宫颈癌的发病率居中国女性生殖道肿瘤的首位，严重威胁着女性的健康[1]。据统计，全球新发宫颈癌病例约为50万/年，其中约7/8的新发病例发生于发展中国家[2]。目前，宫颈癌患者就诊时多数已处于晚期，因此寻找一种与宫颈癌早期诊断、预后判断和靶向治疗有关的生物标志物十分迫切。细胞程序性死亡蛋白4（programmed cell death 4，PDCD4）是近年来新发现的一种凋亡相关基因，在细胞程序性死亡过程起重要作用。相关研究表明，PDCD4可以抑制肿瘤的发生、发展，促进肿瘤细胞凋亡[3]。据报道，PDCD4表达水平的变化与肿瘤病理分级和预后密切相关[4]。目前，关于PDCD4对宫颈癌细胞的影响及其在宫颈癌中的作用机制的研究比较缺乏。因此，本实验通过过表达PDCD4，检测其对宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

宫颈癌HeLa细胞由郑州大学实验室保存；DMEM培养基购自美国HyClone公司；LipofectamineTM2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑制剂均购自北京康为世纪生物科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白含量检测试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司；PDCD4抗体、β-肌动蛋白（β-actin）抗体、β-连环蛋白（β-catenin）抗体、分泌型蛋白Dickkopf-1（DKK1）抗体、细胞周期蛋白D1（cyclin D1）抗体、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的抗兔二抗均购自美国Cell Signal Technology公司。

1.2 细胞培养

将冻存在液氮中的HeLa细胞取出，迅速置于37℃水浴锅中复苏，随后转移至15 ml玻璃离心管中，加入含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素的DMEM培养基，轻轻颠倒混匀，离心，弃上清，细胞计数，在37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养，当细胞汇合度达70%～80%时，0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶3传代培养。

1.3 细胞转染

取对数生长期的HeLa细胞，将培养基更换为不含抗生素的DMEM培养基，当细胞汇合度达70%～80%时，使用LipofectamineTM2000进行转染。以加入PGC-FU-GFP-PDCD4表达载体的细胞为过表达组，以加入PGC-FU-GFP表达载体的细胞为空载体组，以未做转染的细胞为空白对照组。将各组细胞接种于6孔板中，每孔加入5×105个细胞，加入5 μl LipofectamineTM2000和500 μl无血清培养基，振荡混匀，于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养48 h，蛋白质印迹法（Western blot）检测转染效果。

1.4 噻唑蓝法检测细胞增殖能力

将过表达组、空载体组和空白对照组HeLa细胞接种于96孔板中，每孔加入1×106个细胞，轻轻混匀，每组5个复孔，于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养48 h后，加入20 μl MTT溶液，37℃培养4 h，待有蓝色结晶紫产生，加150 μl二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），37℃、避光，摇床振荡10 min，使用酶标仪测定各孔490 nm波长处的吸光度值（OD值），计算细胞存活率。实验重复3次，取平均值。

MTT法检测结果显示：过表达组、空载体组和空白对照组细胞的存活率分别为（40.5±3.8）%、（96.5±6.2）%和（100.0±4.4）%，3组比较，差异有统计学意义（F=229.6，P＜0.01）。其中，空载体组细胞的存活率与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；过表达组细胞的存活率低于空白对照组和空载体组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡能力

采用不含EDTA的胰蛋白酶消化过表达组、空载体组和空白对照组HeLa细胞，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤 2次，收集（1～5）×105个细胞，加入 500 μl Binding Buffer、5 μl Annexin V-FITC，振荡混匀，室温下避光培养5 min，采用流式细胞仪测定各组细胞的凋亡情况，实验重复3次，取均值。

1.6 Western blot检测细胞中 β-catenin、DKK 1、cyclin D 1蛋白的表达

采用SPSS 22.0统-计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用F检验，多组间两两比较采用q检验，两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

1.7 统计学分析

取过表达组、空载体组和空白对照组HeLa细胞，加入 300 μl RIPA、3 μl蛋白酶抑制药，充分摇匀，置于冰上反应30 min，收集蛋白转入干净的EP管中，根据BCA蛋白浓度检测试剂盒说明书检测蛋白浓度；使用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离胶和5%SDSPAGE浓缩胶电泳，每孔大约加入30 μg的蛋白质，沸水浴5 min，电泳；取下凝胶，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVDF）膜上；置于含5%脱脂奶粉的TBST液封闭1 h，加入一抗（分别加入β-actin一抗，1∶1000；PDCD4一抗，1∶1000；β-catenin一抗，1∶400；DKK1一抗 1∶400；cyclin D1一抗1∶1000），置于37℃、摇床中孵育1 h，4℃过夜培养；TBST洗膜3次，每次5 min；加入HRP标记的抗兔二抗（1∶5000），室温培养1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；暗室中，滴加ECL发光液，采用凝胶成像仪扫描，目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示蛋白表达水平，实验重复3次。

2 结果

2.1 细胞转染效果

结果表明，超声提取与加热回流提取的效果相当，但超声操作简单便利，因此选择超声提取。超声时间选择了20、40、60 min进行考察，提取时间对提取效果无较大影响，且希望保证每批药材提取完全，因此超声时间确定为40min。通过比较不同提取溶剂的图谱，70%甲醇测定的图谱中峰的高度强度展现的较为均一，更适合对各批次的药材进行共有峰的指认，因此提取溶剂定为70%甲醇。

图1 Western blot检测转染后 3组细胞中PDCD 4蛋白的表达

2.2 PDCD 4过表达对细胞增殖能力的影响

压力平衡体现为对钻井液液柱压力的双向约束，泥浆密度有一定的窗口，当泥浆密度低于孔隙压力时会导致井涌井喷(密度下限)；高于破裂压力时会导致井漏(密度上限)。

Western blot检测结果显示：转染后，过表达组、空载体组和空白对照组细胞中PDCD4蛋白的相对表达量分别为（1.53±0.12）、（0.41±0.07）和（0.39±0.04），3组比较，差异有统计学意义（F=287.0，P＜0.01）。其中，空载体组细胞中PDCD4蛋白的相对表达量与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；过表达组细胞中PDCD4蛋白的相对表达量高于空白对照组和空载体组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（图1）

2.3 PDCD 4过表达对细胞凋亡能力的影响

Western blot检测结果显示：过表达组、空载体组和空白对照组细胞中β-catenin、DKK1、cyclin D1蛋白的表达水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。其中，空载体组细胞中β-catenin、DKK1、cyclin D1蛋白的表达水平与空白对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；过表达组细胞中βcatenin、DKK1、cyclin D1蛋白的表达水平均低于空白对照组和空载体组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（图3、表1）

图2 不同组别HeLa细胞的凋亡情况

2.4 PDCD 4过表达对HeLa细胞中 β-catenin、DKK 1、cyclin D 1蛋白表达水平的影响

流式细胞仪检测结果显示：过表达组、空载体组和空白对照组细胞的凋亡率分别为（48.6±4.3）%、（12.4±1.4）%、（10.5±1.2）%，3组比较，差异有统计学意义（F=316.6，P＜0.01）。其中，空载体组细胞的凋亡率与空白对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；过表达组细胞的凋亡率高于空白对照组和空载体组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（图2）

近年来，随着各大高校不断扩大招生，毕业生数量日益增多，加之经济危机的影响，这对本来就非常严峻的就业形势来说，无疑是雪上加霜。很多大学生为了将来能够走上适合自己职业发展规划的岗位，往往会选择在大学期间进行技能培训。主要分为这几大类：

图3 Western blot检测 3组细胞中 β-catenin、DKK 1、cyclin D 1的表达

表1 3组细胞中β -catenin、DKK 1、cyclin D 1表达量的比较（±s）

注：*与过表达组比较，P＜0.05

组别空白对照组空载体组过表达组F值P值β-catenin 0.78±0.09*0.77±0.11*0.34±0.06 38.69＜0.01 DKK1 0.84±0.10*0.85±0.10*0.31±0.08 52.20＜0.01 cyclin D1 0.66±0.07*0.69±0.08*0.30±0.08 41.26＜0.01

3 讨论

PDCD4基因位于10q24，其编码蛋白约含有469个氨基酸，可以影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移等过程，抑制肿瘤的恶化[5]。PDCD4表达水平的升高或降低均对肿瘤细胞的生长、凋亡等过程产生较大影响。Matsuhashi等[6]研究表明，PDCD4可以通过调控转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）诱导原发性肝癌细胞凋亡。在卵巢癌中，异常表达的PDCD4可以通过调节p21和p27基因的表达，使卵巢癌细胞停滞在G1期或上调细胞周期，进而达到抑制肿瘤细胞增殖的目的[7]。PDCD4在鼻咽癌组织中的表达水平低于正常黏膜组织，稳定地过表达PDCD4可以削弱肿瘤细胞的存活力，抑制肿瘤细胞增殖，从而使体内成瘤速度明显减慢[8]。在血液恶性肿瘤中，PDCD4 mRNA和蛋白的表达水平降低，表明PDCD4参与阻滞血液恶性肿瘤患者骨髓单个核细胞凋亡过程，促进血液恶性肿瘤的发生、发展[9]。毛玲等[10]研究发现，苦参碱体外作用于人肾母细胞瘤细胞可以提高PDCD4的表达水平及增加肿瘤细胞的敏感度和凋亡率。PDCD4在宫颈癌细胞的细胞核和细胞质中均有表达[11]，但关于PDCD4对宫颈癌细胞增殖和凋亡的调控以及作用机制的报道较少。本研究通过对宫颈癌HeLa细胞转染PGCFU-GFP-PDCD4和PGC-FU-GFP表达载体发现，过表达组细胞中PDCD4蛋白的相对表达量高于空转染组和空白对照组（P＜0.05），细胞的存活率低于空白对照组和空载体组（P＜0.05），细胞的凋亡率高于空白对照组和空载体组（P＜0.05），表明PGCFU-GFP-PDCD4载体可以促进HeLa细胞中PDCD4的表达，而过表达的PDCD4可以抑制HeLa细胞的增殖，促进HeLa细胞的凋亡，其可能原因为PDCD4阻碍了肿瘤细胞的有丝分裂过程，但PDCD4的具体作用机制尚未完全清楚。

Nusse等[12]报道中将小鼠乳腺瘤原癌基因int1和果蝇无翅基因wingless合称为Wnt。Wnt信号通路调控胚胎发育和机体正常生理过程，同时诱导多种肿瘤的发生、发展[13]。Wnt/β-catenin信号通路是Wnt信号通路的经典途径，该通路在细胞的生长、迁移过程中发挥重要作用，主要是提高βcatenin的表达水平并向细胞核内转移，其作用原理为Wnt蛋白通过与细胞表面因子结合形成三聚体，并活化细胞质内蓬乱蛋白，抑制β-catenin磷酸化降解，提高细胞质中β-catenin的含量，细胞质的通透性增强，β-catenin进入细胞核与T细胞转录因子/淋巴样增强因子相互作用，从而激活Wnt/β-catenin信号通路，进而促进下游靶基因的表达，调控肿瘤的发生、发展、细胞生理过程及耐药性等[14-15]。DKK1、cyclin D1是Wnt/β-catenin信号通路的下游靶基因[16]。DKK1可以诱导产生具有内吞功能的三元复合物，阻断Wnt/β-catenin信号转导途径，诱导多种肿瘤细胞凋亡[17]。cyclin D1能特异性调控细胞从G1期向S期转换，cyclin D1低表达可以抑制肿瘤的发生、发展[18]。本实验通过Western blot检测转染后HeLa细胞中β-catenin、DKK1、cyclin D1蛋白的表达水平发现，与空白对照组和空转染组相比，过表达组细胞中β-catenin、DKK1、cyclin D1蛋白的相对表达量均降低，表明PDCD4可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化和细胞周期G1/S期的转换，从而抑制肿瘤细胞的增殖。

综上所述，PDCD4通过阻断Wnt/β-catenin信号通路激活下游靶基因的表达，从而抑制宫颈癌细胞增殖，促进宫颈癌细胞凋亡。PDCD4可以作为一种抑癌基因，调控肿瘤的发生、发展，为宫颈癌的诊断、治疗提供理论依据。

中国特色社会主义理论体系的内涵是随着改革与发展的推进而不断深化和丰富的。十八大报告指出“中国特色社会主义理论体系，就是包括邓小平理论、‘三个代表’重要思想、科学发展观在内的科学理论体系，是对马克思列宁主义、毛泽东思想的坚持和发展。”［1］

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