溺水是世界三大意外死亡原因之一，在发达国家，每10万人中有0.6～1.2人死亡[1]。而水中尸体的死因判定是法医学者公认的难题之一，这是由于大部分溺死案件的特征性尸体检验所见很少，从而难以与自杀、意外、他杀及自然死亡区别[2]。有研究[3]表明，约88个应激相关炎症因子可能有助于溺死的诊断，其中包括白细胞介素（interleukin，IL）-1α、IL-1β、IL-13 等。 本研究利用上述炎症因子，并加入常见疾病心肌梗死作为对照，采用TaqMan探针法检测大鼠肺组织及血清中 IL-1α、IL-1β、IL-13 mRNA 的表达变化，进一步探究其作为溺死诊断指标的可行性。

1 材料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 实验动物分组

（4）在员工对“生态与人文环境保护”满意度评价中，本文依据文献，设计出如下二级评价指标：企业环境保护态度（U341）、企业生产中环境保护措施（U342）、企业参与社会生态环境计划（U343）。

健康雄性SD大鼠18只，由山西医科大学动物中心提供，体质量150～200 g，随机分为溺死组、空白对照组和心肌梗死组，每组6只。

1.1.2 模型制作及检材提取

LightCycler®480 系统（瑞士 Roche 公司）、Centrifuge 5430R多功能微型台式高速离心机（德国eppendorf公司）。BIOG组织RNA提取试剂盒、BIOG血浆游离RNA提取试剂盒、一步法超级荧光定量PCR试剂盒（常州百代生物科技有限公司）。

在LightCycler®480系统上采用TaqMan探针法进行PCR。按照一步法超级荧光定量PCR试剂盒说明书进行操作，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.6 μL，TaqMan 探针（10 μmol/L） 0.5 μL，模板 RNA 500 ng，无RNA酶的双蒸水（瑞士Roche公司）加至20 μL。本实验中样品和内参基因检测均重复3次。PCR反应条件：42℃反转录 15min；95℃预变性 10min；95℃变性 15s，60℃退火 30s，72℃延伸 1min，40个循环。

1.2 主要仪器与试剂

大鼠均笼养，室温保持在20～25℃。溺死组大鼠投入水桶中，让其自由游泳10 min左右适应水中温度，再将其头部按入水中至溺死后捞出[4]。空白对照组采用颈椎脱臼法处死。心肌梗死组应用异丙肾上腺素25 mg/kg·d-1腹膜下注射，连续注射5 d，建立大鼠心肌梗死模型[5]，第6天颈椎脱臼法处死。

1.3 IL-1α、IL-1β 及 IL-13 mRNA 的提取

肺组织IL-1α、IL-1β及IL-13 mRNA的提取按照BIOG组织RNA提取试剂盒的说明书进行操作，血清IL-1α、IL-1β及IL-13 mRNA的提取参照BIOG血浆游离RNA提取试剂盒的说明书进行操作。

1.4 引物、探针设计与合成

目的基因及内参基因的引物、探针序列均来自于GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/），并采用AlleleID 6.0软件进行引物设计优化，经BLAST检索确认特异性，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物、探针序列见表1。

表1 目的基因及内参基因的引物和探针序列

基因 引物序列 探针序列 产物长度/bp IL-1α F：5′-TTGTTTGATGTTGCTGACACC-3′ 5′-ACCACCACCCGGCTCTCCTTGAA-3′ 119 R：5′-CCTCTCAAGCAGAGCACAGA-3′IL-1β F：5′-ACGGGTTCCATGGTGAAGT-3′ 5′-ACTATGTCCCGACCATTGCTGTTTCC-3′ 79 R：5′-CCTCTCAAGCAGAGCACAGA-3′IL-13 F：5′-GGTCCACAGCTGAGATGTCC-3′ 5′-TCTCCCCTCAGTGGCCATAGCGGAA-3′ 77 R：5′-CTGCTCAATTACTCCAAGCAACT-3′ACTB F：5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3′ 5′-CCACCATGTACCCAGGCATTGCTGAC-3′ 92 R：5′-AGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3′GAPDH F：5′-GGGCTCTCTGCTCCTCCCTGTT-3′ 5′-CCGTTCACCGACCTTCACCATCTTG-3′ 118 R：5′-AGGCGTCCGATACGGCCAAA-3′

1.5 一步法实时荧光定量PCR

处死后各组大鼠均从右心室抽取静脉血2～4mL，置于4℃冰箱中冷却30min，之后以离心半径10cm，1 000 r/min，离心5 min，收集血清，置于-80℃冰箱中备用。取血后，剪取右肺下叶5g，置于-80℃冰箱中备用。剪取各组大鼠心肌，10%多聚甲醛溶液固定后，制成石蜡切片，行HE染色进行组织病理学观察。

荷里路德修道院遗址给我留下了非常深刻的印象。在这残垣断壁中，还能依稀看出修道院原来的模样，粗壮的立柱、长长的廊道、精美的雕刻以及雕刻上附着的绿色斑痕，无不透着岁月的沧桑。

11月29日，国际原油价格再度跳水。WTI原油跌破50美元/桶关口，创13个月新低；布伦特原油跌破58美元/桶关口，也创13个月新低。

1.6 数据处理

采用2-△Ct法[6]进行基因表达的相对定量计算。应用SPSS 23.0软件对结果进行统计分析。所有数据均以±s表示，各指标多组间均数比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。

家族企业是以非制度化管理为主要特征的企业组织，企业家权威尤其是非合法性权威在企业运营中占据重要地位。由于越商精神的影响，越商家族企业非合法性权威的重要性进一步提高。在家族企业代际传承过程中，非合法性权威的不可复制性是大多数企业传承失败的主要原因。为此，越商家族企业主要采取让继任者参加企业运营管理相关培训项目、在家族企业基层工作、在外部企业工作等方法重构魅力权威。倘若魅力权威能够先于合法权威建立，或者在企业遭遇重大危机之前建立，家族企业顺利传承的可能性就会大大提高。反之，越商特有的“精神气质”就会消失，企业将面临代际交替所导致的剧烈震荡。

2 结 果

2.1 病理学所见

在江苏省南通全市范围内选择耕翻秸秆还田、耕翻无秸秆还田、浅旋秸秆还田、浅旋无秸秆还田、免耕秸秆还田共5种耕作方式的小麦田块，每种耕作方式至少5块田，每块田的面积不低于 1 333 m2。

心：心肌梗死组心肌细胞肿胀，部分心肌细胞排列紊乱，出现空泡样变性，核溶解消失，可见炎症细胞浸润。溺死组及空白对照组大鼠心肌无明显异常。

肺：溺死组肺体积明显增大，出血严重，肺缘钝圆，挤压肺组织可见气管和肺切面有泡沫样液体流出。心肌梗死组和空白对照组大鼠肺组织外观正常，可见散在出血点。

2.2 肺组织 IL-1α、IL-1β、IL-13 mRNA 表达检测

由表2可知：（1）与空白对照组比较，溺死组大鼠肺组织中IL-1α、IL-1β及IL-13 mRNA表达差异均无统计学意义（P〉0.05）；（2）与心肌梗死组比较，溺死组大鼠肺组织中上述指标均无明显改变（P〉0.05）；（3）与空白对照组比较，心肌梗死组大鼠肺组织中上述指标表达差异均无统计学意义（P〉0.05）。

溺死组大鼠在溺死终末期均未见口鼻部流出泡沫。

2.3 右心室血清 IL-1α、IL-1β、IL-13 mRNA 表达检测

由表2可知：（1）与空白对照组比较，溺死组大鼠右心室血清中 IL-1β、IL-13 mRNA 表达均升高（P〈0.05），IL-1α mRNA 表达差异无统计学意义（P〉0.05）；（2）与心肌梗死组比较，溺死组大鼠右心室血清中IL-1β及IL-13 mRNA 表达均升高（P〈0.05），IL-1α mRNA 表达差异无统计学意义（P〉0.05）；（3）与空白对照组比较，心肌梗死组大鼠右心室血清中IL-1α、IL-1β及IL-13 mRNA表达差异均无统计学意义（P〉0.05）。

表2 各组大鼠肺组织与右心室血清中IL-1α、IL-1β、IL-13 mRNA的相对表达量（n=6，±s）

注：1）与空白对照组比较，P〈0.05；2）与心肌梗死组比较，P〈0.05

组别 组织 IL-1α IL-1β IL-13空白对照 肺 0.16±0.04 0.12±0.03 0.10±0.03血清 0.15±0.03 0.13±0.01 0.10±0.02心肌梗死 肺 0.15±0.01 0.12±0.01 0.09±0.01血清 0.13±0.02 0.15±0.03 0.09±0.03溺死 肺 0.18±0.04 0.12±0.03 0.09±0.02血清 0.15±0.02 0.19±0.051）2） 0.16±0.041）2）

3 讨 论

溺死案件的大体解剖虽常具有特征性，但不具有特异性，需结合现场勘验等综合分析。尸体解剖时肺组织可见水性肺气肿改变，但这也不是溺死的特异性变化，在其他情况下也可发生，如充血性心力衰竭、麻醉药物过量或者随后的长期复苏等[7]。但溺水的发生发展过程中伴随着独特且复杂多样的应激反应，因应激时间不同，其应激反应所涉及的相关基因表达也不尽相同。有研究[8]发现，在机械性窒息、溺死以及火灾中死亡的尸体肺组织中肺表面活性物质相关蛋白质A（pulmonary surfactant-associated protein A，SP-A）mRNA表达下调，这与急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）患者肺组织中 SP-A的表达变化一致，认为溺水死亡的过程中可能伴随着早期的ARDS。此外，该实验也发现溺水激活了炎症反应，肺组织中TNF-α、IL-1β和IL-10 mRNA表达升高，而这些炎症因子在急性肺损伤或ARDS中亦发挥着重要的作用。

IL-1α与IL-1β同属于IL-1家族，两者通过共同的IL-1受体传递信号通路，白细胞介素-1受体拮抗剂（interleukin-1 receptor antagonist，IL-1Ra）可以阻断该信号通路[9]。IL-1作为一类复杂的多功能细胞因子，广泛参与细胞因子网络调节，从而对机体各种类型的细胞均能发挥调控作用[10]。IL-13是一种天然抗炎症细胞因子，包括抑制单核细胞释放炎症介质，诱导B细胞增殖及分化，促进IgE生成。IL-13还可以增加IL-1Ra的生成，并且减弱白细胞和内皮细胞的相互作用，进而发挥抑制炎症反应并调节免疫反应的作用[11]。

新媒体塑造了全新的社会生活形态，基于新媒体技术，人们通过线上、线下社群互动形成集体记忆,分享人生体验并发展集体归属感；新媒体的实践使弱势群体在话语、经济、文化、社会资本等领域得到权力和能力的提升；新媒体的话语方式，改变了公众对社会的认知，形成论题、参与讨论、集体抗争将是新媒体赋权的发展趋势。在这样的趋势下，传统大众传播媒体赋权产生了前所未有的变革，其伦理本质由被动的伦理赋予发展至主动的伦理建构。

与空白对照组和心肌梗死组比较，IL-1α、IL-1β、IL-13 mRNA在溺水组大鼠肺组织中表达差异无统计学意义，可能不能鉴别诊断生前溺死。PARSONS等[12]研究认为，血浆中一些炎症因子的升高，提示肺损伤的程度及预后情况。本实验溺死大鼠血清中IL-1β和IL-13 mRNA表达上调，有可能预示着溺水大鼠肺损伤的严重程度。通过检测血清中IL-1β、IL-13 mRNA，有望为生前溺水与死后抛尸入水的鉴别提供依据。

致谢：

感谢导师任广睦老师在我研究生期间对我的悉心点拨及照顾。任老师无论在理论上还是实践中，都给予我很大的帮助。在此，谨向导师表示崇高的敬意和衷心的感谢！

参考文献：

[1]HOOPER A J，HOCKINGS L E.Drowning and immersion injury[J].Anaesthesia&Intensive Care Medicine，2011，12（9）：399-402.

[2]汪家文，于晓军，王晓雁.溺死法医学鉴定的研究新进展[J].法医学杂志，2008，24（4）：276-279.

[3]尹长玉.不同溺死类型大鼠肺组织中应激相关基因的表达水平研究[D].太原：山西医科大学法医学，2015.

[4]马艳艳，刘昕，李玉湘.溺水大鼠动物模型的建立及观察[J].郑州大学学报（医学版），2008，43（2）：359-362.

[5]闫位娟，李贻奎，高会丽，等.心肌梗死模型研究进展[J].赤峰学院学报：自然科学版，2012（11）：144-146.

[6]李康.医学统计学[M].6版.北京：人民卫生出版社，2013：235.

[7]LIU Z，ZHANG B，WANG X B，et al.Hypertonicity contributes to seawater aspiration-induced lung injury：Role of hypoxia-inducible factor 1α[J].Exp Lung Res，2015，41（6）：301-315.

[8]MIYAZATO T， ISHIKAWA T， MICHIUE T， et al.Molecularpathology ofpulmonary surfactantsand cytokines in drowning compared with other asphyxiation and fatal hypothermia[J].Int J Legal Med，2012，126（4）：581-587.

[9]GALANI V，TATSAKI E，BAI M，et al.The role of apoptosis in the pathophysiology of Acute Respiratory Distress Syndrome （ARDS）： an up-to-date cellspecific review[J].Pathol Res Pract，2010，206（3）：145-150.

[10]DI PAOLO N C，SHAYAKHMETOV D M.Interleukin 1α and the inflammatory process[J].Nat Immunol，2016，17（8）：906-913.

[11]张宏伟，潘灵辉.急性肺损伤与细胞因子平衡的研究进展[J].医学综述，2006，12（23）：1411-1414.

[12]PARSONS P E，MATTHAY M A，WARE L B，et al.Elevated plasma levels of soluble TNF receptors are associated with morbidity and mortality in patients with acute lung injury[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2005，288（3）：L426-L431.