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Early Access STR Kit v1对24个常染色体STR基因座和Amelogenin基因座的法医学检测

更新时间：2016-07-05

含有3～5个碱基重复单元的STR基因座是法医学常用遗传标记，主要表现为长度多态性，可用于个体识别及亲权鉴定[1-2]。其中，根据STR基因座核心序列结构的重复情况，可以分为简单重复结构、复合重复结构及复杂重复结构[3]。常用的毛细管电泳检测平台主要根据等位基因片段长度的大小及荧光素标记技术对STR基因座各等位基因进行读取和分析，检测方便且成本低，但无法获取内部序列结构信息[3-4]。目前，随着二代测序技术的快速发展及成本的大幅下降，基于二代测序技术对STR基因座进行分析已成为研究热点[5-6]。本研究主要采用美国Thermo Fisher Scientific公司推出的基于Ion PGMTMTorrent平台的Early Access STR Kit v1对湖南地区24名汉族无关个体进行24个常染色体STR基因座和Amelogenin基因座的分型检测，探讨二代测序技术进行STR基因座检测分析的可行性。

1 材料与方法

采集湖南地区24名汉族无关个体的外周血样本，其中男性12名，女性12名。血样均稀释至0.5ng/μL备用。采用QIAamp DNA Blood Mini试剂盒（德国QIAGEN公司）进行DNA提取，用Quantifiler®Human DNA Quantification试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）进行DNA定量。本研究采用DNA标准品9948（美国Promega公司）作为阳性对照。

采用Early Access STR Kit v1（美国Thermo Fisher Scientific公司）对上述24份检材及DNA标准品9948进行文库构建、文库定量、乳液PCR反应、文库富集、二代测序及结果分析。文库构建PCR体系为20μL，包括EA STR PCR 2.5×PCR反应混合物 v1 8 μL、EA STR 10×PCR引物混合物v1 2μL和基因组DNA（gDNA）1ng，其余体积用超纯水补齐。文库构建PCR采用28个循环数，具体操作参照试剂盒说明书进行。定量后文库稀释为20 pmol/L。采用Ion PGMTMHi-QTMOT2 200试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）对15μL稀释文库进行乳液PCR及富集反应。对富集后的产物在Ion PGMTMTorrent平台上采用Ion PGMTMHi-QTMSequencing程序进行测序检测，Flow数为850。采用Ion 318TMChip v2芯片对24个样本和标准品9948进行并行检测，重复一次。测序数据采用插件HID STR Genotyper v3.0进行分析。

农业地质调查是针对与农业生产密切相关的地质环境要素展开的调查工作，研究岩石、土壤、水、生物等要素的相互作用及规律，是地质科学在农业生产的直接应用，调查成果可以为土壤质量评价提供基础数据。笔者以广西上思县为调查区，对广西上思县土壤状况进行调查，以期为上思县科学合理布局农业生产提供参考，对探索农业地质调查成果的应用具有重要意义。

对上述样本采用Goldeneye®DNA身份鉴定系统20A试剂盒［基点认知技术（北京）有限公司］和华夏TM白金PCR扩增试剂盒（美国AB公司）进行24个常染色体STR基因座和Amelogenin基因座的PCR扩增。扩增产物在3500基因分析仪（美国AB公司）上进行毛细管电泳检测，采用GeneMapperTMID-X v1.4软件进行结果分型。

Early Access STR Kit v1中含有的24个常染色体STR基因座信息及相关序列结构信息见表1。

2 结果与讨论

[4]The thrust of supply-side policy is less clear,despite the term’s prominence at recent economicplanning meetings and its dissection in numerous articles published by state media.（2016-01-02）

本研究采用Ion 318TMChip v2芯片对24个样本和标准品9948进行两次并行检测，分型结果一致。两次测序的芯片有效数据率分别为62.38%和65.64%，可用于进一步分析。各基因座上获取的测序数据可分为等位基因测序信息、Stutter测序信息及噪音信息[5-6]。将各STR基因座获取的等位基因测序信息与总测序信息量之比作为衡量测序数据有效率的评价指标。结果显示，24个常染色体STR基因座的数据有效率在65.32%（D2S1776）～88.69%（TPOX），平均测序读深为484X（D1S1677）～6434X（D19S433）。

同时，24个常染色体STR基因座及Amelogenin基因座检测到的等位基因与毛细管电泳检测结果一致。24个常染色体STR基因座的序列等位基因信息见表2。其中，在 D1S1656、D4S2408、D5S2500、D21S11、D2S441、D2S1338、D3S1358、D8S1179 和 vWA 基因座中均检见序列多态性，这也是二代测序技术相较于毛细管电泳的优势之一，有助于亲缘关系的进一步分析及突变事件的分析[5-6]。

表1 Early Access STR Kit v1中24个常染色体STR基因座序列结构信息

注：[]内序列为主要重复结构；（）内序列为非主要重复结构，但需计入重复结构计算；{}内序列不计入重复结构计算

基因座 染色体 重复结构 起始位置 终止位置D1S1677 1号 [TTCC]163559816 163559875 D1S1656 1号 [TAGA][TGA][TAGG][TG]230905362 230905429 TPOX 2号 [AATG]1493425 1493456 D2S441 2号 [TCTA]68239079 68239126 D2S1776 2号 [AGAT]169645403 169645446 D2S1338 2号 [TGCC][TTCC]218879582 218879673 D3S1358 3号 [TCTA][TCTG]45582231 45582294 D4S2408 4号 [ATCT]31304420 31304455 D5S2500 5号 [GGTA][GACA][GATA][GATT]58698958 58699025 D5S818 5号 [AGAT]123111250 123111293 CSF1PO 5号 [AGAT]149455887 149455938 D6S1043 6号 [AGAT]ACAT[AGAT]92449943 92449990 D6S474 6号 [AGAT][GATA]112879153 112879220 D7S820 7号 [GATA]83789542 83789593 D8S1179 8号 [TCTA][TCTG][TCTA]125907107 125907158 D9S2157 9号 [ATA]136035669 136035698 D10S1248 10号 [GGAA]131092508 131092559 TH01 11号 [TCAT]CAT[TCAT]2192319 2192346 vWA 12号 [TCTA][TCTG]6093143 6093210 D13S317 13号 [TATC]82722160 82722203 D14S1434 14号 [CTGT][CTAT]95308391 95308442 D16S539 16号 [GATA]86386308 86386351 D19S433 19 号 [AAGG]（AAGGTAGG） 30417142 30417197 D21S11 21号 [TCTA][TCTG]{TA}{TCA}{TCCATA} 20554291 20554417

表2 24个常染色体STR基因座等位基因及序列结构信息 （n=24）

D1S1677 TPOX D2S1776 CSF1PO等位基因 序列信息 等位基因 序列信息 等位基因 序列信息 等位基因 序列信息12 [TTCC]12 8 [AATG]8 8 [AGAT]8 10 [AGAT]10 13 [TTCC]13 9 [AATG]9 9 [AGAT]9 11 [AGAT]11 14 [TTCC]14 11 [AATG]11 10 [AGAT]10 13 [AGAT]13 15 [TTCC]15 12 [AATG]12 13 [AGAT]13 14 [AGAT]14 16 [TTCC]16 14 [AGAT]14 15 [AGAT]15 D4S2408 D5S818 D7S820等位基因 序列信息 等位基因 序列信息 等位基因 序列信息8 [ATCT]8 8 [AGAT]8 8 [GATA]8 9 [ATCT]1GTCT[ATCT]7 9 [AGAT]9 9 [GATA]9 9 [ATCT]9 10 [AGAT]10 10 [GATA]10 10 [ATCT]10 11 [AGAT]11 11 [GATA]11 11 [ATCT]11 12 [AGAT]12 12 [GATA]12 12 [ATCT]12 13 [AGAT]13 14 [GATA]14 D1S1656 D6S1043等位基因 序列信息 等位基因 序列信息11 [TAGA]11 10 [AGAT]10 12 [TAGA]11[TAGG]1 11 [AGAT]11

表2（续）

D6S1043等位基因 序列信息 等位基因 序列信息12 [TAGA]12 12 [AGAT]12 13 [TAGA]12[TAGG]1 13 [AGAT]13 13 [TAGA]13 14 14 [TAGA]14 15 15 [TAGA]14[TAGG]1 17 [AGAT]11ACAT[AGAT]5 16 [TAGA]15[TAGG]1 18 [AGAT]12ACAT[AGAT]5 17 [TAGA]16[TAGG]1 19 [AGAT]13ACAT[AGAT]5 17.3 [TAGA]4[TGA]1[TAGA]12[TAGG]1 20 [AGAT]14ACAT[AGAT]5 D5S2500 D19S433等位基因 序列信息 等位基因 序列信息14 [GGTA]3[GACA]6[GATA]2[GATT]3 10 [AAGG]1AAAG[AAGG]1TAGG[AAGG]8 14 [GGTA]3[GACA]7[GATA]1[GATT]3 11.2 [AAGG]1AA[AAGG]1TAGG[AAGG]10 17 [GGTA]3[GACA]8[GATA]3[GATT]3 12 [AAGG]1AAAG[AAGG]1TAGG[AAGG]10 18 [GGTA]3[GACA]10[GATA]2[GATT]3 13.2 [AAGG]1AA[AAGG]1TAGG[AAGG]12 18 [GGTA]3[GACA]9[GATA]3[GATT]3 14 [AAGG]1AAAG[AAGG]1TAGG[AAGG]12 20 [GGTA]8[GACA]5[GATA]3[GATT]4 15.2 [AAGG]1AA[AAGG]1TAGG[AAGG]14 23 [GGTA]9[GACA]6[GATA]3[GATT]5 16 [AAGG]1AAAG[AAGG]1TAGG[AAGG]14 24 [GGTA]10[GACA]6[GATA]3[GATT]5 16.2 [AAGG]1AA[AAGG]1TAGG[AAGG]15 D2S1338 D6S474等位基因 序列信息 等位基因 序列信息10 [TGCC]4[TTCC]6 13 [AGAT]5[GATA]8 16 [TGCC]6[TTCC]10 14 [AGAT]5[GATA]9 17 [TGCC]6[TTCC]11 15 [AGAT]5[GATA]10 18 [TGCC]6[TTCC]12 16 [AGAT]5[GATA]11 18 [TGCC]7[TTCC]11 17 [AGAT]5[GATA]12 19 [TGCC]6[TTCC]13 19 [AGAT]5[GATA]14 19 [TGCC]7[TTCC]12 D14S1434 20 [TGCC]7[TTCC]13 等位基因 序列信息20 [TGCC]7TCCC[TTCC]12 10 [CTGT]3[CTAT]7 21 [TGCC]6[TTCC]15 11 [CTGT]3[CTAT]8 21 [TGCC]7[TTCC]14 12 [CTGT]3[CTAT]9 22 [TGCC]5[TTCC]14GTCC[TTCC]2 13 [CTGT]3[CTAT]10 22 [TGCC]7[TTCC]12GTCC[TTCC]2 14 [CTGT]3[CTAT]11 23 [TGCC]6[TTCC]14GTCC[TTCC]2 15 [CTGT]3[CTAT]12 23 [TGCC]7[TTCC]13GTCC[TTCC]2 D3S1358 24 [TGCC]7[TTCC]14GTCC[TTCC]2 等位基因 序列信息D2S441 14 [TCTA]1[TCTG]2[TCTA]11等位基因 序列信息 15 [TCTA]1[TCTG]1[TCTA]13 10 [TCTA]10 15 [TCTA]1[TCTG]2[TCTA]12 10 [TCTA]8TCTG[TCTA]1 15 [TCTA]1[TCTG]3[TCTA]11 11 [TCTA]11 16 [TCTA]1[TCTG]1[TCTA]14 12 [TCTA]12 16 [TCTA]1[TCTG]2[TCTA]13 14 [TCTA]11TTTA[TCTA]2 16 [TCTA]1[TCTG]3[TCTA]12 D8S1179 17 [TCTA]1[TCTG]1[TCTA]15等位基因 序列信息 17 [TCTA]1[TCTG]2[TCTA]14 8 [TCTA]8 17 [TCTA]1[TCTG]3[TCTA]13 10 [TCTA]10 18 [TCTA]1[TCTG]3[TCTA]14 11 [TCTA]11 19 [TCTA]1[TCTG]2[TCTA]16 12 [TCTA]1TCTG[TCTA]10 19 [TCTA]1[TCTG]3[TCTA]15 12 [TCTA]12 20 [TCTA]1[TCTG]3[TCTA]16 D1S1656[AGAT]14[AGAT]15

表2（续）

TH01等位基因 序列信息 等位基因 序列信息13 [TCTA]1TCTG[TCTA]11 13 [TCTA]13 7 [CATT]7 14 [TCTA]1TCTG[TCTA]12 8 [CATT]8 14 [TCTA]2TCTG[TCTA]11 9 [CATT]9 15 [TCTA]1TCTG[TCTA]13 9.3 [CATT]4CAT[CATT]5 15 [TCTA]2TCTG[TCTA]12 10 [CATT]10 16 [TCTA]2TCTG[TCTA]13 vWA D8S1179 6 [CATT]6 D9S2157等位基因 序列信息 等位基因 序列信息14 [TCTA]1[TCTG]1[TCTA]1[TCTG]4[TCTA]3TCCA[TCTA]3 7 [ATA]7 14 [TCTA]1[TCTG]4[TCTA]9 9 [ATA]9 15 [TCTA]1[TCTG]3[TCTA]11 10 [ATA]10 15 [TCTA]1[TCTG]4[TCTA]10 11 [ATA]11 16 [TCTA]1[TCTG]4[TCTA]11 12 [ATA]12 17 [TCTA]1[TCTG]4[TCTA]12 13 [ATA]13 18 [TCTA]1[TCTG]4[TCTA]13 15 [ATA]15 19 [TCTA]1[TCTG]3[TCTA]15 16 [ATA]16 19 [TCTA]1[TCTG]4[TCTA]14 D10S1248 20 [TCTA]1[TCTG]4[TCTA]15 等位基因 序列信息D21S11 8 [GGAA]8等位基因 序列信息 12 [GGAA]12 26 [TCTA]4[TCTG]5[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]9 13 [GGAA]13 27 [TCTA]4[TCTG]6[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]9 15 [GGAA]15 28 [TCTA]4[TCTG]6[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]10 16 [GGAA]16 29 [TCTA]4[TCTG]6[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]11 D13S317 29 [TCTA]6[TCTG]5[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]10 等位基因 序列信息30 [TCTA]4[TCTG]6[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]12 8 [TATC]8 30 [TCTA]5[TCTG]6[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]11 9 [TATC]9 30 [TCTA]6[TCTG]5[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]11 10 [TATC]10 30 [TCTA]7[TCTG]5[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]10 11 [TATC]11 30.2 [TCTA]5[TCTG]6[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]10TA[TCTA]1 12 [TATC]12 31 [TCTA]5[TCTG]6[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]12 13 [TATC]13 31 [TCTA]7[TCTG]5[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]11 D16S539 31.2 [TCTA]5[TCTG]5[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]12TA[TCTA]1 等位基因 序列信息31.2 [TCTA]5[TCTG]6[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]11TA[TCTA]1 8 [GATA]8 32.2 [TCTA]5[TCTG]5[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]13TA[TCTA]1 9 [GATA]9 32.2 [TCTA]5[TCTG]6[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]12TA[TCTA]1 10 [GATA]10 33 [TCTA]5[TCTG]6[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]14 11 [GATA]11 33.2 [TCTA]5[TCTG]6[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]13TA[TCTA]1 12 [GATA]12 13 [GATA]13

上述研究结果表明，采用Early Access STR Kit v1不仅可以实现多个遗传标记（24个常染色体STR基因座和Amelogenin基因座）的并行检测，同时也可以对多个样本实现并行检测，从而节约样本检测量及检测时间。本研究采用1ng DNA进行文库构建及后续测序分析，检测结果可靠，数据量大，但是实验过程及结果分析较毛细管电泳更为复杂。该技术不仅可以实现STR基因座的内部序列结构解析，同时可以获取其侧翼序列结构存在的变异信息，是未来法医学STR基因座研究及应用的有效手段。

布龙菲尔德（Leonard Bloomfield）在《语言论》（1955）中将语法分为句法（Syntax）和词法（Morphology）两个主要内容[21]。建筑语言的句法是将建筑元素组织成一定的空间关系或空间结构的规则与手法，建筑语言的词法是建筑元素自身的构成规则与手法。建筑语言的语法反映出来的是建筑语汇的句段关系3）（Syntagmatic Relations，或译作组合关系），也就是建筑的各元素、各部件如何组合的问题。

参考文献：

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本期文章中可直接使用的缩略词

死亡时间（postmortem interval，PMI）

肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）

β-肌动蛋白（beta-actin，ACTB）

腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）

乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）

置信区间（confidence interval，CI）

呼吸（respiration，R）

脉搏（pulse，P）

血压（blood pressure，BP）

体质量指数（body mass index，BMI）

重症监护病房（intensive care units，ICU）

计算机断层扫描（computed tomography，CT）

多层螺旋 CT（multi-slice spiral CT，MSCT）

计算机X线摄影（computed radiography，CR）

数字化X线摄影（digital radiography，DR）

脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）

核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）

信使 RNA（messenger RNA，mRNA）

线粒体 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）

核糖体 DNA（ribosomal DNA，rDNA）

短串联重复序列（short tandem repeat，STR）

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）

插入/缺失（insertion/deletion，InDel）

脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）

相对荧光单位（relative fluorescence unit，RFU）

杂合度（heterozygosity，H）

期望杂合度（expected heterozygosity，He）

观察杂合度（observed heterozygosity，Ho）

个体识别率（discrimination power，DP）

累积个体识别率（cumulative discrimination power，CDP）

多态信息含量（polymorphism information content，PIC）

非父排除率（probability of paternity exclusion，PE）

三联体非父排除率（probability of excluding paternity in trios，PEtrio）

二联体非父排除率（probability of excluding paternity in duos，PEduo）

累积非父排除率（cumulative probability of paternity exclusion，CPE）

匹配概率（probability of matching，Pm）

基因多样性（gene diversity，GD）

父权指数（paternity index，PI）

累积父权指数（combined paternity index，PI）

最小等位基因频率（minor allele frequency，MAF）

DNA联合索引系统（combined DNA index system，CODIS）

局部序列排比搜索基本工具（basic local alignment search tool，BLAST）

虾碱性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）

基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）

朱敏，杨媚杰
《法医学杂志》 2018年第02期
《法医学杂志》2018年第02期文献

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