牙周膜细胞（periodontal ligament cells，PDLCs）是牙周膜的主体细胞，具有自我更新和多向分化的能力［1］，其数量和活性是牙周组织再生的关键。众所周知牙周炎发展过程中细菌介导的免疫应答是牙周组织破坏迅速和再生修复困难的主要原因，而单核/巨噬细胞在机体促炎和抗炎的免疫平衡中起了控制开关的作用［2］，其与牙周组织吸收破坏的关系早已引起人们的重视［3］，但与牙周组织再生的关系鲜有报道。本文用脂多糖激活巨噬细胞，收集含巨噬细胞细胞因子的上清液模拟体内炎性微环境，检测其对PDLCs增殖和成骨分化的影响，从免疫方面为牙周病的治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要实验试剂和仪器

巨噬细胞RAW264.7（ATCC，美国）；α⁃MEM、DMEM、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、胰蛋白酶（Gibco，美国）；噻唑盐［3⁃（4，5⁃Dimethylthiazol⁃2⁃yl）⁃2，5⁃diphenyltetrazolium bromide，MTT］（Sigma，美国）；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（Ther⁃mo Fisher Scientific，美国）；SYBR Premix Ex Taq TM试剂盒（Takara，日本）；蛋白定量试剂盒（Thermo Sci⁃entific，美国）；碱性磷酸酶活性试剂盒（Abcam，美国）；E.coli脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（Sigma，美国）；倒置相差显微镜及照相系统（Olympus，日本）；CO2细胞培养孵箱（Sanyo，日本）；实时荧光定量PCR仪（QuantStudio 7 Flex，美国）。

1.2 细胞培养基和矿化诱导剂

DMEM培养巨噬细胞，α⁃MEM培养PDLCs。所用培养基均加入100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素和 10%FBS。PDLCs矿化诱导剂为 1.8 mM β⁃甘油磷酸钠、50 μg/mL维生素C、10 nM地塞米松。

1.3 收集脂多糖条件培养基（LPS conditioned me⁃dium，LPS⁃CM）

将小鼠来源巨噬细胞RAW264.7按照2×105个/mL接种于T175培养瓶，待细胞贴壁后用1 μg/mL的LPS刺激4 h，弃去瓶内培养基和未贴壁的细胞，PBS清洗两遍，换用15 mL无FBS的DMEM培养基孵育12 h后收取瓶内培养基，在离心机中以5 000 rpm离心10 min后收取上清液即为本实验所用LPS⁃CM，分装于-80℃冰箱备用。

本文通过对中交汇通横琴广场项目的BIM应用进行了基本功能分析，从而验证了基于模型的建造的可行性，切实达到了成本节约、管理提升、技术提升、数据积累、品牌提升等效果，也拓展了今后BIM技术在工程施工中的应用道路。

1.4 检测巨噬细胞细胞因子mRNA表达

收集LPS⁃CM后，取部分贴壁的巨噬细胞用Trizol细胞裂解液消化，氯仿分离，异丙醇沉淀，75%乙醇清洗提取RNA，测定RNA浓度，分别逆转录为cDNA，采用SYBR Green试剂盒进行Real⁃time PCR检测巨噬细胞细胞因子mRNA的相对表达量，目的基因白细胞介素6（interleukin⁃6，IL⁃6）、白细胞介素 1β（interleukin⁃1β，IL⁃1β）、白细胞介素 10（interleukin 10，IL⁃10）、肿瘤坏死因子α（tumor ne⁃crosisfactor⁃α，TNF⁃α）、转化生长因子β1（transform⁃ing growth factor⁃β1，TGF⁃β1）、精氨酸酶1（arginase⁃1，Arg⁃1）等及管家基因β⁃actin在不同的反应管中进行扩增，反应体系均为20 μL。反应条件：95℃变性20 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40个循环。根据标准曲线由软件自动计算得出Ct值后计算每种细胞因子mRNA相对表达量。验证该方法的重复性和扩增效率，本实验重复3次。

患者的临床表现为咳嗽、咳痰、声嘶,少数有胸痛表现。孕妇维系胎儿的养育及健康,如果患上支气管炎,不但影响自己的饮食睡眠,还危及胎儿健康。因咳嗽时腹压急剧上升,而剧烈的咳嗽可能会造成胎儿早产。

ALP活性检测结果如图4所示，LPS⁃CM组ALP活性高于Ctrl组，分别是3 d时1.58倍（t＝5.91，P＝0.03）；7 d时为 1.29倍（t＝6.01，P＝0.046），2个时段比较差异有统计学意义。

1.5 分离培养PDLCs

教师先提供众多数学信息，让学生借助日常生活经验去阅读整理，同时进行多层次、多维度的思考，发现并提炼出有价值的数学问题。在众多的信息中，对这些数学问题进行重组，这个过程的实质就是渗透初步的数学建模思想，从而训练学生抽象、概括的学习能力，有效培养学生的观察力。

1.6 MTT法检测PDLCs的增殖

收集PDLCs接种于96孔平底板，调整细胞密度至1 × 104个/孔，LPS⁃CM组为α⁃MEM与LPS⁃CM按1∶1调配的培养基（提示炎性微环境），Ctrl组为常规培养基，37℃、5%CO2孵育。检测时每孔加入10 μL MTT溶液（0.5 g/L），继续培养4 h后吸去孔内培养基，每孔加入100 μL二甲基亚砜（DMSO），每组设5个复孔，置摇床上低速振荡10 min，酶联免疫测定仪检测波长490 nm的光密度（optical densi⁃ty，OD）值。连续检测6 d。

1.7 矿化诱导PDLCs及检测成骨分化指标

将PDLCs以1×105个/mL接种于6孔板，按上述分LPS⁃CM组和Ctrl组，加入矿化诱导剂。诱导培养3 d、7 d后取细胞按ALP assay试剂盒的使用说明检测ALP活性；取3 d、7 d细胞提取RNA，Real⁃time PCR 检测 Runt相关基因 2（runt⁃related transcription factor 2，RUNX2）、骨钙素（osteocalcin，OCN）、Ⅰ型胶原（collagenI，COL⁃I）mRNA 的表达量，操作流程同上。

炎性微环境是一个涉及多种炎性因子（如TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6、IL⁃10）、生长因子、胞外基质、转录活化因子及多种细胞（如单核/巨噬细胞、成纤维细胞）共同作用的复杂的液体环境。单核/巨噬细胞作为免疫系统的重要成员调节体内的炎性微环境，Mosser等［4］按功能将活化的巨噬细胞分为两类，一是M1型巨噬细胞，分泌大量的炎性因子，在致炎和促炎过程中引发组织的继发性损伤，对炎症过程的扩大与恶化起了极其重要的作用，主要有TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6等；二是M2型巨噬细胞，分泌的细胞因子抑制炎症，可以产生胶原，促进创伤愈合和组织修复，主要有IL⁃10、TGF⁃β1、Arg⁃1 等。

商务英语是一种交流较为灵活的英语应用方式，商务英语更多应用在对外贸易、经济交流方面，所以掌握口语英语能力是必须的，商务英语和普通英语最本质的区别在于商务英语是一种社会化语言形式。商务英语在农产交易中的应用具有以下几个特点：

1.8 统计学分析

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，计量数据以x±s表示，两组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

总而言之，每一个公民都有享受教育的权利，尤其是青少年。解决农村留守儿童的教育缺失问题已经刻不容缓，需要政府、学校、家庭和社会的多方努力，应加大对义务教育阶段农村留守儿童的法律保护力度，推进城乡义务教育均衡化发展，增强家长的责任意识，发展农村寄宿制学校等适合农村学生需求的教育模式，保障农村留守儿童与城市儿童享有平等的教育服务，使义务教育阶段农村留守儿童学业有人教、亲情有人护、安全有人保。

收集临床上13～18岁身体健康的正畸志愿者，原代分离培养牙周膜细胞，传至第三代为本实验所用。

取3 d、7 d细胞，Western Blot检测蛋白表达水平，用RIPA裂解细胞后提取细胞总蛋白，用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，每个样本取50 μg蛋白，经SDS⁃PAGE电泳后，将凝胶中的蛋白转至PVDF膜上后在blockingbuffer中封闭1 h。然后分别滴加 RUNX2、OCN、Col⁃I、GAPDH 一抗（稀释比均为1∶1 000），4℃孵育过夜，TBST 洗膜，滴加1∶3 000稀释的辣根过氧化酶标记的二抗，37℃孵育2 h；再用TBST洗膜后，用ECL系统进行化学发光显色；最后用Image J软件对各条带的灰度值进行分析，并统计各蛋白的相对表达量。诱导培养14 d后用4%多聚甲醛固定细胞20 min，PBS清洗后，用2%茜素红染色15 min，倒置显微镜下拍照观察钙化结节量，后加入氯化十六烷基于室温下30 min后吸取上清液，酶联免疫测定仪检测波长562 nm的OD值，检测2组钙化量差异。

2 结果

2.1 巨噬细胞形态观察

Western Blot检测结果与相应的mRNA表达趋势基本一致，除了OCN 3 d组时（t=2.75，P＝0.056）外，其余显示相应的RUNX2、OCN、COL⁃I的蛋白表达量LPS⁃CM组低于Ctrl组（P ＜0.05），差异有统计学意义（图6）。成骨诱导14 d茜素红染色及钙盐半定量检测对比Ctrl组与LPS⁃CM组比较，钙化 结 节 LPS⁃CM 组 少 于 Ctrl组（t＝8.63，P＝0.048），差异有统计学意义（图7）。

2.2 LPS刺激后巨噬细胞相关细胞因子mRNA的表达

图2所示Real⁃time PCR结果显示经LPS刺激4 h后巨噬细胞表达大量的促炎性因子，如TNF⁃α、IL⁃1β、IL⁃6，而免疫调节和促组织修复的细胞因子如IL⁃10、TGF⁃β1、Arg⁃1表达量少。

2.3 PDLCs增殖的检测

连续检测6 d发现2组细胞随时间增加OD值逐渐增大，总体趋势LPS⁃CM组低于Ctrl组，前2 d差异无统计学意义（P＞0.05），3 d时Ctrl组0.428±0.024高于 LPS⁃CM 组 0.354 ± 0.031（t＝4.88，P＝0.015），差异有统计学意义，之后 3 d（4 d、5 d、6 d）的数据统计结果P值分别为0.012、0.015、0.002（图3），差异均有统计学意义。

  

图1 巨噬细胞形态 倒置相差显微镜 ×100Figure 1 Morphology of macro⁃phage under inverted phase mi⁃croscope ×100

 

a和b：巨噬细胞呈圆形（a），LPS刺激后体积增大，胞浆丰满（b）。

  

图2 巨噬细胞相关细胞因子mRNA表达Figure 2 Gene expression of macrophage⁃related cytokines

2.4 PDLCs成骨分化检测

IL⁃1β引物序列：上游5′⁃TGGAGAGTGTGGATC CCAAG⁃3′；下游 5′⁃GGTGCTGATGTACCAGTTGG ⁃3′。IL⁃6 引物序列：上游 5′⁃ACGCGGAAGGTCC⁃GATATGGT ⁃3′；下游 5′⁃TGCCTGACTTTCGCATTA GC⁃3′。TNF⁃α 引物序列：上游 5′⁃ATGAGCACTG AAAGCATGATCCGG ⁃3′；下游 5′⁃GCAATGATCCCA AAGTAGACCTGC⁃3′。Arg⁃1 引物序列：上游 5′⁃GGAATCTGCATGGGCAACCTGTGT⁃3′；下 游 5′⁃AGGGTCTACGTCTCGAAGCCA⁃3′。IL⁃10 引物序列：上游5′⁃CAACATACTGCTAACCGACTC⁃3′；下游5′⁃AATGCTCCTTGATTTCTGG⁃3′。TGF⁃β1 引物序列：上游 5′⁃GTGTGGAGCAACATGTGGAACTCTA⁃3′；下游 5′⁃CGCTGAATCGAAAGCCCTGTA⁃3′。β⁃actin 引物序列：上游 5′⁃AGGATTCCTATGTGGGC⁃GAC⁃3′；下游5′⁃ATAGCACAGCCTGGATAGCAA⁃3′。

Real⁃time PCR检测结果如图5所示，同一组RUNX2、OCN、COL⁃I mRNA的表达量均是7 d高于3 d，与Ctrl组相比，相同时段LPS⁃CM组成骨相关蛋白RUNX2、OCN、COL⁃I的mRNA相对表达量均明显低于Ctrl组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

倒置相差显微镜下观察细胞，实验所用巨噬细胞呈圆形（图1a），LPS刺激后体积增大，胞浆丰富（图1b）。

  

图3 2组牙周膜细胞的生长曲线Figure 3 Growth curves of PDLCs of two groups

3 讨论

3.1 体内炎性微环境的模拟

RUNX2 引物序列：上游 5′⁃TCCAACCCAC⁃GAATGCACTAC⁃3′；下游5′⁃GTAGTGAGTGTGGCG⁃GACT⁃3′。 OCN 引 物 序 列 ：上 游 5′⁃ACGCG⁃GAAGGTCCGATATGGT ⁃3′；下 游 5′⁃TGCCT⁃GACTTTCGCATTAGC ⁃3′。COL⁃I引物序列：上游5′⁃GGACACAATGGATTGCAAGG⁃3′；下游 5′⁃TAAC⁃CACTGCTCCACTCTGG⁃3′。GAPDH 引物序列：上游 5′⁃TGTGTCCGTCGTGGATCTGA⁃3′；下游 5′⁃TT⁃GCTGTTGAAGTCGCAGGAG⁃3′。

  

图4 成骨诱导3 d、7 d后ALP活性检测结果Figure 4 ALP activity after osteogenic induction for 3 d and 7 d

健康人血液中单核/巨噬细胞约（17.1±3.2）%表达M2型细胞因子，几乎不表达M1型细胞因子。而肥胖、高血糖人群体内可能出现巨噬细胞活性改变［5］，表达较多的促炎性M1型细胞因子，可高达（92.3±1.7）%，M2型细胞因子的表达量低，约占（2.0±1.5）%。

课题组在预实验中发现LPS持续刺激巨噬细胞4 h、12 h后分泌大量的M1型促炎细胞因子，微量的免疫调节和促组织修复的M2型细胞因子，故用此模拟体内巨噬细胞介导的炎性微环境［6］，不同于加入定量的炎症因子，而是多炎症因子组合在一起共同作用。

  

图5 成骨诱导3 d、7 d后RUNX2、OCN、COL⁃1的基因表达情况Figure 5 mRNA expression of Runx2，OCN and COL⁃1

3.2 炎性微环境对细胞增殖的影响

细胞增殖是组织再生修复的要素，LPS⁃CM组中PDLCs受炎性因子影响，增殖率显著低于Ctrl组，Lacey等［7］对滑膜细胞增殖的研究中发现，TNF⁃α、IL⁃1β 通过调节NF⁃κB信号通路，介导细胞产生各种细胞因子、黏附因子和生长因子，影响细胞周期，抑制细胞的增殖。Pacios等［8］研究伴放线杆菌引起的牙周炎症糖尿病动物模型中发现，炎性因子通过促进细胞的凋亡增加骨损伤，所以炎性组的OD值在3 d时与对照组差异显著可能是增殖受抑制且伴有凋亡，具体机制需进一步研究。

自2018年1月1日到6月30日，李凌共审结各类刑事案件175件，其中含刑庭带到速裁庭已审结的39件疑难复杂案件，平均审理天数为40.5天。速调速裁庭新收的已审结的121件刑事案件,平均审理天数仅为28.9天，当庭宣判率高达60%以上,部分适用简易程序审理的案件6天内审结，大大缩短了案件的审理周期，提高了结案率。

由此，新兴产业的早期发展需要以风险投资基金为代表的战略投资者以股权投资的方式予以支持，在此背景下才能迅速而稳定的实现企业成长。但新兴产业的融资需求具有行业上的不对称性，这就需要政府引导基金对市场失灵的矫正和调整。从融资需求上看，风险投资基金的核心目的在于实现盈利，在资本约束的情况下要求资本较快回流，由此金融资本会流向中短期内具有较好盈利前景的企业，对具有中长期研发前景的企业支持不足。以2012年～2018年的中国独角兽企业为例，大量的创业投资流入美团、滴滴打车、小黄车等技术门槛较低的消费行业，相对而言能源、软件开发、生物技术等行业的新兴产业获得较少投资。

3.3 炎性微环境对成骨分化的影响

  

图6 成骨诱导3、7 d后RUNX2、OCN、COL⁃1蛋白表达Figure 6 Protein expression of Runx2，OCN and COL⁃1 after osteogenic induction for 3，and 7 d

  

图7 牙周膜细胞成骨诱导14 d后茜素红染色观察及钙盐半定量检测Figure 7 Alizarin red staining results of PDLCs after osteogenic induction for 14 d and semi⁃quantitative analysis of calcium mineralization

体外培养的PDLCs在矿化诱导液的作用下，可分化成骨，产生钙化结节，并且表达多种成骨相关蛋白［9］，证实了牙周膜细胞成骨分化潜能。实验检测PDLCs成骨分化早期RUNX2、OCN、COL⁃I、ALP 4个标记骨组织形成的经典指标，尤其RUNX2在骨形成过程及成骨细胞分化中起着控制作用，是骨形成的关键基因［10］。实验结果显示除了OCN蛋白3 d的相对表达量外，炎性组RUNX2、OCN、COL⁃I mRNA和蛋白的表达均显著低于对照组，提示成骨受到抑制。传统的LPS直接作用于牙周膜干细胞模拟炎性微环境［11］，然后检测细胞成骨分化各指标，结论也是成骨分化受抑制［12-13］，与本实验结果基本一致。OCN蛋白3 d的相对表达量无差异主要可能因为OCN在成骨中的表达位于RUNX2的下游，而蛋白表达的变化又晚于mRNA表达的变化，故3 d未能体现差异。ALP为骨矿化提供磷酸盐，ALP活性与骨组织矿化呈正相关，本实验的ALP活性检测结果LPS⁃CM组高于Ctrl组，提示炎性上调矿化能力，而没有胶原COL⁃I分泌情况下并不能完成骨组织再生。Ding等［14］也发现在引入TNF⁃α、IL⁃1β后，间充质干细胞成骨分化的COL⁃I表达减少，但ALP活性显著增强，并以此解释关节炎可同时出现骨质疏松和骨质硬化。而茜素红染色及钙盐半定量分析最终得出LPS⁃CM组钙化结节少于Ctrl组，故成骨分化还是明显受到抑制。炎性微环境对骨再生的影响十分复杂，可通过自身促成骨细胞因子，如骨形态发生蛋白⁃2（bone morphogenetic protein⁃2，BMP⁃2）减少抑制骨再生［15］，近年来也研究发现 TNF⁃α、IL⁃1β 可磷酸化 GSK3β 激酶，从而抑制经典 Wnt/β⁃catenin通路的表达，进而抑制间充质干细胞的成骨分化［16⁃17］，当然对于抑制牙周膜细胞成骨分化的具体机制还需进一步研究。本实验在巨噬细胞介导的炎性微环境下成骨诱导PDLCs，结果显示了牙周组织再生修复是受到抑制的。

炎症是骨组织工程的起始因子，正常且适度的炎性反应是机体的一种防御反应，但长期慢性炎性反应则对机体不利，牙周的再生修复与免疫微环境紧密相关，高炎症性单核/巨噬细胞造成更大牙周组织损害的同时进一步抑制再生修复。因此，通过免疫手段改善炎性微环境能够为牙周炎的再生治疗提供新的治疗策略。

参考文献

[1] 刘娟,赵红宇,轩东英.人牙周膜细胞群多向分化潜能的实验研究[J].华西口腔医学杂志,2010,28(2):185⁃189.

[2] Chang ZL.Recent development of the mononuclear phagocyte sys⁃tem:in memory of Metchnikoff and Ehrlich on the 100th Anniver⁃sary of the 1908 Nobel Prize in Physiology or Medicine[J].Biol Cell,2009,101(12):709⁃721.

[3] Cekici A,Kantarci A,Hasturk H,et al.Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease[J].Periodon⁃tol 2000,2014,64(1):57⁃80.

[4] Mosser DM,Edwards JP.Exploring the full spectrum of macro⁃phage activation[J].Nat Rev Immunol,2008,8(12):958⁃969.

[5] Prieur X,Mok CY,Velagapudi VR,et al.Differential lipid parti⁃tioning between adipocytes and tissue macrophages modulates macrophage lipotoxicity and M2/M1 polarization in obese mice[J].Diabetes,2011,60(3):797⁃809.

[6] Han SW,Chen ZT.Activation of macrophages by lipopolysaccha⁃ride for assessing the immunomodulatory property of biomaterials[J].Termis,2015,5(1):19⁃28.

[7] Lacey D,Sampey A,Mitchell R,et al.Control of fibroblast⁃like synoviocyte proliferation by macrophage migration inhibitory factor[J].Arthritis Rheum,2003,48(1):103⁃109.

[8] Pacios S,Andriankaja O,Kang J,et al.Bacterial infection increas⁃es periodontal bone loss in diabetic rats through enhanced apopto⁃sis[J].Am J Pathol,2013,183(6):1928⁃1935.

[9] 李颖,张文元,杨亚冬,等.人牙周膜细胞在矿化液作用下的增殖、成骨分化与相关基因表达[J].口腔医学研究,2014,1(1):48⁃51,56.

[10] Luca D,Carbonare L,Innamorati G,et al.Transcription factor RUNX2 and its application to hone tissue engineering[J].Stem Cell Rev,2012,8(3):891⁃897.

[11] 杨俊,陈兴兴,方煌,等.LPS对人牙周膜细胞Toll样受体4及下游炎症因子表达的影响[J].临床口腔医学杂志,2014,30(11):689⁃691.

[12] Kato H,Taguchi Y,Tominaga K,et al.Porphyromonas gingivalis LPS inhibits osteoblastic differentiation and promotes pro⁃inflam⁃matory cytokine production in human periodontal ligament stem cells[J].Arch Oral Biol,2014,59(2):167⁃175.

[13] 袁萍,李淑慧,赵璐,等.炎症微环境下人牙周膜干细胞的生物学特性[J].中国组织工程研究,2016,20(6):898⁃905.

[14] Ding J,Ghali O,Lencel P,et al.TNF⁃alpha and IL⁃1beta inhibit RUNX2 and collagen expression but increase alkaline phospha⁃tase activity and mineralization in human mesenchymal stem cells[J].Life Sci,2009,84(15/16):499⁃504.

[15] Huang RL,Yuan Y,Zou GM,et al.LPS⁃stimulated inflammatory environment inhibits BMP⁃2⁃induced osteoblastic differentiation through crosstalk between TLR4/MyD88/NF⁃κB and BMP/Smad signaling[J].Stem Cells Dev,2014,23(3):277⁃289.

[16] Liu N,Shi ST,Deng MJ,et al.High levels of beta⁃Catenin signal⁃ing reduce osteogenic differentiation of stem cells in inflammatory microenvironments through inhibition of the noncanonical Wnt pathway[J].J Bone Miner Res,2011,26(9):2082⁃2095.

[17] Kong X,Liu Y.GSK3beta is a checkpoint for TNF⁃alpha mediated impaired osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in inflammatory microenvironments[J].Biochim Biophys Acta,2013,1830(11):5119⁃5129.