在中国，肺癌的发病率和病死率均较高，其中，病死率位居恶性肿瘤的首位。根据组织学特征和临床特点，肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，后者占肺癌的85%以上[1]。早期肺癌患者多无自觉症状，大多数患者确诊时已属于晚期，错失了最佳的手术治疗时机，故放疗和化疗是肺癌的主要治疗手段。术后放化疗能够有效减少肺癌的复发和转移，但部分患者常常在一线治疗后对化疗药物表现出较低的化疗敏感度，如何增强化疗药物的敏感度是化疗面临的重要难题。化疗是利用化学药物杀死肿瘤细胞，从而抑制肿瘤的生长，达到治疗肿瘤的目的。紫杉醇是从红豆杉科植物中提取的一种抗肿瘤二萜类化合物，是一种细胞周期特异性药物，在乳腺癌和肺癌等多种肿瘤的化疗中得到广泛应用，但患者常常出现抗药性和耐药性。如何实现紫杉醇在治疗过程中增敏、增效的作用是临床亟需解决的问题。微小RNA（miroRNA，miRNA）是一类具有组织特异性、高度保守性和时序性等特征的小分子非编码小RNA，在肿瘤基因表达的调控过程中具有重要的作用。miRNA-200家族是miRNA的重要组成部分，是近年来研究的热点。miRNA-200a作为miRNA-200家族中的重要一员，参与肝癌、乳腺癌和子宫内膜癌等多种肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡等过程[2-4]。有研究发现，miRNA-200a在非小细胞肺癌组织及细胞中低表达，上调其表达后能够抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等[5-7]。但目前未见关于miRNA-200a是否参与肺癌治疗过程中紫杉醇耐药机制的相关研究，本研究以体外实验的方式采用脂质体法干扰miRNA-200a在非小细胞肺癌细胞中的表达，观察其对非小细胞肺癌细胞紫杉醇化疗敏感性的影响，并探讨其可能的作用机制，为逆转肺癌化疗耐药性提供新的方向和理论依据，现报道如下。

一是加强对领导干部网络信息素养问题研究及水平评估。以习近平总书记关于网络强国战略思想为指导，政府相关部门、高等院校及科研机构应共同加强对领导干部网络信息素养问题专项研究，对网络强国战略下领导干部网络信息素养的本质、意义、特点、具体内容、关键要素、分类测评体系以及作用机制等开展多学科多角度深入系统的研究。探索构建领导干部网络信息素养现状评估与动态比较机制，对各级领导干部网络信息素养实际水平进行科学测评，并对测评结果予以公开比对，以摸清“家底”，掌握实际情况，进而提出相应对策。

1 材料与方法

1.1 材料

正常人肺上皮16HBE细胞株和人肺癌A549细胞株均购自美国ATCC公司，miRNA-200a模拟物（miRNA-200a mimics）、miRNA-200a阴性对照（mimics NC）和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）引物均购自上海吉玛公司，RNA逆转录试剂盒、荧光定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）试剂盒和荧光定量PCR仪均购自美国TaKaRa公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，RPMI-1640培养基、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、LipofectamineTM2000和电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）试剂均购自美国Invitrogen公司，紫杉醇（纯度99.5%）购自西安天丰生物科技有限公司，噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）检测分析试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchoninincacid，BCA）蛋白浓度检测试剂盒、放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液和Trizol试剂均购自上海碧云天生物技术有限公司，二甲基亚砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）均购自美国 Sigma公司，β-连环蛋白（β-catenin）抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体和辣根过氧化物酶标记的IgG-HRP二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，酶标仪和凝胶成像系统均购自美国Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养将复苏后的正常人肺上皮16HBE细胞和肺癌A549细胞接种于含10%胎牛血清、100 μg/ml链霉素和 100 U/ml青霉素的 RPMI-1640培养基上，置于5%CO2、95%湿度和37℃的恒温培养箱中进行培养，隔1天换液1次，待细胞几乎铺满整个培养瓶时，以0.25%胰蛋白酶进行消化传代。收集对数生长期的细胞进行后续实验。

1.2.2 qRT-PCR检测采用qRT-PCR法检测miRNA-200a的相对表达量。收集对数生长期的正常人肺上皮16HBE细胞和A549细胞，采用Trizol法提取两种细胞中的总RNA，采用紫外分光光度计检测所提取的总RNA浓度及纯度。采用RNA逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，根据miRNA-200a特异性引物、内参U6引物及相应的组分配成20 μl的反应体系（Master mix10 μl、上下游引物各0.8μl，DNA模板2μl，ddH2O 6.4 μl），以95℃ 5 min（1个循环）、95℃ 30 s（35个循环）、58℃ 30 s（35个循环）、72℃ 2 min（35个循环）和72℃6 min（1个循环）的反应条件进行PCR扩增。以U6为内参。应用2-△△Ct法计算miRNA-200a的相对表达量。实验重复3次。

1.2.3 细胞转染及分组取对数生长期的A549细胞，将其分为空白对照组、mimics NC组和miRNA-200a mimics组，按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书的实验步骤将miRNA-200a模拟物和转染试剂混合物转至miRNA-200a mimics组细胞中，miRNA-200a阴性对照和转染试剂混合物转至mimics NC组细胞中，空白对照组中只加入转染试剂。其中，miRNA-200a模拟物和miRNA-200a阴性对照的浓度均为25 μmol/L。转染48 h后，按照1.2.2中的步骤检测各组细胞的转染效果。

MTT法检测结果显示，随着紫杉醇浓度的增加，A549细胞受到的增殖抑制作用明显增强，且呈一定的浓度依赖性；与紫杉醇组相比，转染miRNA-200a mimics后，随着紫杉醇浓度的增加，A549细胞受到的增殖抑制作用增强（t=4.279、5.968、4.107、3.801、2.825，P＜ 0.05）。miRNA-200a+紫杉醇组的IC50为5.90 nmol/L，紫杉醇组的IC50为 9.57 nmol/L。（表1）

一系列的实践经验证明，大口井运用一定时间后，会有不同程度的淤塞，从而出水量会大大降低。众多水文地质学家已经通过大量的理论探讨和工作时间证明：大口径辐射井技术可以用于增加单井出水量。大口井辐射井是以传统的大口井为基础，在井下部的井筒中增加了多个集水管，并将其整个径向延伸到蓄水层中，使地下水流入集水管中并最终进入取水井中。

非小细胞肺癌A549细胞中miRNA-200a的相对表达量为（0.26±0.08），明显低于正常人肺上皮16HBE细胞的（1.02±0.03），差异有统计学意义（t=15.407，P＜0.01）。

1.2.5 蛋白质印迹法（Western blot）检测取对数生长期的A549细胞，制成细胞悬液后，以105/ml细胞接种至96孔板上，将其随机分为空白对照组、miRNA-200a mimics组、紫杉醇组和miRNA-200a+紫杉醇组。按照1.2.3中的实验方法转染miRNA-200a模拟物至miRNA-200a mimics组和miRNA-200a+紫杉醇组细胞，空白对照组和紫杉醇组细胞不进行处理，4组细胞继续培养48 h后，以8 nmol/L的紫杉醇处理紫杉醇组和miRNA-200a+紫杉醇组细胞，处理24 h后，收集各组细胞，以RIPA提取细胞总蛋白，BCA蛋白定量检测试剂盒检测其纯度及浓度。取变性后的50 μg样品蛋白，注入SDSPAGE凝胶中进行电泳分离，转至PVDF膜上后，置于5%的脱脂奶粉封闭液中处理1 h，加入稀释浓度为1∶1000的β-catenin抗体和GAPDH抗体，4℃下孵育过夜。次日，洗膜后加入稀释浓度为1∶2000的IgG-HRP二抗，于37℃下孵育2 h，以ECL显色。以GAPDH为内参，计算目的蛋白的相对表达量。

易非躺在飘着雪花的非易阁里，睁眼看着窗外，有雪花映照，并不算太黑，还能朦朦胧胧看得见从天而降的飞舞着的雪花。这飘忽而至的冬天的精灵啊，你是那么轻快、洒脱、自由，可惜我不能。

1.3 统计学方法

转染48 h后，空白对照组、mimics NC组、miRNA-200a mimics组细胞中miRNA-200a的相对表达量分别为（1.06±0.12）、（1.18±0.25）和（5.02±0.16），3组细胞中miRNA-200a的相对表达量比较，差异有统计学意义（F=445.487，P＜0.01）。mimics NC组细胞中miRNA-200a的相对表达量与空白对照组比较，差异无统计学意义（t=0.795，P＞0.05）；miRNA-200a mimics组细胞中miRNA-200a的相对表达量明显高于空白对照组，差异有统计学意义（t=26.239，P＜0.01）。miRNA-200a mimics组细胞中miRNA-200a的相对表达量明显高于mimics NC组，差异有统计学意义（t=22.408，P＜0.01）。

2 结果

2.1 miRNA-200 a在非小细胞肺癌 A549细胞中的相对表达量

1.2.4 MTT法检测收集对数生长期的A549细胞，调整细胞浓度为105/ml，以每孔1 ml接种至96孔细胞培养板上。将其随机分为紫杉醇组和miRNA-200a+紫杉醇组。其中，miRNA-200a+紫杉醇组细胞先以脂质体法转染miRNA-200a模拟物，紫杉醇组细胞不进行转染，转染6 h后，继续培养24 h。当细胞融合度达到80%左右时，两组细胞分别加入终浓度为2、4、8、16、32 nmol/L的紫杉醇溶液，处理反应24 h后，加入浓度为5 g/L的MTT溶液10 μl，避光孵育4 h后，弃培养液，加入DMSO溶解结晶物后，采用全自动酶标仪于490 nm处检测两组细胞的吸光度值，计算两组细胞相应浓度的细胞增殖抑制率，并计算出半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。其中，每个浓度重复3次。

2.2 转染后 A549细胞中miRNA-200 a的相对表达量

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2.3 miRNA-200 a对紫杉醇化疗药物敏感度的影响

为便于管理，牧草病害病情指数一般分级定为2级，其中发病率达30%，病情指数在10～30定为严重危害级别，用“++”表示；发病率在30%以下定为危害级别，用“+”表示。

表1 不同浓度紫杉醇溶液处理后 A549细胞增殖抑制率的比较（%，±s）

注：*与紫杉醇组比较，P＜0.05

组别紫杉醇组miRNA-200a+紫杉醇组紫杉醇浓度（nmol/L）2 18.2±1.4 25.7±2.6*48 23.1±3.0 37.3±2.8*43.8±5.2 58.7±3.5*16 62.4±3.8 75.8±4.9*32 71.2±5.1 84.7±6.2*

2.4 转染联合紫杉醇对Wnt/ β-catenin信号通路相关的 β-catenin蛋白的影响

空白对照组、紫杉醇组、miRNA-200a mimics组和miRNA-200a+紫杉醇组细胞中β-catenin蛋白的相对表达量分别（0.78±0.03）、（0.62±0.05）、（0.48±0.05）和（0.25±0.04），4组细胞中β-catenin蛋白的相对表达量比较，差异有统计学意义（F=73.12，P＜0.01）。与空白对照组相比，紫杉醇组、miRNA-200a mimics组和miRNA-200a+紫杉醇组细胞中β-catenin蛋白的相对表达量均明显降低（t=4.526、8.485、14.991，P＜0.01）；与紫杉醇组相比，miRNA-200a+紫杉醇组细胞中β-catenin蛋白的相对表达量明显降低，差异有统计学意义（t=10.465，P＜0.01）。（图1）

图1 转染联合紫杉醇处理后 A549细胞β -catenin蛋白的表达情况

注：A.Western blot检测结果；B.β-catenin蛋白相对表达量；1.空白对照组；2.紫杉醇组；3.miRNA-200a mimics组；4.miRNA-200a+紫杉醇组

3 讨论

miRNA-200家族通过抑制上皮-间质转化在肿瘤转移的过程中扮演着重要的角色。miRNA-200a是miRNA-200家族的重要成员，在多种肿瘤组织中表达水平较低，以抑癌基因的角色参与肿瘤细胞的增殖、凋亡等生理过程[8]。有研究表明，miRNA-200a还参与多种肿瘤化疗药物的耐药过程，如Liu等[9]研究发现，过表达miRNA-200a可能通过调控与耐药相关的ABC家族基因的表达，增加卵巢肿瘤细胞对紫杉醇的敏感度；沈阿灵等[10]研究发现，上调miRNA-200a表达可逆转大肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的耐药性。目前，关于miRNA-200a对非小细胞肺癌化疗药物敏感度的研究较少，本实验通过脂质体法上调肺癌A549细胞中miRNA-200a的表达后，加入紫杉醇药物进行处理，采用MTT法检测miRNA-200a对紫杉醇处理的A549细胞的增殖抑制情况的影响。结果发现，miRNA-200a+紫杉醇组细胞的IC50为5.90 nmol/L，紫杉醇组的IC50为9.57 nmol/L，表明上调miRNA-200a表达能够增强A549细胞对紫杉醇化疗药物的敏感度。

Wnt/β-catenin信号通路是经典的Wnt通路，是机体正常生长发育的重要途径。Wnt/β-catenin信号通路的异常表达与非小细胞肺癌细胞增殖、分化及凋亡等过程密切相关[11-13]。β-catenin作为Wnt/β-catenin信号通路调控的核心因子，是Wnt/βcatenin通路激活的重要标志。有研究表明，紫杉醇可调控多种肿瘤细胞中的Wnt/β-catenin信号通路，如Fu等[14]研究发现，卵巢癌对化疗药物紫杉醇的治疗可产生耐药性，这种耐药性与Wnt/β-catenin信号通路有关，在人卵巢癌细胞株A2780和SKOV3中，紫杉醇能够诱导β-catenin表达；涂雪松等[15]研究指出紫杉醇可能通过阻断Wnt/β-catenin信号通路抑制人鼻咽癌细胞株HONE1的增殖，并促进其凋亡。侯峰强等[16]研究发现，紫杉醇通过抑制胆管癌QBC939细胞内β-catenin蛋白的表达，阻断Wnt/β-catenin信号通路。Wnt/β-catenin信号通路中βcatenin蛋白的表达还受miRNA-200a的调控。Su等[17]指出，miRNA-200a通过与β-catenin相互作用，可阻断胃癌SGC790细胞和胶质瘤U251细胞中的Wnt/β-catenin信号通路。为了进一步探讨过表达miRNA-200a能够增强A549细胞对紫杉醇化疗药物敏感度的作用机制，本研究上调肺癌A549细胞中miRNA-200a的表达后，加入紫杉醇药物进行处理，并采用Western blot检测肺癌A549细胞中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin的表达，结果发现，与空白对照组相比，紫杉醇组、miRNA-200a mimics组和miRNA-200a+紫杉醇组细胞中βcatenin蛋白的相对表达量均有所降低，并且miRNA-200a+紫杉醇组细胞中β-catenin蛋白的相对表达量明显低于紫杉醇组（P＜0.01）。结果提示，上调miRNA-200a表达可通过阻断Wnt/β-catenin信号通路增强A549细胞对紫杉醇化疗药物的敏感度。

总之，本研究通过体外实验证实上调miRNA-200a表达能够增强A549细胞对紫杉醇化疗药物的敏感度，其作用机制与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关，也提示miRNA-200a可能是提高紫杉醇放疗敏感度的潜在靶点，为治疗非小细胞肺癌提供了新的线索。

参考文献

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