死亡时间（postmortem interval，PMI）推断是法医学领域最具困难和挑战性的问题之一[1]。早期PMI推断最常用的指标依然是直肠温度[2]。既往的晚期PMI推断研究[3-6]主要集中在血液、血清及脑脊液中，目前的研究方向主要集中在玻璃体液，但由于死后的物质变化受外界环境和尸体自身等多种因素影响，至今未有确切的PMI推断方法。

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玻璃体液用于PMI推断研究已有50余年历史，大量学者[7-10]应用新的检测方法检测玻璃体液中各种物质浓度，建立了物质浓度与PMI之间的推导方程，使玻璃体液推断PMI的研究不断深入。随着生化检测技术的发展，各种物质检测方法不断更新，技术逐渐多样化，物质浓度检测的灵敏度不断提高，单次检测所需样本量逐渐减少，使得玻璃体液微量取样成为可能。本文就玻璃体液推断PMI的优势、死后变化的影响因素、取样方法、数据拟合模型进展进行综述，以期为利用玻璃体液进行PMI推断提供新的思路。

1 玻璃体液较其他常见体液的优势

玻璃体液位于眼球后部的玻璃体内，由于玻璃体特殊的解剖位置，与其他组织相对隔离，又受周围眼眶的保护，因此不易受到破坏，使得玻璃体液在死亡早期以及后期均受污染较少，且所含物质的浓度变化较血液、脑脊液、心包积液、滑膜液等其他体液的变化相对缓慢且规律性更强。自20世纪60年代STURNER等[11]首次证实玻璃体液内钾离子浓度与PMI呈正相关性以来，玻璃体液一直是法医病理学用于PMI推断研究和死后化学物质分析的热点。此外，玻璃体液还是动物医学中的研究热点[12]。

心包积液是心外膜的渗出物，含有大量血液和心脏组织中的化学物质[13]，在排除心脏损伤和医疗干预的情况下，心包积液是尸体死亡化学很好的检材之一[14]。KAWAMOTO等[15]认为，心包积液内的钾、镁、钙等离子浓度随PMI延长而变化的趋势与玻璃体液相似，但是由于检测样本量大，物质浓度变化与死亡原因相关性强，因此不适用于PMI的推断。PALMIERE等[16]研究发现，心包积液内肌酐、尿素氮和尿酸与PMI无相关性，此外，取样困难，心包积液中容易混入血液成分，因此也限制了其应用价值。

QUERIDO[17]用火焰光度法检测大鼠死后血清内钠、钾离子浓度及两者比值的变化，证实了大鼠血清内钠、钾离子浓度与PMI高度相关，可用于PMI的推断。随后其证实了大鼠死后血清中氯离子的浓度变化也与PMI相关[3]。DONALDSON等[4]将大鼠、猪和人的血液作为研究对象，检测血液pH值变化及血液内血氨等六种物质的死后变化情况，其pH值和血氨等六种物质浓度随PMI延长而改变，但其变化速率呈多样性。SUN等[18]应用免疫荧光技术检测家兔右心室内血液腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的降解，得到家兔血液ATP的降解与PMI具有较好的相关性。但近期研究[19]证实，死后血液内的一些生化指标稳定性很高，而另一些生化物质却变化巨大，且有的物质变化无规律性。这些研究结果表明，死后血液内的生化物质变化不够稳定，难以用于PMI推断。

在法医学实践中，PMI推断受诸多因素的影响，其中以环境温度的影响最大[25]。KOMURA等[26]首次表明低温会延缓人和家兔眼玻璃体液内钾离子浓度的上升。同时SCHONING等[27]以60只成年的杂交狗为研究对象，证实在4℃下，死后48 h内玻璃体液的肌酐和尿素氮浓度呈缓慢上升趋势，处于稳定状态，但在较高的环境温度下，玻璃体液内的肌酐和尿素氮浓度变化不稳定，无法用于PMI推断。BRAY[28]在研究绵羊和马的玻璃体液时也得到了类似的结果。MCLAUGHLIN等[12]在4℃、20℃、37℃三个温度条件下研究120头牛和120头猪血清和玻璃体液内尿素氮、肌酐以及钠、钾、钙、镁、氯、磷离子的浓度变化，发现血清和玻璃体液内各指标浓度几乎保持稳定，但在低温下及死亡早期更稳定，钾和磷离子的浓度随PMI延长和温度的增加而升高。SCHONING[29]研究发现，狗玻璃体液内钾离子浓度随温度的增加及PMI的延长而增加，钠、氯离子以及尿素氮的浓度在4℃环境下死后48 h内保持稳定，而在20℃、37℃环境下难以稳定。VISHAL[30]研究200例尸体后发现，烧死尸体玻璃体液内钾离子浓度显著高于非烧死尸体。ZILG等[2]研究发现，死者年龄、体质量及死亡原因等对钾离子浓度无影响，而温度对钾离子浓度有一定影响。ROGNUM等[31]在研究人眼玻璃体液内钾离子和次黄嘌呤浓度与温度的关系时发现，随着温度的增加，拟合方程的斜率增加。因此，在进行PMI推断时，应将温度作为重要变量拟合入方程，以提高推断的准确性。

COE[32]认为死后玻璃体液内离子浓度梯度会发生重建，有学者[33-35]认为双眼玻璃体液内的电解质有重大的区别，因此应一次取出全部玻璃体液避免浓度梯度对样本物质的影响。也有学者[36]认为，双眼内玻璃体液的死后变化不一致，应以双眼均值作为检测样本。此外，活体眼科生物化学研究者[37]也认为玻璃体液内各部分物质含量不等。因此，在早期的研究[38]中，一眼内的玻璃体液只能一次全部取出。但是，MULLA等学者[39-41]在检测人双眼玻璃体液电解质浓度后发现，人双眼玻璃体液内离子浓度无明显差异。SIDDAMSETTY等[19]在研究半干旱气候条件下人眼玻璃体液内电解质与PMI的关系时，也证实了双眼玻璃体液内电解质浓度无差异。WANG等[42]在前人研究的基础上尝试应用微量取样法取样，研究证实了双眼玻璃体液钙、钾、钠、氯和磷离子含量无差异，双眼组分变化一致，肯定了微量取样的可行性，此方法充分利用了实验动物和检材，大大减少了实验动物用量，在获得同等数据量的前提下节省实验动物数达90%，此外也减少了取样检测值变异系数，增加了稳定性，同时减少了不同因素（性别、年龄、死因等）的影响，使得实验样本的连续性大大提高。刘茜等[43]应用WANG等建立的微量取样法对家兔双眼进行交替取样，证实了该方法的可行性，同时也证实了双眼玻璃体液物质浓度无差异。

周斌等[9]采用其自主研发的低压离子色谱仪对玻璃体液中钾离子浓度进行检测，结果显示，玻璃体液内钾离子色谱峰与浓度标准曲线的相关系数大于0.99，色谱法精密度良好，符合色谱分析要求，经低压离子色谱仪分析得到的玻璃体液内钾离子浓度精确、可靠。但该方法目前仍未得到广泛的应用。

2 温度对玻璃体液内物质的影响

很多学者都曾以脑脊液为研究对象进行PMI的推断，但研究结果存在很大差异。MASON等[5]研究发现，58例尸体脑脊液内钾离子浓度增加与PMI呈正相关。FRASCHINI等[6，20]在后续的研究中也得到了类似的结论。但SWAIN等[21]在比较玻璃体液和脑脊液内钾、钠离子及葡萄糖浓度推断PMI时发现：钾离子浓度在脑脊液和玻璃体液内均升高，玻璃体液内钾离子浓度推断PMI的方程R2为0.62，而脑脊液内钾离子浓度推断PMI的方程R2仅为0.37；葡萄糖浓度在脑脊液和玻璃体液内随PMI的延长均下降，根据脑脊液内葡萄糖浓度变化推断PMI的方程R2为-0.35，而玻璃体液内葡萄糖浓度变化推断PMI的方程R2为-0.63。因此他们认为，玻璃体液较脑脊液推断PMI更准确，更接近实际PMI，此外，在以脑脊液为实验样本时，同样很难提取到不含血液的脑脊液，且对取样技术的要求很高。

3 玻璃体液的取样方法

党的十八大以来，特别是中央统战工作会议召开和《中国共产党统一战线工作条例（试行）》（下文简称《条例》）颁布以来，基层统战工作的地位、内容、对象和要求发生了很大变化，全国各级党组织掀起了贯彻落实中央统战工作会议精神、《条例》和习近平总书记关于加强和改进统一战线工作的重要思想的高潮。在这种宏观环境下，基层统战工作既得到了发展，但也存在一些问题。

4 玻璃体液的检测及分析技术

4.1 毛细管电泳法

TAGLIARO等[7]认为，毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）法是检测玻璃体液内钾离子浓度可靠、简单、快捷的方法，且可增加检测数据的准确性和重现性。经毛细管电泳法检测钾离子的结果与火焰光度法的结果呈强相关性。此两种方法均没有对样本进行特殊的预处理，并且只需极少量的玻璃体液样本量。毛细管电泳法可用于复杂样本（如死后样本）的检测，与传统的检测方法（如火焰光度法、离子选择法等）相比，毛细管电泳法不仅能用于检测玻璃体液内钾离子浓度，还可以检测血氨以及钠、钡离子等的浓度。BOCAZ-BENEVENTI等[8]也证实毛细管电泳法可用于快速检测细胞外液中的无机离子成分。

4.2 低压离子色谱法

关节滑膜液是研究风湿性疾病的重要成分，仅有少数学者报道乙醇和药物在滑膜液内的代谢[22]，然而其用于死后生化分析研究较少见。MORE等[23]在1985年应用滑膜液内钙、磷离子和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）的浓度变化等探索尸体死亡原因时并未发现任何规律性的变化。MADEA等[24]于2001年首次研究膝关节滑膜液内钾、钠、氯离子及葡萄糖等物质浓度的死后变化，发现滑膜液内只有钾离子和葡萄糖的浓度变化可用于PMI推断，其他物质浓度的变化均与PMI无相关性，且滑膜液与玻璃体液内钾离子浓度变化相当，都与PMI的延长具有高度相关性，因此在因颅脑外伤等无法提取玻璃体液时，可以应用滑膜液作为替代品进行钾离子浓度检测推断PMI。但是由于滑膜液黏度更大，其分析前处理更复杂，取样较玻璃体液困难[24]，因此在目前的PMI推断中仍以玻璃体液为研究重点。

4.3 顺序喷射分析法

儒家注重“合作”的社会规范的执行效果，很大程度上依赖于a和b。如果当事人受儒家文化注重“合作”的理念影响大并能落实到自己的实际行动中(儒家强调“知行合一”)，儒家社会规范在我国上市公司治理中就能有效发挥作用；相反，如果当事人受儒家文化注重“合作”的理念影响小，则儒家社会规范在我国上市公司治理中的作用就很小。这就需要整个社会加强对儒家文化中“诚信”、“合作”等核心价值观的学习和教化，让我国的上市公司参与各方把养成“君子”人格作为自己的毕生追求。

5 数据拟合分析方法

5.1 回归模型

人工神经网络（artificial neural network，ANN）模型是一种计算机化的化学计算分析方法，简称为神经网络或连接模型，是对人脑或自然神经网络若干基本特性的抽象和模拟，其目的在于模拟大脑的某些机理与机制，实现某个方面的功能。ANN模型由大量被称为节点的简单信息处理单元（神经元）组成，每个节点向邻近的其他节点发出抑制或激励信号，整个网络的信息处理通过这些节点之间的相互作用而完成[50]。BOCAZ-BENEVENTI等[8]在研究 61 例 PMI在 3～144h的人眼玻璃体液内钾、氨、钠和钡离子浓度时，尝试应用ANN模型对经毛细管电泳法检测得到的人玻璃体液离子浓度进行拟合。在评价ANN模型时，应用检测浓度值和PMI进行建模，并与传统的统计方法进行了对比。为了确保隐藏层中的最优节点数，ANN模型系统内设定了误差值作为隐藏层中的神经元数量的函数。经探索得出，4个或者5个节点就足以获得低误差值，且进一步增加节点数量并不会再次降低误差值，最终应用ANN模型建立了拟合PMI和玻璃体液内离子浓度的最优化模式。该研究最终得出，应用ANN模型可以使检测数据得到充分的利用，建立了四种离子浓度推断PMI的拟合方程，使PMI的推断得到了质的改变，经模型拟合后，获得了良好的相关关系（R2=0.98），并且使推断误差由15h减少到3h。

5.2 人工神经网络模型

自1963年STURNER[45]首次明确提出玻璃体液内钾离子浓度变化与PMI呈线性正相关以来，众多法医学者[46-47]建立了截距、斜率不同的钾离子浓度推断PMI的线性方程，直至1994年LANGE等[48]得出玻璃体液内钾离子浓度和PMI并非完全线性关系，并应用新的数据分析模型，提出了玻璃体液内钾离子浓度和PMI的一元回归方程、置信区间等，但由于单个离子的离散程度较大，其拟合回归方程的可靠性仍有不确定性。HENSSGE等[49]在LANGE等研究的基础上，应用多元线性回归模型拟合玻璃体液内钾和钠离子浓度、钾离子浓度和尿素氮、钾离子浓度和葡萄糖等的线性方程，指出多元线性回归方程可增加PMI推断的精度。刘茜等[43]在应用玻璃体液内钾和镁离子浓度进行多元回归推断PMI时指出，在实际应用中，不仅要考虑评价方程的R2，还需要结合其在推断PMI时产生的预测偏离时间，应用多指标建立多元回归方程进行PMI推断是提高PMI推断准确性的可行性方法，尤其是晚期的PMI推断。

顺序喷射分析（sequential injection analysis，SIA）法是基于获得大量样本的自动化快速分析，并在后期可以快速、准确查看检测结果的原理基础上而设立的自动化技术[44]。这种自动化技术极具吸引力，因为其成本低、快速、可靠且通用，与常规方法相比，其样品预处理简单，仅需要过滤和稀释。其计算机控制的性质保证了操作的灵活性并能建立不同的分析策略而且没有重复。此外，该系统的核心具有多位选择性，允许所有类型的设备或解决方案的聚类，这使得系统内各项操作成为可能。重要的是，SIA法允许执行系统内所有操作，不会出现与操作者相关的错误，并具有更快的测定速度，如在测定黄嘌呤时通常每小时可比高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法多约3次。此外，由于SIA法具有不连续的性质，因而提供了独立开发不同测定的可能性，因此适合于多重测定。PASSOS等[44]尝试将开发的SIA系统首次应用于检测玻璃体液内钾离子和次黄嘌呤含量，为了评估SIA系统获得结果的准确性，所有检测样本也用火焰光度法进行了钾离子检测，该研究证实，SIA系统提供了可靠的结果，在今后的法医学研究中可以作为一个较好的替代检测法。

5.3 插值函数模型

插值函数（interpolation function）是数学领域的一种数值分析方法，即在离散数据的基础上补插连续函数，使各条连续曲线通过全部给定的离散数据点。插值分析已经应用于临床医学，SUN等[18]建立了应用插值函数拟合不同温度条件下家兔右心室血液ATP水平与PMI的相关性曲线，验证了插值函数应用于PMI推断的可行性，并证实了插值函数拟合较SPSS分析更接近实际情况。姜竹青等[51]应用插值函数在外界环境温度变化条件下，对小鼠肝细胞18S rRNA降解与PMI的关系进行拟合时，也得到了较好的结果。杨明真等[52]应用该模型，得出了在5～35℃的环境温度区间内，家兔眼玻璃体液中钾离子浓度变化与PMI符合三元五次方程分布，证实了利用插值函数拟合的方法可将环境温度作为参数，实现在环境温度变化条件下推断PMI。

5.4 混合效应模型

混合效应模型（mixed-effect model）即所拟合的模型中既包含固定效应又包含随机效应，特别是个体数据结构的选择将对各因素的评价产生直接影响，固定效应类似于标准回归系数，直接估计得到，而随机效应则是从其方差和协方差估计值中总结而来。此模型可用于重复测量数据，即对同一个观察对象在不同时间点上进行的多次测量，由于测量资料是对同一受试对象某一观察指标进行的重复观察所得的数据，同一受试者的观察数据间可能存在相关性，一些传统的统计学方法可能无法充分揭示这一内在特点。混合效应模型既考虑了观察对象在不同时间点的内在联系，又考虑了观察值间的内部相关性，结论更为可靠。在应用动物实验推断PMI时，得到的检测数据即是重复测量资料，杨明真等[53]在检测不同温度下家兔尸体玻璃体液内钾、镁离子浓度随PMI变化的规律时，首次应用该模型对所得数据进行拟合，得出在5～35℃环境温度区间内，该模型可以实现利用环境温度和玻璃体液内离子浓度双参数推断PMI，并验证了该模型可用于PMI的推断，且在死后40h内推断偏离时间在10h内，具有良好的吻合性。在后期的研究中，可尝试应用混合效应模型对所得数据进行拟合，扩大数据拟合模型的范围，提高PMI推断的准确性。

张淑芹等[13]报道不典型麻疹患者咽拭子、尿残渣MV抗原检出率分别为82.4%和94.1%，而有研究表明应用RT-PCR对麻疹患儿粪便样本进行MV核酸检测，发现阳性率达97.4%，高于咽拭子检测的病毒核酸阳性率[14]。粪便样本具有采集方法方便、患儿依从性好、不易受人为因素影响等优点，因此在本研究中也采用粪便样本分离MV核酸，且阳性率较高。

伟翔愤怒地抬起头，看着我，说：“你能不能不这么俗？”我的火腾地窜上了头顶：“李伟翔，你终于嫌弃我了，我就是俗，是你把我变得这么俗的。我从前也喝着咖啡聊泰戈尔的！”

6 展 望

在利用尸体化学进行PMI推断时，玻璃体液是较稳定、可靠的样本。后期研究中可考虑联合应用玻璃体液和其他体液进行PMI推断研究。应用玻璃体液推断PMI时，使用微量取样法可减少实验动物用量，也能充分利用人体检材。此外，应在PMI推断方程中考虑更多的影响因素，加强与实际情况的吻合度，尝试不同的数据拟合方法，提高PMI推断的准确性。

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