在法医物证检验中，提取产物的DNA浓度是决定该检材能否被检出和发挥作用的关键因素。当浓度较低达不到检测阈值时，常需要对提取产物进行浓缩，常用的浓缩设备为Microcon-100超滤管，但该设备仅被用于联合有机法[1-2]及Chelex法[3]来浓缩提取产物。目前，微量DNA的检验经常采用纯化试剂盒在自动化提取设备上进行提取，其高纯度的提取产物和极小的终体积（20～50μL）使后续的浓缩步骤失去意义。在此情况下，为提高检出率，检验人员通常会增加检材使用量，但由于消化体系也随之增大，其终浓度提高效果有限，同时受体积限制，难以自动化，通常需要用硅珠或磁珠反复收集，操作过程繁琐。有研究[4]表明，用目前较常见的DNA IQ磁珠（美国Promega公司）对目标样本进行吸附和洗脱时，会产生20%左右的损失，而反复收集会明显加大这一损失。

本研究拟运用Amicon®Ultra-0.5超滤离心管，以纤维类检材为对象，通过比较常规直接消化提取（以下简称“常规法”）和加大检材量消化后浓缩提取（以下简称“浓缩法”）两种方法，验证该设备用于脱落细胞等微量检材DNA提取的可行性。

1 材料与方法

1.1 样本

收集10名志愿者使用过的纱线手套，平均佩戴时间为 5h，共 20只，编号为 1～20。

1.2 主要仪器与试剂

Amicon®Ultra-0.5（100K）超滤离心管（美国 Millipore公司），QIAcube®全自动核酸纯化仪（德国QIAGEN公司），7500实时荧光定量PCR系统、3500xL基因分析仪（美国AB公司）。

QIAamp®DNA Micro试剂盒（德国QIAGEN公司），QuantifilerTMHuman DNA Quantification 试剂盒、AmpFℓSTRTMIdentifilerTMPlus PCR扩增试剂盒（美国AB公司）。

1.3 样本提取

运用QuantifilerTMHuman DNA Quantification试剂盒在7500实时荧光定量PCR系统上对提取到的DNA进行定量分析（反应体系：引物混合物10.5 μL，PCR反应混合物12.5μL，待测样本2μL），得到各样本的DNA质量浓度和达到扩增阈值的循环数（Ct值）。Ct值可以反映提取产物中扩增抑制物的量[4]。

浓缩法：在1～20号检材腕部剪取5cm×2cm大小纱线，置于2mL离心管中，用560μL裂解液和40μL蛋白酶K消化2h（保证两种方法初始细胞浓度基本一致）。以离心半径5.5cm，13000r/min，离心3min，将上清液移至Amicon®Ultra-0.5（100K）超滤离心管中，以离心半径 5.5cm，10000r/min，离心 2min（杂质较多时可适当延长），翻转过滤管，以离心半径5.5cm，1000r/min，离心2min，收集提取产物约200μL。

求助百度：意为道德败坏、品行低劣的、自身行为与社会相悖或违反人伦缺乏操守准则的人。此外，除用于辱骂和对他人的蔑视，也偶见形容一个人对社会或群体毫无贡献且拖后腿的情况。百度的解释重在道德品行，与人们的理解似也有距离。

按照QIAamp®DNA Micro试剂盒说明书中的方法，用QIAcube®全自动核酸纯化仪分别提取产物中的DNA，回收产物体积设定为40μL。

1.4 PCR定量、复合扩增和电泳检测

常规法：在1～20号检材腕部剪取2.5cm×2cm大小纱线，置于1.5mL离心管中，用280μL裂解液（Buffer ATL）和20μL蛋白酶K消化2h。

运用AmpFℓSTRTMIdentifilerTMPlus PCR扩增试剂盒进行扩增，反应体系为反应混合物4 μL、引物2 μL、待测样本 4 μL，按试剂盒说明书进行 PCR 扩增。用3500xL基因分析仪进行毛细管电泳，用Gene-MapperTMID v3.3软件分析检验数据，得到STR分型图谱，以各基因座谱带完整且峰高均值≥200RFU视为检出完整基因型。

运用Excel 2007软件对检测结果进行单因素方差分析，检验水准α=0.01。

科技的发展使得计算机和网络技术得以长驱直入仪器领域，即计算机和仪器技术结合起来。本文把LabVIEW语言应用于设计之中，开发了模拟调制系统，具有可操作性强，能够直观反映调制方式的特点。

1.5 数据处理

对松花江流域水利发展有关问题的认识和体会…………………………………………… 于洪民，王双旺(13.70)

2 结 果

2.1 PCR定量检测结果

用两种方法提取的产物DNA质量浓度及Ct值见表1。对检测结果进行单因素方差分析，结果显示：两种方法提取的产物DNA质量浓度差异均具有统计学意义（P〈0.01），浓缩法获得的产物DNA质量浓度明显高于常规法；Ct值差异无统计学意义（P〉0.01），表明两种方法得到的提取产物中抑制物含量相近。

宋之问的家乡有汾州（今山西汾阳附近）和弘农（今河南灵宝西南）二说，不论哪一处，离诗中的“汉江”都尚远。故“近乡”也只是从心理习惯而言。而且，按常情，一路惶惶奔来，他本该“近乡情更切，急欲问来人”才是，但他却“不敢问来人”，为何？很简单，与其负罪之身是分不开的——他不知家中这一段时间发生了什么变故，不敢想，不敢见……

表1 两种方法提取产物的定量检测结果

注：1）各编号样本与常规法比较，P值均〈0.01

编号 DNA质量浓度（ng/μL） Ct值常规法 浓缩法1） 常规法 浓缩法1 0.027 0.052 27.61 27.80 2 0.092 0.252 27.45 28.16 3 0.112 0.214 27.40 27.67 4 0.103 0.242 28.16 27.64 5 0.036 0.079 28.15 27.91 6 0.094 0.178 28.25 27.62 7 0.141 0.253 27.61 27.34 8 0.083 0.226 28.27 27.93 9 0.031 0.059 27.35 27.15 10 0.171 0.248 27.76 27.92 11 0.114 0.258 27.54 28.10 12 0.191 0.285 27.77 27.90 13 0.079 0.166 27.50 27.11 14 0.096 0.230 26.95 27.12 15 0.090 0.184 27.84 27.84 16 0.126 0.232 27.14 27.06 17 0.093 0.228 27.11 26.99 18 0.087 0.144 27.85 27.64 19 0.080 0.189 27.88 27.74 20 0.065 0.151 27.22 26.90 ±s 0.099±0.041 0.193±0.068 27.64±0.39 27.58±0.40

2.2 复合扩增和电泳分析

对两种方法的各20份提取产物进行复合扩增和电泳分析，常规法检出完整基因型的样本数为14份，浓缩法检出完整基因型的样本数为20份。

3 讨 论

DNA总量方面，在剪取面积增加1倍的情况下，两种方法最终提取产物平均DNA总量（质量浓度均值×40 μL）为 3.96 ng和 7.72 ng，浓缩法为常规法的1.95倍，说明消化液的浓缩过程几乎未造成DNA总量的损失，可以采用此方法，并通过增加离心次数来处理更大的消化体系。STR检验中完整基因型检出方面，运用浓缩法提取的样本完整基因型检出成功率得到明显提升。

本研究结果表明，Amicon®Ultra-0.5（100K）超滤离心管对消化产物浓缩效果良好，在初始细胞浓度相同的情况下大大提高了提取产物的DNA质量浓度，同时，并未造成提取产物中扩增抑制物含量的增加，对提高微量生物物证的有效利用具有积极意义，可以作为目前常用纯化试剂盒的有效补充。

参考文献：

[1]吴微微，徐林苗，李佑英，等.一种改良骨骼DNA的提取方法[J].刑事技术，2001（6）：12-14.

[2]张杰，薛庆节，唐光峰，等.陈旧骨骼DNA提取[J].法医学杂志，2006，22（1）：72-73.

[3]章少青，廖燕妮，金阳，等.Microcon-100超滤管在脱落上皮细胞DNA检验中的应用[J].江西警察学院学报，2012（4）：116-117.

[4]杨电，张丽萍，刘超，等.Chelex法和两种磁珠法提取接触 DNA 效果的比较[J].刑事技术，2012（1）：11-13.