骨肉瘤是发生于青少年的常见骨原发性高度恶性肿瘤，自20世纪70年代采用新辅助化疗后，患者的5年生存率从10%～20%提高到60%～70%，近年虽尝试新的化疗药物或增大化疗剂量，但患者生存率仍未进一步提高，肿瘤细胞对化疗药物产生耐药是导致临床治疗效果停滞不前的重要原因之一[1]。

骨肉瘤化疗耐药的机制目前尚不清楚，研究发现DNA损伤修复与化疗耐药密切相关[2]。化疗药物导致DNA双链断裂，随后激活DNA损伤修复系统，Rad50是同源重组修复MRN(Mre11-Rad50-NBS1)复合体中的关键蛋白。Flores-Pérez等[3]报道Rad50在肿瘤组织中高表达，且参与肿瘤细胞对铂类药物化疗耐药。新近发现FoxM1通过上调DNA损伤修复基因参与化疗耐药[4]。本实验组前期研究[5]在细胞水平发现FoxM1通过上调DNA损伤修复基因参与骨肉瘤顺铂化疗耐药，本文拟进一步探讨FoxM1和DNA修复基因Rad50在骨肉瘤细胞、临床骨肉瘤中表达及其与临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 收集安徽医科大学第一附属医院病理科2008年1月～2012年12月存档的84例石蜡骨肉瘤标本，所有病例均有完整的临床、影像和随访资料，随访时间超过5年。本次纳入分析的所有病例均为高级别骨肉瘤，不含髓内中央型低级别骨肉瘤，并经两位经验丰富的骨肿瘤亚专科病理医师复查。其中男性38例，女性46例，年龄9～65岁,中位年龄17岁。组织学分型包括骨母细胞亚型32例，软骨母细胞亚型27例，成纤维细胞型19例，其它类型6例。临床分期按Enneking临床分期法(1986年修订)。标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，常规切片，分别行HE及免疫组化染色。

1.2 试剂 骨肉瘤细胞系MG-63、HOS-MNNG购自中科院上海细胞库；qRT-PCR试剂盒购自Vazyme公司；FoxM1、Rad50抗体及HRP标记的二抗均购自Abcam公司；β-actin抗体购于Abmart公司；免疫组化MaxVision试剂盒均购自北京中杉金桥公司。

“多亏了党和国家的好政策和投资促进局的大力帮扶，不仅给我们发种子和化肥，蔬菜销路不用愁，孩子上大学还享受到了资助，政府帮忙一把，自己努力一把，大家一起奔小康！”普万雄信心满满地说道。

化疗是推动骨肉瘤治疗进入新时期的主要动力，逆转化疗耐药是增强骨肉瘤疗效的重要途径，与提高骨肉瘤患者的生存和预后密切相关。本组结果显示FoxM1与Rad50表达可能作为骨肉瘤临床评价生物学行为及判断预后的指标之一，抑制FoxM1及Rad50有望成为逆转骨肉瘤化疗耐药的潜在靶点。但FoxM1与Rad50是否共同参与骨肉瘤化疗耐药及其具体调控机制仍需后续分子生物学研究证实。

我国的社区教育始于20世纪80年代。近年来，我国社区教育探索出了具有中国特色的社区教育发展方式和路径，形成了东部沿海发达地区广泛开展、中西部地区逐步推进的发展格局［5］。但社区教育仍处于发展的初级阶段，还不能满足社区治理和民生保障的需要，社区教育的制度体系不健全、各地发展不平衡等问题亟待解决［6］。这在很大程度上影响了社区教育对非物质文化遗产的传承和创新。

1.4 结果判定 免疫组化结果由两位病理医师采用双盲法进行半定量评估，FoxM1和Rad50阳性染色定位于细胞核，着色强度评分判定参考成慧等[6]的方法：无阳性着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。按阳性细胞所占肿瘤细胞总数的百分比评分：阳性细胞数≤5%为0分，5%～33%为1分，34%～67%为2分，68%～100%为3分。将两项结果相加：<2分为低表达，≥2分为高表达。

1.5 qRT-PCR检测 Trizol法提取总RNA，具体操作步骤见Trizol总RNA抽提试剂盒说明书；逆转录采用SYBR Green及qRT-PCR步骤见试剂盒说明书。FoxM1上游引物：5′-TGCAGCTAGGGATGTGAA TCTTC-3′，下游引物：5′-GGAGCCCAGTCCATCAGA ACT-3′；Rad50上游引物：5′-TAAGTGTGCAGAAAT TGACCGAG-3′，下游引物：5′-GACGTACCTGCCGA AGTGTT-3′；18S上游引物：5′-CGGCGACGACCCATT CGAAC-3′，下游引物：5′-GAATCGAACCCTGATTCC CCGTC-3′。以18S rRNA为内参。

1.6 Western blot法检测 收集细胞及蛋白提取后，采用BCA法蛋白定量，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，转膜后5%脱脂牛奶封闭1 h以上，然后加入一抗FoxM1(1 ∶1 000稀释)、Rad50(1 ∶800稀释)或β-actin(1 ∶1 000稀释)孵育过夜，加入HRP标记的二抗(1 ∶10 000稀释)孵育2 h，显影。

植被的生长离不开水资源的有效补给，因此，对于各种植被的种植过程需要定时给予水分的补充，特别是对于新移植的植被或树木。对于不同生长环境、不同类型的植被来说，其浇水量及浇水次数都有一定的限制。例如成活生长3年以上的乔灌木，其浇水的次数无需很多，需要结合当地环境因素进行适时适量的水量补给。同时，要针对植被的生长特性，制定合理的浇水方案，增强风景园林景观的养护效果。

[9] Shibata A, Moiani D, Arvai A S, et al. DNA double-strand break repair pathway choice is directed by distinct MRE11 nuclease activities[J]. Mol Cell, 2014,53(1):7-18.

2 结果

2.1 FoxM1、Rad50在骨肉瘤耐药细胞中表达 本课题组前期建立的2 μg/mL顺铂浓度稳定生长和传代的骨肉瘤耐药细胞系MG-63/R与HOS-MNNG/R，耐药指数分别为30.52和37.87，根据Snow等[7]研究认为耐药指数>15为高度耐药。在耐药细胞系和亲本细胞中运用qRT-PCR和Western blot法检测FoxM1和Rad50的表达，结果发现在骨肉瘤耐药细胞系MG-63/R和HOS-MNNG/R中的FoxM1与Rad50 mRNA水平较亲本细胞明显升高(图1A)，差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示：与亲本细胞MG-63和HOS-MNNG相比，FoxM1和Rad50蛋白表达水平在耐药细胞MG-63/R和HOS-MNNG/R中显著增加(图1B)，差异有统计学意义(P<0.05)。

  

图1 A．应用qRT-PCR法检测骨肉瘤耐药细胞MG63/R、HOS-MNNG/R中FoxM1和Rad50 mRNA表达水平较亲本细胞MG63、HOS-MNNG明显升高；B.应用Western blot法检测骨肉瘤耐药细胞MG63/R、HOS-MNNG/R中FoxM1和Rad50蛋白表达水平较亲本细胞MG63、HOS-MNNG明显升高

2.2 FoxM1表达与骨肉瘤临床病理特征的关系 免疫组化结果显示：84例骨肉瘤标本中，FoxM1蛋白高表达28例，低表达56例，高阳性率为33.3%。FoxM1表达水平与骨肉瘤Enneking分期明显相关(P<0.01)，Ⅲ期中FoxM1高阳性率明显高于Ⅰ+Ⅱ期；与患者性别、年龄、肿瘤大小、部位及组织学类型均无关(P>0.05，表1)。Kaplan-Meier生存曲线显示：FoxM1高表达患者与低表达患者的5年生存率分别为12.7%和72.0%，FoxM1高表达患者生存率较低，预后较差，差异有统计学意义(P<0.05，图2A)。

早先研究发现FoxM1是调控细胞周期重要的转录因子，新近研究发现FoxM1还参与DNA损伤修复，诱导化疗耐药的产生[4]。文献报道FoxM1通过上调MRN复合物诱导乳腺癌细胞对表柔比星化疗耐药[12]。本实验组前期研究结果也发现，在骨肉瘤耐药细胞中抑制FoxM1表达能降低Rad51的表达增敏耐药骨肉瘤细胞对顺铂的敏感性[5]。但骨肉瘤中FoxM1与Rad50的表达与临床病理特征和预后是否存在相关性，目前尚未见相关报道。

1992年，创始人Francois Lesage成立刺绣学校，三千六百多人曾在Lesage开办的刺绣艺术学校学习。Lesage现有约50名刺绣师。

3 讨论

 

表1 FoxM1、Rad50表达与骨肉瘤临床病理特征的关系

  

临床病理参数nFoxM1低表达高表达χ2值P值Rad50低表达高表达χ2值P值性别 男3823151．1770．27827112．4620．117 女4633132521年龄(岁) <406643230．3180．57340260．2200．639 ≥4018135126部位 股骨3622141．0880．78023131．1040．776 胫骨302191713 肱骨139485 其它54141肿瘤直径(cm) <53726110．3860．53424130．2460．620 ≥54730172819组织学类型 骨母细胞型3221110．0420．99820122．4370．487 软骨母细胞型271891710 成纤维细胞型19136136 其它64224Enneking分期 Ⅰ+Ⅱ(A、B)393277．7540．0053096．9630．008 Ⅲ(A、B)4524212223

  

图2 A.Kaplan-Meier生存曲线显示：FoxM1高表达患者总生存率低于FoxM1低表达患者；B.Kaplan-Meier生存曲线显示：Rad50高表达患者总生存率低于Rad50低表达患者

 

图3 A.FoxM1在细胞核中呈高表达，MaxVision法；B.Rad50在细胞核中呈高表达，MaxVision法；C.HE染色显示：新辅助化疗后肿瘤坏死率<90%；D.FoxM1在细胞核中呈低表达，MaxVision法；E.Rad50在细胞核中呈低表达，MaxVision法；F.HE染色显示：新辅助化疗后肿瘤坏死率≥90%

骨肉瘤是常见的骨原发性高度恶性肿瘤，好发于青少年，易发生肺转移。目前治疗方法包括术前新辅助化疗和瘤体切除在内的综合治疗。新辅助化疗在骨肉瘤治疗中具有关键作用，标准的三联化疗药物包括顺铂、阿霉素和甲氨蝶呤[1]。然而近30年骨肉瘤患者的治疗效果及生存率无明显改善，化疗耐药成为制约骨肉瘤疗效进展的重要瓶颈[1]。

顺铂是一种细胞毒性药物，进入肿瘤细胞后能与DNA结合，形成链内、链间加合物，破坏DNA正常结构，进而抑制DNA的复制和转录，导致基因组不稳定和细胞死亡[8]。DNA损伤应答反应(DNA-damage response, DDR)的增强促进肿瘤细胞对顺铂产生拮抗作用，降低化疗效果[9]。MRN复合物在DDR过程中发挥重要作用，MRN复合物由MRE11、Rad50和NBS1蛋白构成，其中Rad50分子是MRN复合物的重要组成部分，参与起始修复、引发信号转导和协助修复等DNA损伤修复应答的多个环节[10]。近年研究证实，Rad50高表达与化疗耐药和患者预后不良相关[11]。

2.3 Rad50表达与骨肉瘤临床病理特征的关系 Rad50在84例骨肉瘤标本中的高阳性率为38.1%(高表达32例、低表达52例)。Rad50在Enneking Ⅲ期患者中的高阳性率明显高于Ⅰ+Ⅱ期，差异有统计学意义(P<0.01)；而与患者性别、年龄、肿瘤大小、部位及组织学类型均无关(P>0.05，表1)。高表达患者5年生存率为19.7%，低表达患者5年生存率为70.3%，差异有统计学意义(P<0.05，图2B)。

本组发现骨肉瘤顺铂耐药细胞系MG63/R和HOS-MNNG/R中的FoxM1与Rad50 mRNA和蛋白水平较亲本细胞明显升高，提示FoxM1和Rad50可能参与骨肉瘤细胞对顺铂化疗耐药。免疫组化结果发现，FoxM1与Rad50蛋白高表达组患者生存率较低、临床分期较高与低表达组患者相比差异有显著性。本组发现FoxM1与Rad50高表达组患者对新辅助化疗反应差，肿瘤坏死率低。肿瘤坏死率是目前评价骨肉瘤化疗敏感程度、总生存率的重要指标。肿瘤坏死率分为反应好和反应差两个级别，反应好组远期转移率和生存时间优于反应差组。其中，肿瘤坏死率≥90%为反应好，化疗后无存活肿瘤细胞或仅见散在的存活肿瘤细胞，大部分区域坏死；肿瘤坏死率<90%为反应差，化疗后无坏死肿瘤细胞或可见大片存活的肿瘤细胞，坏死区域小[13]。由此，作者推测FoxM1与Rad50高表达可能通过参与顺铂化疗耐药，导致肿瘤坏死率下降，降低化疗效果。Hou等[14]也认为FoxM1可以通过调节与细胞周期和DNA修复有关的靶基因参与紫杉醇化疗耐药，抑制FoxM1增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，与本实验结果一致。Flores-Pérez等[3]的研究结果也表明在乳腺癌细胞中，通过RNA干扰沉默Rad50表达可显著增强耐药细胞顺铂化疗效果。

本组发现FoxM1和Rad50在84例骨肉瘤中的阳性率呈正相关，结合本组前期研究结果[5]发现在骨肉瘤耐药细胞中抑制FoxM1表达能够降低Rad51表达，作者推测FoxM1可能通过正向调控Rad50的表达参与骨肉瘤细胞对顺铂化疗耐药。Kwok等[15]研究也发现FoxM1可以通过上调DNA损伤修复基因BRCA2和XRCC1的表达增强乳腺癌对顺铂的化疗耐药。另外，在对卵巢癌的研究中发现，FoxM1高表达可诱导Rad51等DNA损伤修复基因的表达增高，参与肿瘤化疗耐药[16]。

教师和学生分别是课堂环境中的两个动态因素，构成了英语教学学习的内因和外因。英语学习的有效性一般取决于学习者本身，为了让学生按建构主义的主张来学习以实现知识合作建构过程。教师应引导学生积极参与到课堂教学中，通过师生之间的互动使学生构建自身的知识体系，以提高和发展能力。教师A对学生的课堂参与度反思的比较多，希望通过自己的努力激发学生对英语的学习热情，积极参与到自己的课堂中来，学到知识。

例如，在学习《晏子使楚》这篇课文的时候，对班级中的优等生、中等生以及学困生，可以分别给予他们三个不同层次的问题：第一个问题是在这篇文章的末尾，楚王为什么要说“寡人反取病焉”，请学生们根据本篇文章的具体内容详细说明楚王自取其辱的真正原因是什么。第二个问题是根据这篇文章的具体内容详细分析本篇文章中的晏子和楚王，说说他们都是什么样的人。第三个问题是运用简明扼要的语言对文章的所描述的事情进行概括。采取这样的措施能让班级中的所有学生都参与到语文学习中，充分调动学生的积极性，以这样的方式可以有效避免班级中的学困生在学习过程中被边缘化。

2.4 FoxM1、Rad50在骨肉瘤组织中表达的相关性 FoxM1与Rad50在13例骨肉瘤组织中均呈高表达(图3A、B)，且患者对新辅助化疗反应差，化疗后肿瘤坏死率<90%(图3C)；FoxM1与Rad50在37例骨肉瘤组织中均呈低表达(图3D、E)，且该组患者对新辅助化疗反应好，化疗后肿瘤坏死率>90%(图3F)；FoxM1和Rad50在骨肉瘤组织中的表达经Spearman秩和检验分析，结果显示两者间存在显著正相关性(rs=0.390，P<0.01)。

1.3 免疫组化法 为防止骨肉瘤组织脱片，挑选免疫组化蜡块时应尽量避免选取脱钙后组织。免疫组化染色采用MaxVision法，具体操作按试剂盒说明书进行。柠檬酸盐(pH 6.0)微波炉10 min煮沸法进行抗原修复。一抗均用PBS稀释，FoxM1抗体稀释浓度为1 ∶200，Rad50抗体稀释浓度为1 ∶400。用PBS代替一抗作阴性对照。FoxM1和Rad50免疫组化阳性染色主要位于细胞核，为粗细不一的黄至棕黄色颗粒。

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《中国英语能力等级量表》科学性和适切性研究 …………………………………………………… 蔡基刚（5.39）

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1.7 统计学分析 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，对定量资料采用表示，用t检验；计数资料组间结果比较采用χ2检验；生存率分析采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线并进行Log-rank检验；相关表达分析采用Spearman秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

抽取患者空腹血3-5ml,在采集完成后及时将其置于生化试管中,并第一时间完成检验。此次检验中应用的全自动生化分析仪为东芝TB-120,并使用传统离心机对患者及健康者血液样本作离心处理,取得上层血清。血清胆红素水平运用常规钒酸盐氧化法进行测定,并运用尿酸酶法对尿酸进行检验。

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对于近期外界的一些质疑和误解，荣鹰指出，领保工作面临很多现实条件的制约，需要与当地政府沟通协调，按照国际惯例或有关协议进行处理，“但无论有多少困难，使馆人员一定是尽全力去协助中国公民的”。

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网络课程设计与制作要以网络技术为依托，以构建网络环境下大学生自主学习的乐园为目标，将优化体系、提高质量、增强吸引力和提高网络平台的便捷性并重，以服务本专科教学、服务复合型人才的培养、服务经济社会发展为使命，构建优质的网络课程内容与学习资源，为全民终身教育提供保障。

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