流行性脑脊髓膜炎（简称流脑）是由脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis，Nm）引起的急性呼吸道传染病，是危害人类呼吸道的传染病之一。流脑的主要传染源是带菌者[1]。Nm的携带率与流脑的流行有重要的关系，带菌率调查主要采用细菌培养法检测[2]。增强对流脑病原菌的监测，建立高效的Nm检测方法对流脑的临床诊断有重要的意义[3]。流脑的常规诊断方法是从脑脊液和血液中分离出病原菌，但患者使用抗菌药物治疗后，病原菌的阳性率会显著下降，因此亟需一个敏感、高效的方法来解决传统细菌培养法的缺陷[4]。为此，本研究探讨了实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测Nm的临床价值。

宇航员在宇宙空间中穿的衣服和在地面上差不多，比如T恤和短裤。他们不像在地面时那样经常换衣服——毕竟，在空间站里没有洗衣机。

1 材料和方法

1.1 一般资料

收集2010年1月—2016年12月宁海县第一医院70例疑似流脑病例的双份脑脊液标本，1份采用细菌培养法进行检测，将标本置于消毒试管内，接种于巧克力平板上；另1份采用实时荧光定量PCR进行检测，需将标本保存在生理盐水中，置-20 ℃环境中。细菌培养法所用的仪器与试剂均购自法国生物梅里埃公司，lightcycler 480荧光定量PCR仪（瑞士罗士公司）；K30破裂仪（宁波立诚公司），3111型CO2培养箱（美国Thermo公司），Nm荧光定量PCR检测试剂盒（上海之江生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细菌培养法 将脑脊液标本接种于巧克力平板上，于5%～10%CO2环境中37 ℃培养24～72 h，选取Nm可疑菌落进行鉴定、分型和药物敏感性试验。

4. 前金州録事参军，因谴庐陵，系扵法理，□恋不及，颒血兴哀，上奉□仁，用摅冈极。(《杜娩墓志》)[4]

流脑是一种严重影响患者健康的冬、春季急性传染病，主要表现为发热、呕吐以及头痛等临床症状。有研究表明，由Nm引起的脑膜炎时常伴随着较高的死亡率，因此受到临床的重点关注[5]。流脑患者通常伴随发热以及头痛等临床症状，对患者的确诊通常需要从患者的脑脊液和血液中分离出Nm。Nm是引起流脑的病原体，其主要寄居在患者上呼吸道内，是一种革兰阴性双球菌，对干燥、寒冷以及阳光环境都十分敏感。相关研究表明，Nm置于室温中3 h就会死亡[6]。

1.3 统计学方法

实时荧光定量PCR检测Nm的特异性为100%，无假阴性结果，阳性预测值为73.13%，阴性预测值为0.00%。见表2。

2 结果

2.1 实时荧光定量PCR与细菌培养法检测Nm结果的比较

采用细菌培养法检出Nm阳性49例，阳性率为70.00%；实时荧光定量PCR检出Nm阳性67例，阳性率为95.71%，其中有49例细菌培养法与实时荧光定量PCR均为阳性，有18例细菌培养法为阴性而实时荧光定量PCR为阳性。实时荧光定量PCR检测Nm的阳性率明显高于细菌培养法（χ2=16.293 1，P=0.000 1）。见表1。

 

表1 实时荧光定量PCR与传统细菌培养法检测Nm的结果

  

阳性率（%）传统细菌培养法 70 49 21 70.00实时荧光定量PCR 70 67 3 95.71方法 例数 阳性数（例）阴性数（例）

2.2 实时荧光定量PCR检测Nm的特异性、阳性预测值和阴性预测值

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

 

表2 实时荧光定量PCR和细菌培养法的检测结果[例（%）]

  

实时荧光定量PCR细菌培养法阳性 阴性 合计阳性 49（70.00） 18（25.74） 67阴性 0（0.00） 3（4.29） 3合计 49 21 70

2.3 实时荧光定量PCR的敏感性及线性范围

采用实时荧光定量PCR检测10倍系列梯度稀释的标本，分析其敏感性。结果表明实时荧光定量PCR最低可以检测到的Nm DNA浓度为103 拷贝/mL。见图1。

从抽样调查统计数据可以看出，城阳区乡村旅游者的停留率非常低，绝大部分旅游者当天往返，占71%；停留三天以上的旅游者仅占7%。由此，可以看出城阳区乡村旅游缺乏使游客留下来的吸引力，本文认为要更多的开发一些度假休闲旅游项目。

按照实验要求对选取的模板进行10倍系列有效稀释，并选取7个浓度（2×107～2×103拷贝/mL），同时采用实时荧光定量PCR检测。结果表明在2×103～2×107 拷贝/mL范围内，与相应的Ct值有较好的相关性（r值分别为0.999 9、0.999 6、0.999 5、0.999 7）。因此，实时荧光定量PCR检测Nm DNA的线性范围为2×103～2×107 拷贝/mL。

  

图1 Nm实时荧光定量PCR曲线

3 讨论

1.2.2 实时荧光定量PCR 对脑脊液标本提取DNA，同时吸取180 μL标本，置于1.5 mL离心管中，震荡混匀，11 544×g离心2 min，去除上清。将100 μL DNA加入沉淀液中，充分混匀，再置沸水浴10 min。最后再对其11 544×g离心5 min，取上清4 μL进行检测。根据引物进行反应混合液的配制以及循环参数的设置，同时设置阳性和阴性对照。结果根据lightcycler 480荧光定量PCR仪和试剂盒说明书进行评价。

传统的细菌培养法检测时间较长，Nm易在标本运输过程中死亡，当患者接受抗菌药物治疗以及受其他非特异性因素的影响时，会引起细菌分离的失败，降低细菌培养法的准确性[7]。有研究表明，细菌培养法分离鉴定Nm的敏感性不高，因此采用敏感性更高的检测方法变得十分重要且意义重大[8-9]。近年来，敏感性和特异性较高的实时荧光定量PCR已被广泛应用临床检测。该法的主要特点是：（1）采用了荧光标记的特异性探针，增强了PCR扩增的特异性[10]；（2）采用Ct值定量结果，能够有效地定量PCR扩增指数增长期起始的拷贝数，避免平台效应对结果的影响，增强方法的敏感性[11]；（3）使用全封闭反应，不需要电泳等PCR后期处理，能有效避免PCR产物造成的假阳性污染；（4）检测过程中进行在线式实时监测，测量结果直观有效，自动化程度较高[12]。实时荧光定量PCR检测Nm的敏感性和特异性高，经济成本低，为Nm的检测提供了重要的技术手段，为正常人群Nm带菌率的调查提供了新的方法，也为暴发流行时快速、低成本的诊断提供了相应的技术支持[13]。PCR技术能通过对流脑患者的脑脊液或血液标本进行扩增，以扩增出特异性DNA片段来诊断Nm感染[14]。实时荧光定量PCR应用了较高的光谱技术，同时应用了高敏感性的仪器检测荧光，因而荧光定量PCR检测技术的敏感性、特异性与细菌培养法相比都有较大的提升[15]。由此可见，荧光定量PCR检测技术的自动化程度及准确度均较高，还能有效地解决污染问题，检测时间短，在检测某些临床已使用抗菌药物或保存不当的标本、监控流脑的早期情况及疾病流行的实验室快速诊断方面均有十分广阔的应用前景[7]。

综上所述，目前医学影像学在临床上有很大的应用价值，但还有广阔的技术发展及改进空间。这就需要相关人员共同努力，促进医学影像学技术迈入新的台阶。

本研究结果显示，实时荧光定量PCR检测Nm的阳性率（95.71%）显著高于细菌培养法（70.00%），二者的阳性符合率为70.00%，2种方法完全符合49例，另有18例细菌培养法为阴性而实时荧光定量PCR为阳性。这一现象说明实时荧光定量PCR的敏感性比传统的细菌培养法更高。同时，本研究结果还表明，实时荧光定量PCR的特异性达100%，无假阴性结果。

综上所述，实时荧光定量PCR检测Nm的敏感性高、特异性强，且快速、简便，为流脑流行病学调查提供了一种快速、简便的病原学诊断手段。

参考文献

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