天然骨组织主要由羟基磷灰石（约65%）和Ⅰ 型胶原纤维（约34%）复合构成［1］，临床上修复骨缺损的常用手段包括自体/异体骨移植和人工骨替代材料填充等，而随着组织工程概念的提出，包含生长因子、种子细胞及支架材料三类要素的组织工程骨在骨缺损的修复中具有良好的前景。生长因子具有调控缺损区域细胞增殖的作用，对于通过骨组织工程修复骨缺损具有重要意义。骨形成蛋白⁃2（bone morphogenetic protein⁃2，BMP⁃2）属于转化生长因子⁃β（transforming growth factor⁃β，TGF⁃β）超家族成员，由于其显著的促间充质干细胞迁移和成骨分化的效果，被普遍认为是骨修复中最有前景的诱导因子，广泛应用于骨缺损修复［2］。然而，局部过量使用BMP⁃2会导致异位性钙化，引起疼痛、肿胀及神经功能缺损等，故单一使用难以取得理想的修复效果［3⁃4］。碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）作为一种有效的促有丝分裂及促血管再生因子，可显著促进多种类型细胞的增殖及迁移，如血管内皮细胞及成骨细胞［5］。对于骨组织修复再生来说，新血管的生成具有重要的意义［6］，新生血管可以为干细胞、免疫细胞的迁移提供通道，并为新生组织提供必要的氧和营养。由于BMP⁃2主要促进成骨细胞的成熟与矿化，bFGF则有促进细胞分裂及血管化作用，在骨修复过程中二者侧重不同，具有潜在的互补作用，近年来已有很多关于在骨修复中联合应用BMP⁃2与bFGF的研究报道，但目前尚未有关于以上两种生长因子联合应用时的合适剂量、比例及控释时间研究相关报道。本文就近年来在骨组织工程中联合应用BMP⁃2与bFGF的相关研究进展进行综述。

1 BMP⁃2与bFGF对成骨作用机制

BMPs信号通路与FGFs信号通路之间的相互作用机制相对较为复杂。一般认为BMP⁃2通过BMP/Smad通路促进成骨分化。BMP⁃2通过先后结合并活化其Ⅱ型受体和I型受体，进而激活下游两条信号转导通路：经典Smad通路［7］和非经典MAPK 通路［8］。

bFGF激活成骨细胞的通路则主要包括磷酸蛋白激酶（protein kinase C，PKC）通路［8］，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路［9］等。联合应用BMP⁃2与bFGF时，二者下游信号通路相互影响，对于成骨分化既有促进作用，又可有抑制作用，二者潜在相互作用机制如图1所示。

晨雾渐渐散去。冬天有雾的早晨，通常不如平日寒冷。晨雾开始散去，并不是缘于太阳的驱逐，是风。起风了，白纱一般的雾，牛乳一般流淌。刘雁衡从窗口望去，门前的四五棵树像一排梳齿，梳理着如练的雾。

  

图1 BMP⁃2与bFGF所介导的成骨信号通路以及二者之间潜在的相互作用方式Figure 1 Signaling pathways and interactions of BMP⁃2/bF⁃GF in osteogenic differentia⁃tion

 

BMP⁃2：骨形成蛋白⁃2；bFGF：碱性成纤维细胞生长因子。

1.1 促进作用

bFGF可以促进成骨细胞中BMP⁃2的表达并明显提高骨形成蛋白受体⁃1β的表达，从而上调BMP信号通路［10⁃11］。bFGF 表达缺陷对 BMP⁃2 介导的Smad1/5/8的磷酸化未有明显影响，但会明显减少pSmad1/5/8与Runx2的核定位，并降低Runx2的表达，而bFGF预处理可一定程度逆转Runx2表达的降低，说明bFGF在BMP/Smad/Runx2信号通路中具有重要的作用［12］。除BMP/Smad通路外，敲除成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）基因小鼠BMP⁃2介导的p42/44 MAPK通路下调［13］，表明FGFs也可通过调节BMP⁃2介导的p42/44 MAPK通路进而影响成骨细胞的分化。Jiang等［14］通过BMP⁃2通路拮抗剂Noggin抑制BMP⁃2通路，证明了BMP通路的下调可阻碍FGF通路所介导的成骨细胞晚期的分化，降低碱性磷酸酶、骨钙素等的表达。

BMP⁃2与bFGF的比例也可能对骨修复效果产生影响。Wang等［27］在研究BMP⁃2与bFGF联合应用于骨修复的最佳比例时，得出当BMP⁃2与bFGF剂量比为2∶1时对于促进骨髓间充质干细胞成骨分化效果最佳的结论。但该研究仅在BMP⁃2的剂量固定为100 ng/mL的前提下改变bFGF的剂量，没有研究其他剂量下BMP⁃2与bFGF比例不同对成骨分化的影响。Bai等［17］的研究结果则表明在BMP⁃2与bFGF的剂量比为5∶1时对骨髓间充质干细胞的成骨分化促进效果最佳。各研究所选择的BMP⁃2剂量不同，导致相应比例的bFGF剂量也有所不同，故不同的骨修复效果是由于两种生长因子比例的不同还是由于bFGF剂量的改变所导致仍有待探讨。

外源性生长因子半衰期短，局部使用后在短时间内即被稀释和代谢，故需反复大剂量使用，成本昂贵且在临床操作上带来不便。使用药物载体加载生长因子不仅可以长期控释药物，而且通过选择不同性质载体，可实现不同药物在不同时期的顺序性释放，在一定程度上可模拟复杂的天然创伤修复过程中生长因子的时序性表达，从而达到更好的修复效果。

教学核心问题的提炼，体现了教师对教学内容的认识、对学生情况的把握、对数学教学价值的追求。教师在提炼核心问题的过程中，必然要对教学内容本质、知识间的联系、学生的经验积累、学生能力提升等方面作深入的思考。因此，问题引领教学一定程度上可以改变教师的思维方式，提升教师的教学能力。

按照2.1.1标准曲线,采用苯酚-硫酸法测定干燥香水莲花多糖的含量,平行测定4次,香水莲花多糖的平均含量为(12.01±0.23)%(mean±SD)。

1.2 抑制作用

尽管BMP⁃2及bFGF均能促进Runx2的表达，但Runx2的高度表达可能不利于成骨细胞的进一步成熟。过表达Runx2的转基因小鼠表现出骨骼发育的异常，如成熟的成骨细胞以及骨细胞数目的减少［18］。成牙本质细胞可矿化的性质与成骨细胞类似，早期使用bFGF处理可促进成牙本质前体细胞分化为成牙本质细胞，并促进其增殖分裂以及功能蛋白的表达；但后期bFGF的处理则会抑制成牙本质细胞的进一步成熟与矿化［19］，但目前尚未有对于成骨细胞的类似研究报道。

Qi等［20］发现转导成纤维细胞生长因子受体⁃3（fibroblast growth factor receptor 3，FGFR3）基因的软骨细胞中，FGFR3的高表达可加快骨形成蛋白受体⁃IA的降解，下调BMP通路，从而抑制软骨细胞分化，提示bFGF可通过FGF/FGFR3这一途径对BMP通路起抑制作用。

BMP⁃2与bFGF在被应用于骨缺损修复时均有一定的合适浓度范围。应用载有100 ng的bFGF或400 ng的BMP⁃2脱细胞真皮基质膜修复大鼠颅顶骨缺损可得到相似的修复效果［22］。而联合应用BMP⁃2与bFGF时，二者的剂量、比例均可对于新骨再生具有一定影响，甚至可能导致相反的作用。增加BMP⁃2剂量可促进钙盐矿化沉积，但会干扰bFGF促细胞增殖作用，同时也有导致异位成骨等副作用的风险［3-4］；而不同bFGF的剂量对于新骨再生的影响差异较大，甚至可能起相反的作用［23-24］。目前临床上应用BMP⁃2或bFGF于骨缺损修复的研究仍较少［10］，多为组织工程细胞学研究或动物实验。

2 BMP⁃2与bFGF剂量选择

而Nakamura等［21］的研究结果表明在应用bFGF剂量＞100 ng/mL时，Smad通路抑制因子Smad6的表达会显著升高，这也是BMP⁃2促矿化作用效果受抑制的原因之一。

2.1 剂量影响

目前研究对于在骨组织工程中联合应用BMP⁃2与bFGF时对二者剂量的选择并没有一个统一的最适范围。低剂量的bFGF（＜50 ng/mL）联合BMP⁃2应用于骨组织工程时二者表现为协同作用，相对于应用单一生长因子具有更好的促进骨再生效果，并且可以避免单独应用高剂量BMP⁃2潜在的副作用；而高剂量的bFGF（＞100 ng/mL）联合BMP⁃2应用时，其骨修复效果与单独应用BMP⁃2未有明显差异甚至起抑制作用。

2.2 比例影响

(3)在椭圆所在平面另一侧,再放置一个同样的小球且与平面相切，切点记作F2，则MF2与下方小球相切.当点M在椭圆上运动时，MF1,MF2分别与上下两个小球相切吗？能否用数量关系表示椭圆上的点的运动规律？

在培养小鼠成骨细胞时，联合应用100 ng/mL的BMP⁃2与2 ng/mL的bFGF可显著提高碱性磷酸酶表达水平［23］。相比于单一使用大剂量生长因子（BMP⁃2 100 ng/mL 或 bFGF 10 ng/mL），联合应用小剂量的生长因子（BMP⁃2 10 ng/mL和bFGF 1 ng/mL）更能促进成骨细胞的成骨分化［25］。而在培养环境中加入300 ng/mL的BMP⁃2与2.5 ng/mL的bFGF时，小鼠间充质干细胞的碱性磷酸酶表达量则低于单独应用BMP⁃2组［26］。总体看来，在较低剂量范围（＜50 ng/mL）应用bFGF与BMP⁃2联合修复骨缺损时，二者具有协同作用。

3 药物控释系统

血运重建同样是骨缺损修复中一个重要过程，联合应用BMP⁃2与bFGF可促进人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移及小管形成，提高基质金属蛋白酶⁃2的活性［15］，bFGF还可以促进细胞分泌血管内皮生长因子从而加快缺损区域血管化过程［11］，促进间充质干细胞增殖、分泌生长因子及成血管分化［16］。体内研究结果同样证明联合应用BMP⁃2与bFGF可促进植骨区域的血管形成［17］。

3.1 同时释药

BMP⁃2与bFGF在骨修复过程中存在一定协同作用，目前已有许多将BMP⁃2与bFGF同时应用于骨修复的报道。Wang等［28］将加载有BMP⁃2 和bFGF的磷酸钙水泥用于犬种植体周围骨缺损修复，相对于加载单一生长因子的磷酸钙水泥，联合应用BMP⁃2与bFGF具有更好的骨修复效果。但由于BMP⁃2及bFGF的半衰期均较短，且使用大剂量BMP⁃2有导致异位成骨及软组织肿胀的潜在风险［29］，故在临床上应用BMP⁃2或bFGF于骨缺损修复的研究仍较少［10］，而尚未见联合应用BMP⁃2与bFGF的临床研究报导。

为克服传统蛋白药物治疗这一缺点，Atluri等［30］制备了转染 BMP⁃2/bFGF 基因序列的质粒复合聚乙烯亚胺纳米粒子，共同转导进入人脂肪源干细胞中，体外检测结果表明共转导BMP⁃2与bF⁃GF基因的细胞表达更高水平的BMP⁃2、bFGF、及成骨分化标记如骨钙素Runx2。在兔糖尿病桡骨缺损模型中应用搭载该纳米粒子的胶原支架修复缺损部位，术后4周组织切片显示实验组有大量新骨形成，骨连接程度达64%，而对照组骨连接情况较差，新生骨量相对较少［31］。转染后骨髓间充质干细胞成骨分化检测及大鼠皮下异位成骨结果表明基因转染技术治疗可克服传统递药系统中生长因子释放快，降解快的缺点，有望成为骨修复一种有效治疗手段［32-35］。

3.2 顺序释药

天然骨修复过程中，生长因子的表达释放具有一定时序性，bFGF表达在早期纤维血管化时期被激活，随后在骨形成矿化时期BMP⁃2的表达被激活［36］。根据这一特点，Wang等［24］将不同的交联度的凝胶微球分别与BMP⁃2和bFGF复合注射到大鼠股骨踝处，但在体内实验中发现在应用双因子顺序缓释材料后新生骨量反而下降，作者推测可能是由于bFGF使用剂量过高所致。在此之后，许多研究均通过不同的载药手段实现早期bFGF的快速释放及BMP⁃2的持续缓慢释放，相比于使用单一生长因子得到了更好的修复效果［37-38］。

但以上几种载药系统仅能模拟天然骨修复中bFGF的早期大量表达，而无法模拟BMP⁃2在后期的增量释放，故可能并未达到最佳的骨修复效果。Lei等［39］通过电喷法制备了含BMP⁃2 与bFGF的“壳⁃核”结构微球，体外实验表明在外壳包裹bFGF、内核包裹BMP⁃2可以实现bFGF早期快速释放，BMP⁃2晚期增量释放，更好的模拟了天然骨修复的过程，相对于单一/混合包裹两种生长因具有显著的促间充质干细胞成骨分化作用。

4 小结

综上所述，在骨组织工程中应用剂量恰当的bFGF联合BMP⁃2可协同促进新骨的形成，相对于使用单一生长因子具有更好的修复效果，然而联合应用时BMP⁃2与bFGF的适宜剂量范围还有待进一步明确，有关BMP⁃2与bFGF之间相互协同和拮抗的机制，及药物控释系统如何更好地模拟自然骨修复过程中生长因子释放模式仍有待研究。与传统递药方法相比，基因治疗有望成为临床上一种骨缺损的有效手段。

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