蛋白提供氮源、维生素和氨基酸，而可溶性淀粉可以吸收有毒的代谢产物；TSB中胰蛋白胨和大豆蛋白胨主要提供氮源和氨基酸，氯化钠用于维持培养基的渗透压。可见上述3种培养基的成分组成相差较大，不同培养基碳源和氮源的来源各异，其中TSB采用的蛋白质来源较充足，且有氯化钠维持培养基的渗透压，其促进生物膜形成的能力最强[5]。而其他2种肉汤对生物膜的影响不大，可能原因是M-H肉汤虽然有丰富的氮源，但缺少氯化钠；而LB肉汤中虽然含有10 g/L的蛋白胨，但其含量不如TSB充足，酵母膏粉中成分相对繁多，可能存在某些生长抑制因子抑制SE生物膜的形成。

基于Cigre-Benchmark标准直流系统，在其母线处设置经不同的过渡电阻、电抗单相接地短路，对换流器交流侧电压和直流侧电流进行频谱分析得到的低次谐波含量如表1所示。令过渡电阻为10 Ω，分别设置单相、两相、两相接地短路，在这些严重的故障状态下，交流侧电压和直流侧电流的低次谐波含量如表2所示。

生物膜主要由细菌菌体和胞外基质构成，胞外细胞间多糖粘附素(polysaccharide intercellular adhesion，PIA)是SE生物膜中重要的胞外基质成分。PIA主要由icaADBC基因簇编码，而icaR能对ica基因处进行负向调控，与icaADBC基因的表达成负相关[6]。本文发现与LB和M-H培养基相比，TSB可显著促进icaA基因的表达而抑制icaR基因的表达，这可能是TSB促进SE生物膜形成的主要原因。但人体内的生物膜多处于血浆环境，成分复杂，诸多研究发现血清中不同的物质对生物膜的形成具有促进或抑制作用。例如：抗体、补体和转铁蛋白等免疫物质可抑制SE生物膜的形成；而清蛋白、纤维蛋白原和纤维蛋白降解产物等可促进生物膜的形成[7-8]。而当病原体侵入人体后是否形成生物膜不仅取决于细菌自身的粘附能力，还取决于人体的免疫状态。因此，怎样在体外更真实模拟人体环境成为生物膜研究亟待解决的问题，而本研究的发现将为体外构建SE生物膜模型的研究奠定基础。

2.检验假说2的模型。假说2以货币增长率MP替换式(2)中的企业家信心指数，建立式(3)。根据假说2，预期投资过度时，回归系数α1显著为正值；投资不足时，回归系数α1显著为负值；无论是投资过度还是投资不足的分组中，国有企业样本的回归系数α1的绝对值大于非国有企业样本回归系数α1的绝对值。

4 参考文献

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[6]O′Gara JP. ica and beyond: biofilm mechanisms and regulation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus[J]. FEMS Microbiol Lett, 2007, 270(2): 179-188.

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